一株內(nèi)生真菌及其生物轉(zhuǎn)化甘草酸為甘草次苷的方法【專利摘要】本發(fā)明涉及一株內(nèi)生真菌及其生物轉(zhuǎn)化甘草酸為甘草次苷的方法，該菌命名為DX-SES3，鑒定為Microsphaeropsisarundinis，并已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCM2014177。該菌能在甘草酸的誘導(dǎo)下產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸苷酶，進(jìn)而催化甘草酸生產(chǎn)GAMG；所產(chǎn)生的GAMG富聚在菌體的表面，75%的乙醇沖洗菌體，減壓濃縮噴霧干燥后獲得GAMG粗制品，HPLC檢測純度為89.4%。本發(fā)明采用生物轉(zhuǎn)化方法，不僅甘草酸的轉(zhuǎn)化率高，綠色環(huán)保無污染，而且GAMG富聚于菌體表面，產(chǎn)物分離純化簡單易行。【專利說明】一株內(nèi)生真菌及其生物轉(zhuǎn)化甘草酸為甘草次苷的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及生物轉(zhuǎn)化【
技術(shù)領(lǐng)域：
】及產(chǎn)物分離工藝，主要涉及一株能將甘草酸單一、定向的轉(zhuǎn)化為甘草次苷(GAMG)的東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌及GAMG分離純化制備方法。技術(shù)背景[0002]甘草酸(GL)是甘草中的主要活性成分之一，是甘草中含量最高的三萜類化合物，結(jié)構(gòu)如圖1所示，是由五環(huán)三萜皂苷通過糖苷鍵連接兩個葡萄糖醛酸構(gòu)成的?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甘草酸具有抗炎癥、抗病毒、抗過敏、抗腫瘤等藥理作用，還是一種高甜度、低熱量的新型甜味劑，具有一定的應(yīng)用價值。[0003]甘草酸經(jīng)β-葡萄糖醛酸苷酶水解去除其末端的一個葡萄糖醛酸基就生成GAMG(如圖1)，是甘草酸的一個重要的衍生物。甘草次苷又叫單葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)，其應(yīng)用價值遠(yuǎn)大于甘草酸。首先，在食品中應(yīng)用方面，GAMC的甜度約為蔗糖甜度的941倍，是甘草酸甜度的5倍多，GAMG不僅有較強(qiáng)的持續(xù)性甜味，是一種高甜度、低熱量的新型甜味劑，而且可有效減少因聞熱量甜味劑的攝入引發(fā)的肥胖、糖尿病、聞血脂癥、頻齒等疾?。黄浯?，在藥物方面的應(yīng)用，GAMG和甘草酸具有相類似的藥理作用，但甘草次苷中等極性，在體內(nèi)溶解度較好的和較易跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，比甘草酸生物利用度更好，其生物利用度優(yōu)于甘草酸類藥物及甘草次酸類藥物，具有顯著的新藥物開發(fā)價值，如在對TPA誘導(dǎo)的Epstein-Barr病毒早期抗原形成的抑制率顯示，GAMG的抑制率達(dá)到了100%，而甘草酸的抑制率只有84.4%，許多研究表明了抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥等方面有良好的功效，并證實(shí)其多種的藥理活性不亞于甘草酸，最重要的一點(diǎn)是甘草次苷比甘草酸更安全，甘草次苷的LD50為5000mg/kg,而甘草酸的LD50為805mg/kg;最后，GAMG在化妝品中也有重要的應(yīng)用，GAMG可使油性香水或荷爾蒙增溶，可用于透明化妝品中，不會產(chǎn)生泡沫，也可用于面霜或乳液中，配制成穩(wěn)定的水包油乳液等。因此生產(chǎn)和開發(fā)GAMG具有很重要的應(yīng)用價值和現(xiàn)實(shí)意義。[0004]GAMG的獲取途徑比較少，主要途徑有以下幾條:一是化學(xué)合成法合成GAMG，Brieskorn等和Mizutani等首次合成了GAMG,但合成路線長,收率很低。二是傳統(tǒng)的化學(xué)水解法，通過水解去掉甘草酸的葡萄糖醛酸基生成甘草次苷，但此法對甘草酸的兩個糖苷鍵選擇性低，不能定向水解生成甘草次苷，副產(chǎn)物多，得率較低，同時存在高耗能，高污染的缺點(diǎn)。三是利用微生物所產(chǎn)生的β-D-葡萄糖醛酸酶水解甘草酸而制備得到的，這也是目前GAMG的主要獲得途徑，而其β-D-葡萄糖醛酸酶用量過大，來源不方便也不經(jīng)濟(jì)，并且產(chǎn)物較難分離純化。此外，根據(jù)歐盟和美國的立法，通過化學(xué)方法獲得的產(chǎn)品不是天然物質(zhì)，應(yīng)用于食品領(lǐng)域受到限制，而利用酶法或微生物法(即生物轉(zhuǎn)化法)得到的物質(zhì)，被認(rèn)為是天然物質(zhì)。生物轉(zhuǎn)化是指利用微生物、動植物和培養(yǎng)體系或其產(chǎn)生的酶對外源化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的生物化學(xué)反應(yīng)過程，其本質(zhì)是利用生物體系產(chǎn)生的酶對外源化合物進(jìn)行酶催化反應(yīng)。利用生物轉(zhuǎn)化甘草酸生成GAMG已有報道過，其不僅具有專一性高、效率高的優(yōu)點(diǎn)，而且方法簡單、便于分離，是今后獲得GAMG的理想途徑。[0005]本發(fā)明人從國家二級保護(hù)植物禾本科植物東鄉(xiāng)野生稻健康的組織中分離并篩選到能將甘草酸單一定向的轉(zhuǎn)化為GAMG的內(nèi)生真菌-菌株DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis).該菌已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCM2014177。該菌能在甘草酸的誘導(dǎo)下，能將甘草酸定向轉(zhuǎn)化為GAMG，且轉(zhuǎn)化率較高，特別指出的是，合成的GAMG富積在菌球的表面，極大的利于后續(xù)GAMG的分離純化工作，這為利用該菌株生物轉(zhuǎn)化生成制備GAMG提供了新的研究思路?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明的目的是提供一株具有定向轉(zhuǎn)化甘草酸為GAMG的東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis)。本發(fā)明不僅克服了現(xiàn)有工藝技術(shù)中催化定向性差，污染環(huán)境，高耗能，轉(zhuǎn)化率低等不足的缺點(diǎn)，而且還避免了GAMG分離純化的復(fù)雜工序。[0007]本發(fā)明中轉(zhuǎn)化甘草酸為GAMG的內(nèi)生真菌菌株，命名為DX-SES3，分類為小球殼孢雇麗Microsphaeropsisarundinis,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏時間為2014年5月3日，保藏號為CCTCCM2014177。[0008]本發(fā)明所述的東鄉(xiāng)內(nèi)生真菌菌株DX-SES3的形態(tài)特征為:在PDA上28°C培養(yǎng)5_7d，5天菌落直徑為20mm,7天菌落直徑為30-35mm,7天菌落直徑無變化；質(zhì)地絮狀，中部突起，表面灰白色，中間色深，邊緣色淺，老后顏色加深，無滲透液，無可溶性色素，菌落反面為黑色；菌絲細(xì)長彎曲，呈黑色或灰黑色；分身孢子較少，為蛹蟲狀(如圖2)。[0009]本發(fā)明所述的東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis)基因登錄號為KC871028。[0010]本發(fā)明所述的東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis)錢化甘草酸定向生成甘草次苷包括以下步驟:步驟一、將東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis),接種到PDA斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化72~84小時，并制作孢子懸浮液，然后接種至種子培養(yǎng)基中，28±1°C，150~300r/min，搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期。[0011]步驟二、按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%~30%的接種量把上述對數(shù)生長期的種子液接種至含甘草酸的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)生甘草次苷至含量基本恒定。[0012]步驟三、沖洗菌球表面的GAMG，并分離純化GAMG。[0013]優(yōu)選的是，所述的DX-SES3(Microsphaeropsi轉(zhuǎn)化甘草酸定向生成GAMG，步驟一中種子培養(yǎng)基的組成為:每升培養(yǎng)基中含葡萄糖10~40g，甘草酸(或甘草酸銨鹽)0.1~Ig,KH2PO4LO~3.0g,NH4NO32.0~5.0g,NaCl0.3~0.8g，酵母粉0.05~0.3g,MgSO40.1~0.5g,CaCl20.01~0.5g,FeSO40.014g,ZnSO4.7Η202.9mg,MnCl2.4H202.0mg,CuSO4.5H200.25mg,CoCl2.6H200.24mg,Na2MoO4.2H200.24mg,H3BO30.03mg,其余為純水，調(diào)pH為5.0~7.0。[0014]優(yōu)選的是，所述的DX-SES3(Microsphaeropsit/iflis)轉(zhuǎn)化甘草酸定向生成GAMG，在步驟二中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成為:每升培養(yǎng)基中含甘草酸(或甘草酸銨鹽)2~30g，KH2PO41.0~3.0g,NH4NO32.0~4.0g,NaCl0.3~0.8g，酵母粉0.05~0.1g,MgSO40.1~0.5g,CaCl20.01~0.5g,FeSO40.014g，ZnSO4.7H202.9mg,MnCl2.4H202.0mg,CuSO4.5H200.25mg,CoCl2.6H200.24mg,Na2MoO4.2H200.24mg,H3BO30.03mg，其余為純水，調(diào)pH為3.5~9.0。其中甘草酸(或甘草酸銨鹽)是菌體產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶的誘導(dǎo)劑。[0015]優(yōu)選的是，所述的DX-SES3(Microsphaeropsi轉(zhuǎn)化甘草酸定向生成GAMG，在步驟二中培養(yǎng)條件為:28°C~60°C，轉(zhuǎn)速150~300r/min,。[0016]優(yōu)選的是，所述的DX-SES3(Microsphaeropsi轉(zhuǎn)化甘草酸定向生成GAMG,在步驟三中甘草次苷的分離純化包含以下步驟:布氏漏斗抽濾或六層紗布過濾，收集菌體，用75%的乙醇沖洗菌體3-5次，收集乙醇溶液，后減壓濃縮，再噴霧干燥，獲得純度較高的GAMG粗成品。[0017]最后本發(fā)明采用高效液相色譜及LC-MS進(jìn)一步檢測GAMG，確認(rèn)甘草酸轉(zhuǎn)化率、甘草次苷的純度和得率?！緦＠綀D】【附圖說明】[0018]圖1為本發(fā)明所述東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis)的菌落形態(tài)及子囊形態(tài)，圖中，A:PDA菌落形態(tài)；B:CA菌落形態(tài)；C:蛹蟲狀孢子囊(顯微鏡下40X)；圖2甘草酸被β-葡萄糖醛酸苷酶水解生成GAMG；圖3為本發(fā)明所述東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis)錢化甘草酸產(chǎn)物的HPLC檢測；圖4內(nèi)生真菌DX-SES3(Microsphaeropsi轉(zhuǎn)化甘草酸產(chǎn)物的LC-MS檢測。[0019]具體實(shí)施方案以下結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明實(shí)施例1:本發(fā)明中東鄉(xiāng)野生稻菌株DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis)的分離(I)采集健康的東鄉(xiāng)野生稻植物樣本，帶回實(shí)驗12h內(nèi)處理。[0020](2)選野生稻材料無病癥長勢良好的植株，在自來水下沖洗l_2h，去除枯萎發(fā)黃的枝葉根須，洗凈后，選取健康的根、莖和葉，并將根、莖、葉剪成3cm的小段若干。[0021](3)然后置于新配制的l_2%NaC10溶液中，莖和葉浸泡5min，根處理4min，接著用新配制的2.5%的Na2S2O3浸泡10min,無菌水清洗3次，然后用新配制的75%的乙醇浸泡Imin，無菌水清洗3次。[0022](4)將上述處理好的莖用滅菌過的剪刀將兩頭剪掉，再將去掉兩頭的莖縱剖，一分為二，再剪成0.1X0.5cm的小塊。將葉子的邊緣用滅過菌的剪刀剪去，把剪去了邊緣的葉片也剪成約0.2X0.5cm的小塊，處理后的植物組織小塊定殖到含50mg.I/1氯霉素的PDA、MEA、CA培養(yǎng)基上，置于28°C培養(yǎng)。為了檢查表面滅菌效果，設(shè)對照進(jìn)行滅菌效果的檢驗，用移液槍吸取200μL最后一次清洗的無菌水，均勻的涂布在平板培養(yǎng)基上，作為對照。[0023](5)每日定時觀察內(nèi)生真菌的長出情況，將切口處新長出的真菌挑取接到PDA培養(yǎng)基上，純化培養(yǎng)直至獲得純菌株。[0024]實(shí)施例2:本發(fā)明篩選出定向轉(zhuǎn)化甘草酸生成GAMG的東鄉(xiāng)野生稻菌株DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis)。[0025](I)平板初篩:將上述分離到的東鄉(xiāng)野生稻的內(nèi)生真菌活化，接種于甘草酸作為唯一碳源的固體篩選培養(yǎng)基中，對照組用葡萄糖代替甘草酸作為唯一碳源。28°C，培養(yǎng)7d，篩選出能生生長良好的菌株。[0026]所述篩選培養(yǎng)基為；每升培養(yǎng)基中含甘草酸3.0g，KH2PO42.2g，NH4NO33.0g,NaCl0.5g，酵母粉0.05g,MgSO40.12g，CaCl20.014g，F(xiàn)eSO40.014g，ZnSO4.7H202.9mg,MnCl2.4H202.0mg,CuSO4.5H200.25mg,CoCl2.6H200.24mg,Na2MoO4.2H200.24mg,H3BO30.03mg，瓊脂粉20g(液體培養(yǎng)基不加)，其余為純水，pH6.0。[0027](2)搖瓶復(fù)篩:將上述平板初篩出來的菌株接種到種子培養(yǎng)基(用20g/L的葡萄糖替換篩選培養(yǎng)基中的3.0g/L的甘草酸)中28°C、150rpm培養(yǎng)2d，然后按20%的接種量轉(zhuǎn)接至甘草酸為唯一碳源的液體篩選培養(yǎng)基中，并設(shè)兩個對照:一是液體篩選培養(yǎng)基中不接入菌體，以檢測甘草酸是否在培養(yǎng)基中分解；二是將菌株轉(zhuǎn)接到用葡萄糖代替甘草酸作為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基中，28°C、150rpm搖床培養(yǎng)4d，收集發(fā)酵液，用TLC、HPLC和LC-MS檢測轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物。[0028]實(shí)驗結(jié)果表明:東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis)能定向轉(zhuǎn)化為甘草次苷(如圖3、圖4)，甘草酸轉(zhuǎn)化率((起始GL摩爾濃度-轉(zhuǎn)化后GL摩爾濃度)/起始GL摩爾濃度X100%)為72.4%，GAMG產(chǎn)率(轉(zhuǎn)化后GAMG摩爾濃度/起始GL摩爾濃度X100%)為67.3%ο[0029]實(shí)施例3:東鄉(xiāng)野生稻菌株DX-SES3(Microsphaeropsi轉(zhuǎn)化甘草酸生成GAMG將活化后的東鄉(xiāng)野生稻菌株DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis)接入到種子培養(yǎng)基28°C>250rpm培養(yǎng)3d，然后按30%的接種量轉(zhuǎn)接至轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，35°C、250rpm搖床培養(yǎng)7d。離心去菌體，收集發(fā)酵液，用HPLC檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。[0030]所述種子培養(yǎng)基的組成為:每升培養(yǎng)基中含葡萄糖25g，甘草酸(或甘草酸銨鹽)0.2g,KH2PO42.0g,NH4NO33g,NaCl0.5g，酵母粉0.1g,MgSO40.12g,CaCl20.2g,FeSO40.014g,ZnSO4.7H202.9mg,MnCl2.4H202.0mg,CuSO4.5H200.25mg,CoCl2.6Η200.24mg,Na2MoO4.2Η200.24mg,H3BO30.03mg,其余為純水，調(diào)pH為6.0。[0031]所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成為:每升培養(yǎng)基中含甘草酸單銨鹽5g，KH2PO42.2g,NH4NO33g,NaCl0.5g，酵母粉0.1g，MgSO40.12g，CaCl20.4g,FeSO40.014g，ZnSO4.7H202.9mg,MnCl2.4H202.0mg,CuSO4.5H200.25mg,CoCl2.6H200.24mg,Na2MoO4.2H200.24mg,H3BO30.03mg，其余為純水，調(diào)pH為7.0。[0032]轉(zhuǎn)化結(jié)束后，8層紗布過濾或抽濾菌體，然后用75%的乙醇沖洗菌體3-5次，收集乙醇溶液，并檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，檢測結(jié)果為甘草酸轉(zhuǎn)化率為80.5%，GAMG產(chǎn)率為75.2%。[0033]所得的乙醇溶液經(jīng)減壓濃縮后，再噴霧干燥，獲得GAMG粗成品，檢測純度為89.4%。[0034]實(shí)施例4:東鄉(xiāng)野生稻菌株DX-SES3(Microsphaeropsi轉(zhuǎn)化甘草酸生成GAMG的檢測高效液相色譜檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物步驟如下:轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(發(fā)酵液與甲醇洗菌液的合并液)用色譜甲醇稀釋5倍后，用有機(jī)濾膜(孔徑為0.22Mm或0.45Mm)過濾后用高效液相色譜儀分析檢測。色譜條件:儀器為色譜柱為J’sphere0DS-H80(250X4.6mm,4Mm)，檢測器為PDA，檢測波長251.1nm，流動相為甲醇:三蒸水(乙酸調(diào)pH2.85)=81:19，進(jìn)樣量:20μL,流速為ImL/min，柱溫箱:35°C。[0035]液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物:樣品的處理方法與HPLC法處理方法一樣。檢測參數(shù)為:儀器:Agilent6120QuadrupoleLC/MS,色譜柱:AgilentStableBondSB-C18(2.1X50mm,1.8Mm)，檢測器:四級桿質(zhì)量檢測器，流動相:甲醇:三蒸水=81:19，進(jìn)樣量:5μL，流速:0.2mL/min，柱溫箱:25。C，電離方式:EIS(—)，選擇離子檢測(SIM)質(zhì)荷比(M/Z):821.9和和645.5，即對應(yīng)檢測GL(分子量為822.9)和GAMG(分子量為646.81)。[0036]附錄:菌株DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis)的ITS序列TTCCGTAAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCAATTCAACGGTGTGGTCGCGGCCTCCGGGGGCTTCCCTCCGGGCGGTAGAGGTAACACTCTCACGCGCCACATGTCTGAATCCTTTTTTTTACGAGCACCTTTCGTTCTCCCTCGGTGGGGCAACCTGCCGTTGGAACTTATCAAAAACCTTTTTTGCATCTAGCATTACCTGTTCAGATACAAACAATCGTTACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATCTACACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGCGTCTGTCCCGCCTCCGCGCGTGGACTCGCCCCAAATTCATTGGCAGCGGTCTTTGCCTCCTCTCGCGCAGCACATTGCGCTTCAGAGGGGCGTGGGCCGCGTCCACGAAGCAACATTACCGTCTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGo【權(quán)利要求】1.一株轉(zhuǎn)化甘草酸為GAMG的內(nèi)生真菌菌株，其特征在于:命名為DX-SES3，分類為小球殼孢屬菌Microsphaeropsisarundinis,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間為2014年5月3日，保藏號為CCTCCM2014177。2.一種內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化甘草酸為GAMG的方法，包括如下步驟:.O內(nèi)生真菌的活化及種子液的制備；.2)GAMG生物轉(zhuǎn)化:將步驟I)的種子液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)20-40%的接種量加入到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，進(jìn)行GAMG的生物轉(zhuǎn)化；.3)GAMG的分離制備:生物轉(zhuǎn)化后的GAMG富聚于內(nèi)生真菌菌球的表面，布氏漏斗抽濾或六層紗布過濾，收集菌體，用體積比為20%~100%的乙醇溶液沖洗菌體3-5次，收集乙醇溶液，后減壓濃縮，再噴霧干燥，獲得純度較大的GAMG成品，并用HPLC、LC-MS進(jìn)行檢測。3.如權(quán)利要求2所述的內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化甘草酸為GAMG的方法，其特征在于所述的內(nèi)生真菌DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis)在PDA培養(yǎng)基中，28±1°C培養(yǎng)7d,菌落的直徑為28~30mm質(zhì)地絨狀，中部凸起，同心輪紋狀，菌落灰色，邊緣色淺，無滲出液；菌落反面中央為黑褐色，其外圍為棕褐色，再外圍為淡黃色，培養(yǎng)時間菌落顏色變深為深灰色至褐色，但菌落不不變大；在CA培養(yǎng)基中，28±I°C培養(yǎng)6d菌落直徑為37~39mm，菌落起初白色后逐漸變成灰白色且，中央凸起且現(xiàn)絮狀，同心輪紋狀，邊緣整齊，背面白色，在光學(xué)顯微鏡下，菌絲有隔，可見蛹蟲狀的孢子囊結(jié)構(gòu)。4.如權(quán)利要求2所述的內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化甘草酸為GAMG的方法，其特征在于所述的內(nèi)生真菌DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis)菌株基因登錄號為KC871028。5.如權(quán)利要求2所述的內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化甘草酸為GAMG的方法，其特征在于所述的種子液培養(yǎng)制備為:將內(nèi)生真菌DX-SES3(Microsphaeropsisarundinis)接種到PDA斜面培養(yǎng)基中20~30°C培養(yǎng)活化72~108小時，并制作孢子懸浮液，將孢子懸浮液加入到種子培養(yǎng)基中，20~30°C，150~300r/min，搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期。6.如權(quán)利要求2所述的內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化甘草酸為GAMG的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基的組成為:每升培養(yǎng)基中含葡萄糖10~40g，甘草酸(或甘草酸銨鹽)0.1~Ig，KH2PO4LO~3.0g,NH4NO32.0~5.0g,NaCl0.3~0.8g，酵母粉0.05~0.3g,MgSO40.1~0.5g,CaCl20.01~0.5g,FeSO40.014g,ZnSO4.7Η202.9mg,MnCl2.4Η20.2.0mg,CuSO4.5H200.25mg,CoCl2.6H200.24mg,Na2MoO4.2H200.24mg,H3BO30.03mg,其余為純水，調(diào)pH為5.0~7.0。7.如權(quán)利要求2所述的內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化甘草酸為GAMG的方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)條件為:28°C~40°C，轉(zhuǎn)速150~280r/min。8.如權(quán)利要求2所述的內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化甘草酸為GAMG的方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成為:每升培養(yǎng)基中含甘草酸(或甘草酸銨鹽)2~30g，KH2PO41.0~3.0g，NH4NO32.0~4.0g,NaCl0.3~0.8g，酵母粉0.05~0.1g,MgSO40.1~0.5g,CaCl2.0.01~0.5g,FeSO40.014g，ZnSO4.7H202.9mg,MnCl2.4H202.0mg,CuSO4.5H20.0.25mg,CoCl2.6H200.24mg,Na2MoO4.2H200.24mg,H3BO30.03mg，其余為純水，調(diào)pH為3.5~9.0，其中甘草酸(或甘草酸銨鹽)是菌體產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶的誘導(dǎo)劑。【文檔編號】C12R1/645GK103981104SQ201410225800【公開日】2014年8月13日申請日期:2014年5月27日優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日【發(fā)明者】張志斌,高波良,朱篤,李平,顏日明,汪涯申請人:江西師范大學(xué)