一株達(dá)木海洋芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種海洋芽孢桿菌Oceanobacillus。（見附圖）通過從新疆莎車縣鹽堿土分離、篩選、生理生化鑒定等工作，確定該菌株為好氧，革蘭氏陽性，運(yùn)動(dòng)性，呈短桿狀，大小范圍為0.2-0.4×1.0-1.2μm，端生孢子，孢子囊些微腫脹，菌落呈奶油色，形狀呈圓形規(guī)則，邊緣光滑。NaCl耐受范圍為3-20%(最佳鹽濃度為10%-15%)，pH生長范圍為6.5-11.0(最佳pH范圍為7.5-9.0)，溫度生長范圍為15-40℃(最佳生長溫度為30-37℃)。氧化酶和過氧化氫酶陽性，脲酶陰性，具有硝酸還原能力，可以水解淀粉，不能水解吐溫-80，明膠和纖維素?？蓮V泛應(yīng)用于淀粉酶的生產(chǎn)和各類基因工程產(chǎn)品的高鹽濃度發(fā)酵。附圖是掃描電子顯微鏡15000倍下PT-20的照片。
【專利說明】一株達(dá)木海洋芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物菌種及其應(yīng)用領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一種海洋芽孢桿菌及其應(yīng)用的【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]中度嗜鹽菌并非分類學(xué)上的專業(yè)名詞，而是對(duì)一類最佳耐鹽濃度在3%_15%的極端微生物的統(tǒng)稱。它廣泛分布在各類高鹽環(huán)境中，如海洋、鹽湖、鹽堿地、鹽池這些自然環(huán)境及很多發(fā)酵食品中都能被發(fā)現(xiàn)。由于這菌的獨(dú)特生存環(huán)境，故它們有以下特點(diǎn)，較高鹽濃度下發(fā)酵生長，避免發(fā)酵過程中的染菌風(fēng)險(xiǎn)，不需要復(fù)雜的培養(yǎng)條件，生理生化多樣性，有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
[0003]傳統(tǒng)的食品發(fā)酵工業(yè)中，嗜鹽微生物的應(yīng)用由來已久，如食品調(diào)味醬就是通過將小麥、谷子和大豆等農(nóng)作物密封浸泡在19%左右的NaCl溶液中，經(jīng)發(fā)酵9-10個(gè)月而成?？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)，在此過程中，有一種名為Tetragenococcus halophilus的中度嗜鹽菌起到了主要的發(fā)酵推動(dòng)與承擔(dān)作用，其高達(dá)108 CFU/mL的培養(yǎng)基細(xì)胞濃度不僅能抑制其他細(xì)菌生長，還能保證在混合氨基酸缺乏的環(huán)境下醬的風(fēng)味濃郁不散而且美味可口。在韓國，人們經(jīng)常喜歡將海產(chǎn)品進(jìn)行腌制，而這過程中起到主要作用的菌株也是一類中度嗜鹽菌，名為Halomonas alimentaria。許多中度嗜鹽菌的菌落也十分好看,多呈橙色或粉紅色,而其中的有益品種亦被用來生產(chǎn)天然食品添加劑。 [0004]海洋芽抱桿菌屬iOceanobaci I Ills')是 2002 年由 Jie Lu 和 Yuichi Nogi 等人提出的，最初的菌株從深海中分離得到，至今已有16個(gè)有效種和2個(gè)有效亞種，該屬菌特點(diǎn)為革蘭氏陽性，對(duì)鹽濃度有較高的耐受性，其應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道較少。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)國內(nèi)外有關(guān)海洋芽孢桿菌的研究現(xiàn)狀,本發(fā)明提供一種達(dá)木海洋芽孢桿菌及其應(yīng)用。所述的達(dá)木海洋芽孢桿菌堿性磷酸酶陰性、脂肪酶(C14)陽性、β_半乳糖苷酶陰性、β_葡萄糖苷酶陽性、酯酶(C4)陰性，這些特征已明顯區(qū)別于已公開報(bào)道的其他海洋芽孢桿菌屬有效種。
[0007]本發(fā)明具體提供一種達(dá)木海洋芽抱桿菌附圖1) 本發(fā)明通過以不同的溫度、PH值、鹽濃度和培養(yǎng)基為富集條件，從新疆莎車鹽湖中取
樣，分離純化培養(yǎng)到多株菌，經(jīng)過多級(jí)篩選確定一株嗜鹽海洋芽孢桿菌iOceanobacillusdamuensis ΡΤ_20τ)，命名為達(dá)木海洋芽孢桿菌，該菌株已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位:韓國典型菌種保藏單位(KCTC)保藏時(shí)間分別為2013年3月6日，保藏號(hào)分別是KCTC 33146，KCTC地址為韓國大田市儒城區(qū)韓國生物科學(xué)和技術(shù)研究所，郵編是305-806，經(jīng)微生物多相分類鑒定為海洋芽孢桿菌如ciJJm damuensis ΡΤ_20τ=KCTC 33146τ。細(xì)胞好氧，革蘭氏陽性，運(yùn)動(dòng)性，呈短桿狀，大小范圍為0.2-0.4X1.0-1.2μ m,端生孢子，孢子囊些微腫脹，菌落呈奶油色，形狀呈圓形規(guī)則，邊緣光滑。NaCl耐受范圍為3-20%(最佳鹽濃度為10%-15%)，pH生長范圍為6.5-11.0 (最佳pH范圍為7.5-9.0)，溫度生長范圍為15_40°C (最佳生長溫度為30-37°C)。氧化酶和過氧化氫酶陽性，脲酶陰性，具有硝酸還原能力，可以水解淀粉，不能水解吐溫-80，明膠和纖維素。其生長過程中不產(chǎn)生H2S和吲哚，M.R.和V.P.實(shí)驗(yàn)陰性。能利用碳源:糊精、D-麥芽糖、D-海藻糖、萬古霉素、四唑紫、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰-D-甘露糖胺、a-D-葡萄糖、L-巖藻糖1%乳酸鈉、梭鏈孢酸、D-阿拉伯醇、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、醋竹桃霉素、利福霉素、L-丙氨酸、L-左旋谷氨酸、林可霉素、鹽酸胍、果膠、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、葡羅酰胺、D-乳酸甲酯、檸檬酸、α -氧代戊二酸、L-蘋果酸、溴代丁二酸、萘啶酮酸、氧化鋰、吐溫-40、α-羥基丁酸、羥基丁酸、α-氧代丁酸、乙酰乙酸、氨曲南和丁酸鈉；不能利用碳源:D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、D-松二糖、水蘇糖、四唑藍(lán)、D-蜜三糖、a-D-乳糖、D-蜜二糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、D-水楊苷、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-神經(jīng)氨酸、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲基-匍萄糖、D-巖操糖、L-鼠李糖、肌苷、D-絲氨酸、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、肌醇、甘油、D-天門冬氨酸、D-絲氨酸、二甲胺四環(huán)素、明膠、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天門冬氨酸、L-組氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸、硫酸四癸鈉、L-半乳糖酸內(nèi)酯、D-葡萄糖酸、粘酸、奎尼酸、D-葡糖二酸、P-羥基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、L-乳酸、D-蘋果酸、亞碲酸鉀、Y-氨基丁酸、丙酸、醋酸、甲酸和溴酸鈉。細(xì)胞壁主要肽聚糖類型為內(nèi)消旋二氨基庚二酸(meso-DAP)，主要醌型為MK-7，主要脂肪酸為anteiso-C15:0和iso-C15:(l，主要極性脂為磷脂酰甘油(PG)，G+C含量為39.2 mol%
對(duì)該菌株OceamAmciIlus damuensis ΡΤ_20τ的形態(tài)觀察、生理生化及培養(yǎng)特性和化學(xué)分類均按照《放線菌系統(tǒng)學(xué)——方法、原理與實(shí)踐》進(jìn)行。其中碳源利用情況采用Biolog全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，采用高效液相法來測定該菌的醌組分和細(xì)胞內(nèi)GC含量，使用2.5%戊二醛固定該菌后，在掃描電鏡下觀察該菌的形貌(圖1)，參考菌株為Oceanobacillusprofundus CL_MP28T(DSM 18246τ) > Ornithinibacillusbavariensis WSBC 24001τ、Oceanobacillusiheynsis 用于和測試菌株 PT-20 比較。
[0008]本發(fā)明通過DNA的提取，16S rDNA的PCR及測序，同時(shí)根據(jù)在NCBI山上比對(duì)結(jié)果和進(jìn)化樹的構(gòu)建，進(jìn)一步對(duì)該菌的分類地位進(jìn)行判斷。
[0009]米用Sanger 法對(duì) Oceanobacillus damuensis ΡΤ_20τ 的 16S rDNA 測序結(jié)果如下(該序列已在NCBI登記，登錄號(hào)為HQ620695)，全長共1592bp:
CAAGTCGAGCGCGGGAAGCTTTTCTGACCCCTTCGGGGTGAAGAAGAGTGGAACGAGCGGCGGACGGGTGAG
TAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGATTGGGATAACTCGCGGAAACGTGAGCTAATACCGGATAATACTTTTTGTC
TCCTGACAGAAAGATGAAAGGCGGCTTTTAGCTGTCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGG
TAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG
ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGA
AGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTCAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCGCCTTGACGGTACCTG
ACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGG
CGTAAAGCGCTCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTTAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTG
GAGGACTTGAGTACAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAG
TGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACCACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGAACAAAGGGAAGCGAAGCCGCGAGGTCAAGCAAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTGGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACTAATGATTGGGG基于16S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2，從圖上可以看出達(dá)木海洋芽孢桿菌 OcomiolmciIlus damuensis ΡΤ_20τ 與海洋芽抱桿菌的一個(gè)有效種 OcomiolmciIlusprofundus CL_MP28T (DSM 18246τ)聚為一個(gè)分支，該海洋芽抱桿菌damuensis 親緣性最近的菌株profundus CL_MP28T (DSM 18246τ)的 16S
rDNA相似度為97.267%，結(jié)合表型、生理生化和基因型比較數(shù)據(jù)，表明達(dá)木海洋芽孢桿菌OceanobaciIlus damuensis 為海洋芽抱桿菌屬的一個(gè)新種。
[0010]基于該菌為短桿狀革蘭氏陽性菌，嚴(yán)格好氧，產(chǎn)芽孢，具有運(yùn)動(dòng)性，細(xì)胞大小為0.2-0.4X1.0-1.5 μ m，菌落呈奶油色。NaCl耐受范圍為3-20%(最佳鹽濃度為10%-15%)，PH生長范圍為6.5-11.0 (最佳PH范圍為7.5-9.0)，溫度生長范圍為15_40°C (最佳生長溫度為30-37°C )。氧化酶和 過氧化氫酶陽性，具有硝酸還原能力，可以水解淀粉、糊精、D-麥芽糖、D-海藻糖、吐溫-40、羥基丁酸、α-氧代丁酸，同時(shí)具有脂肪酶(C14)活性。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于各類基因工程產(chǎn)品的高鹽濃度發(fā)酵中。同時(shí)該菌能利用以下碳源生長:糊精、D-麥芽糖、D-海藻糖、萬古霉素、四唑紫、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰-β -D-甘露糖胺、a -D-葡萄糖、L-巖藻糖1%乳酸鈉、梭鏈孢酸、D-阿拉伯醇、D-葡萄糖_6_磷酸、D-果糖-6-磷酸、醋竹桃霉素、利福霉素、L-丙氨酸、L-左旋谷氨酸、林可霉素、鹽酸胍、果膠、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、葡羅酰胺、D-乳酸甲酯、檸檬酸、α-氧代戊二酸、L-蘋果酸、溴代丁二酸、萘啶酮酸、氧化鋰、吐溫-40、α-羥基丁酸、羥基丁酸、α-氧代丁酸、乙酰乙酸、氨曲南和丁酸鈉；不能利用碳源:D_纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、D-松二糖、水蘇糖、四唑藍(lán)、D-蜜三糖、a-D-乳糖、D-蜜二糖、甲基-D-葡萄糖苷、D-水楊苷、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-神經(jīng)氨酸、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲基-葡萄糖、D-巖藻糖、L-鼠李糖、肌苷、D-絲氨酸、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、肌醇、甘油、D-天門冬氨酸、D-絲氨酸、二甲胺四環(huán)素、明膠、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天門冬氨酸、L-組氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸、硫酸四癸鈉、L-半乳糖酸內(nèi)酯、D-葡萄糖酸、粘酸、奎尼酸、D-葡糖二酸、P-羥基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、L-乳酸、D-蘋果酸、亞碲酸鉀、Y -氨基丁酸、丙酸、醋酸、甲酸和溴酸鈉。
[0011]本發(fā)明的達(dá)木海洋芽抱桿菌damuensisPT_20T =KCTC 33146τ可在較高鹽濃度下正常生長，硝酸鹽還原陽性，能夠水解淀粉，具有酯酶(c8)、脂肪酶(C14)和β -葡糖苷酶活性，可廣泛應(yīng)用在脂肪酶、酯酶生產(chǎn)和各種基因工程產(chǎn)品高鹽濃度下發(fā)酵領(lǐng)域。
[0012]【專利附圖】

【附圖說明】:圖1是掃描電子顯微鏡15000倍下ΡΤ-20的照片。圖2是ΡΤ-20與臨近菌構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹。圖3是PT20碳源利用情況，其中Uprofundus 2,PT-1l ;3、PT_20 ；
4、iheynsis ;5、bavariensis。圖4是PT-20及其臨近菌的化學(xué)特征，其中1、PT-1l ;2、bavariensis ;3、profundus ;4、PT-20。圖 5 是 PT-20 酶活特性，其中 1、profundus ;2、PT-1l;3、PT-20。
[0013]下面舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不限于下述實(shí)施例。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例一:達(dá)木海洋芽抱桿菌Oceanobacillus damuensis的篩選和分離 樣品采集與菌株篩選分離
樣品采集于新疆維吾爾族自治區(qū)莎車縣。樣品來自多個(gè)區(qū)域，分布于東經(jīng)76° 1' 57"至77° 46' 30"、北緯37° 27' 30"至39° 15"之間。用無菌玻璃瓶收取距表層5-lOcm 土壤，經(jīng)風(fēng)干，研磨，過篩，置于4°C保存，用于后續(xù)分離。篩選培養(yǎng)基選用苯酚富集培養(yǎng)基(PT)，腐殖酸富集培養(yǎng)基(HVA)，鑰酸鈉富集培養(yǎng)基(HNA)和高鹽富集培養(yǎng)基(YCSS)，純化培養(yǎng)基選用胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB+10% NaCl)，通過接種不同的富集培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行篩選。將Ig 土樣加入裝有25ml液體培養(yǎng)基的搖瓶中，在28°C下振蕩培養(yǎng)7天。然后用移液槍吸取富集液，作10倍梯度稀釋，取200 μ I 10-廣10-4倍數(shù)稀釋液分別涂布到對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基平板上，置于28°C下繼續(xù)培養(yǎng)一周。觀察生長狀況與形態(tài)特征，將長出的菌落轉(zhuǎn)接至TSB固體培養(yǎng)基，經(jīng)多次劃線，再挑取單菌落轉(zhuǎn)接至TSB斜面培養(yǎng)基，置于4°C作短期保藏。同時(shí)取新鮮菌液混合25%濃度甘油，置于-80°C作長期保藏。(所有培養(yǎng)基配方見下表)
苯酚富集培養(yǎng)基(PT):酪蛋白胨7.58，氯化鈉10(^，酵母浸出物1(^，苯酚69(^1 ,MS混合液 I unit，無菌水 1000ml，ρΗ8.2-8.5。
[0015]腐殖酸富集培養(yǎng)基(HVA):腐殖酸Ig,氯化鈉150g , MS混合液I unit,無菌水1000ml，ρΗ8.2-8.5。
[0016]鑰酸鈉富集培養(yǎng)基(HNA):酪蛋白胨7.5g，氯化鈉150g，酵母浸出物IOg ,MS混合液 I unit,無菌水 1000ml , ρΗ8.2-8.5。
[0017]高鹽富集培養(yǎng)基(YCSS):酪蛋白胨7.5g，氯化鈉250g，酵母浸出物10g，MS混合液 I unit,無菌水 1000ml , ρΗ8.2-8.5。
[0018]MS混合液:濃度為0.05g/L相容性物質(zhì)(甜菜堿，脯氨酸，甘氨酸，D-山梨醇，谷氨酸鹽)混合液1.5ml ;濃度為0.05g/L氨基酸(天冬氨酸，組氨酸，賴氨酸，蛋氨酸，纈氨酸，亮氨酸，酪氨酸，谷氨酸)混合液15ml ;濃度為0.025mg/L維生素(VBl，VB2, VB12, VB6, VH,VM, VPP)混合液 0.25ml ο
[0019]胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB+10% NaCl):胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，NaCl 100g，瓊脂粉 18g，蒸餾水 1000ml, ρΗ8.0-8.2。
[0020]菌株描述:
該菌株為短桿狀革蘭氏陽性菌，嚴(yán)格好氧，產(chǎn)芽孢，具有運(yùn)動(dòng)性，細(xì)胞大小為
0.2-0.4X1.0-1.5 μ m，菌落呈奶油色。NaCl耐受范圍為3_20%(最佳鹽濃度為10%-15%),pH生長范圍為6.5-11.0 (最佳pH范圍為7.5-9.0)，溫度生長范圍為15_40°C (最佳生長溫度為 30-37°C )。[0021]實(shí)施例二:達(dá)木海洋芽孢桿菌的多相分類鑒定
對(duì)該菌株OceanobaciIlus damuensis ΡΤ_20τ的形態(tài)觀察、生理生化及培養(yǎng)特性和化學(xué)分類均按照《放線菌系統(tǒng)學(xué)——方法、原理與實(shí)踐》進(jìn)行。其中碳源利用情況采用Biolog全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，采用高效液相法來測定該菌的醌組分和細(xì)胞內(nèi)GC含量，脂肪酸成分測定采用美國MIDI公司SheiOlock全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)分析，酶學(xué)特性采用 API ZYM 試劑條鑒定，參考菌株為CL_MP28T(DSM 18246τ)、
Oceanobacillusiheynsis>Ornithinibacillusbavariensis WSBC 24001T,碳源利用情況米用Biolog全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)測定。結(jié)果見圖3、圖4和圖5.從酶活結(jié)果來看，該菌株P(guān)T-1l與親緣性最近對(duì)照模式菌OceanobaciIlusprofundusDSM 18246τ有6種酶活性不同；在碳源利用方面，共有13種情況不同；模式菌株GC含量低于測試菌株ΡΤ-20，結(jié)合進(jìn)化樹數(shù)據(jù)，判斷該株菌為海洋芽孢桿菌屬的一個(gè)新種。
[0022]實(shí)施例三:16S rDNA測序及進(jìn)化樹構(gòu)建
采用SDS法提取細(xì)菌總DNA，通過PCR法擴(kuò)增菌株16S rRNA基因序列，DNA測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。到GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫將各菌株測得的16S rRNA基因部分序列提交注冊獲得序列號(hào)。再在NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information)上進(jìn)行BLAST比對(duì)，找到親緣關(guān)系最近的菌株。通過BioEdit將親緣性最近的相應(yīng)菌株進(jìn)行序列比對(duì)，然后在軟件MEGA 5.0上分別使用Neighbor-Joinin(N-J)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹bootstrap為1000。PCR相應(yīng)引物、反應(yīng)體系、條件如下:引物 PA8: 5’ -CCGTCGACGAGCTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 PB1:5’ -CCCGGGTACCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，反應(yīng)體系(25 μ I 體系):Mg2+ 2.5 μ IjPA8
2.5 μ IjPB1 2.5 μ l，dNTP 0.75 μ IjH2O 14 μ l，Taq 酶 0.25 μ 1，反應(yīng)條件 95°C預(yù)變性 5min,94°C變性45s，50°C退火45s，延伸lmin，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，72°C保溫lOmin。構(gòu)建的進(jìn)化樹見圖2。
[0023]實(shí)施例四:達(dá)木海洋芽抱桿菌damuensis PT_20T =KCTC 33146τ的應(yīng)用硝酸鹽還原:滴加格里斯氏試劑Α，B到待測細(xì)菌培養(yǎng)液中，若變紅色，則為硝酸鹽還原陽性，若不變色，滴加二苯胺試劑后，仍不呈藍(lán)色，則為硝酸鹽還原陰性。結(jié)果顯示測試菌株P(guān)T-1l顯紅色，所以為硝酸鹽還原陽性。
[0024]實(shí) 施例五:達(dá)木海洋芽抱桿菌Oceanobacillus damuensis PT_20T =KCTC 33146τ的應(yīng)用淀粉水解:將測試菌株ΡΤ-20接種到含有1%的可溶性淀粉的TSA培養(yǎng)基上，滴加碘液染色，觀察是否有透明水解圈出現(xiàn)，若出現(xiàn)則為陽性，若否，則為陰性。結(jié)果顯示有水解出現(xiàn)，證明該菌株有淀粉酶活性。
【權(quán)利要求】
1.一株海洋芽抱桿菌(6fc<9a/7oAaci77w5.damuensis)?T~2Q T (=KCTC 33146 T =DSM.26901 τ)。
2.如權(quán)利要求1 所述海洋芽抱桿菌(6t<9a/7oAaci77w5.damuensis) PT-20 T (=KCTC.33146 T =DSM 26901 τ)，其特征為短桿狀革蘭氏陽性菌，嚴(yán)格好氧，產(chǎn)芽孢，具有運(yùn)動(dòng)性，細(xì)胞大小為0.2-0.4X1.0-1.5μπι，菌落呈奶油色，NaCl耐受范圍為3-20%(最佳鹽濃度為10%-15%)，pH生長范圍為6.5-11.0(最佳pH范圍為7.5-9.0)，溫度生長范圍為.15-400C (最佳生長溫度為30-37°C )，氧化酶和過氧化氫酶陽性，脲酶陰性，具有硝酸還原能力，可以水解淀粉，不能水解吐溫-80，明膠和纖維素，其生長過程中不產(chǎn)生H2S和吲哚，M.R.和V.P.實(shí)驗(yàn)陰性，細(xì)胞主要脂肪酸為anteiso-C15:0和iso-C15:0，主要呼吸醌為MK-7，細(xì)胞壁肽聚糖類型主要為內(nèi)消旋二氨基庚二酸(meso-DAP)，DNA (G+C)含量為.39.2mol%，主要極性脂為磷脂酰甘油(PG)。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103966146SQ201410228561
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】田永強(qiáng), 劉波, 龍秀鋒 申請(qǐng)人:四川大學(xué)