一種高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌及其應(yīng)用，分類命名為球狀賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillussphaericus)Xyn-1，已于2014年5月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCCM2014183。采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析法確定了篩選菌株搖瓶最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件，該條件下的發(fā)酵水平可達(dá)5678.5IU/mL。利用該菌株發(fā)酵所產(chǎn)酶應(yīng)用于植物半纖維素的降解，經(jīng)過(guò)酶解半纖維素的木二糖收率可達(dá)60%以上。
【專利說(shuō)明】一種高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于應(yīng)用微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]木聚糖酶(Xylanase E.C3.2.1.8)是一種主要的木聚糖降解酶類，其通過(guò)內(nèi)切方式降解木聚糖中的β_1，4木糖苷鍵，水解產(chǎn)物大多為低聚木糖，并伴有少量的木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶具有廣泛的應(yīng)用前景，在造紙工業(yè)方面:木聚糖酶可作為生物漂白劑替代傳統(tǒng)的化學(xué)漂白，從而大量降低氯的用量，減輕造紙對(duì)環(huán)境的污染，木聚糖酶作為“制漿酶”已廣泛應(yīng)用于西方發(fā)達(dá)國(guó)家，帶來(lái)了良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益；木聚糖酶在食品行業(yè)被廣泛用于面制品、果汁等食品制作以及木寡糖的制備生產(chǎn)；發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中，木聚糖酶被廣泛用于小麥等發(fā)酵原料的糖化處理上；飼料行業(yè)作為一類飼料添加酶，可有效提高飼料營(yíng)養(yǎng)。木聚糖酶已經(jīng)成為酶制劑生產(chǎn)行業(yè)中的一個(gè)重要產(chǎn)品，市場(chǎng)對(duì)于其需求量也呈現(xiàn)與日俱增的趨勢(shì)。
[0003]此外，通過(guò)對(duì)目前市場(chǎng)上應(yīng)用木聚糖酶的整體環(huán)境分析可以發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶劑的應(yīng)用環(huán)境大多處于高溫條件，例如造紙過(guò)程，需要高溫操作以除去木質(zhì)素等；食品生產(chǎn)過(guò)程一般需要高溫滅菌等操作。研究發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度一般低于45°C，因此木聚糖酶在上述過(guò)程中投入使用前需要提前降溫以提高酶的催化活性，這些操作不僅耗能也極大地阻礙木聚糖酶的應(yīng)用發(fā)展。因此，獲得高 產(chǎn)耐熱木聚糖酶菌株并將其投入于實(shí)際發(fā)酵生產(chǎn)具有廣闊的研究和應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌及其在發(fā)酵產(chǎn)耐高溫木聚糖酶中的應(yīng)用，具有很大的推廣價(jià)值。
[0005]高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌，分類命名為球狀賴氨酸芽孢桿菌Xyn-1 (Lysinibacillus sphaericus Xyn-1),已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號(hào)為:CCTCCM2014183，保藏日期為2014年5月5日，地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0006]本發(fā)明菌株的篩選方法如下:
[0007]篩選培養(yǎng)基配方:蛋白胨1g,酵母膏3g, NaC15g,木聚糖4g,瓊脂粉15g,蒸懼水100mL, ρΗ8.0，滅菌 121°C，20min。
[0008]采集位于南京工業(yè)大學(xué)生物甲烷生產(chǎn)車間周圍的農(nóng)用秸桿堆肥不同位置若干份樣品接種到上述篩選培養(yǎng)基中，55°C培養(yǎng)24~48h，用0.1 %剛果紅溶液處理30min，再用lmol/L NaCl溶液脫色，然后選取培養(yǎng)基上透明圈較大且水解圈明顯的菌株作為初篩菌株；隨后，對(duì)初篩菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶能力進(jìn)行驗(yàn)證，以木聚糖為底物，基于DNS法測(cè)定酶活，選取產(chǎn)量最高的一株菌株Xyn-1，其初始發(fā)酵水平為3245.5IU/mL。
[0009]生理生化特征:菌株Xyn-1的生長(zhǎng)以0D_的吸光度值表示，通過(guò)細(xì)菌對(duì)數(shù)時(shí)期單位內(nèi)數(shù)量的增長(zhǎng)計(jì)算生長(zhǎng)代時(shí)為3.0h。菌株的分子生物學(xué)鑒定表明，菌株Xyn-1的16S rRNA基因序列在GenBank的注冊(cè)號(hào)為KJ755851,與其最相近種屬Lysinibacillus sphaericus的相似性為91%，為一新種屬細(xì)菌，命名為球狀賴氨酸芽孢桿菌Xyn-1 (Lysinibacillussphaericus Xyn-1)。該菌株已于2013年5月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)分別為:CCTCCM2014183。
[0010]所述的高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的應(yīng)用。
[0011]所述的高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在降解秸桿半纖維素中的應(yīng)用。
[0012]應(yīng)用的具體步驟如下:
[0013]I)將菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)，置于37°C下，培養(yǎng)48~72h，采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，具體配方:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g, NaC15.0g，瓊脂20g，溶解在100mL蒸餾水中，PH7.4-7.6。將上述斜面培養(yǎng)的菌株劃線接種滅菌的LB培養(yǎng)基中(蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解在100mL蒸餾水中，pH7.0~7.2)，37°C條件下200~250r/min培養(yǎng)12h，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定菌液濃度，并將其稀釋至菌懸液濃度5 X 16個(gè)/mL。
[0014]2)將步驟I)得到的菌液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為4% (v/v)，培養(yǎng)基用量為25mL/250mL錐形瓶，培養(yǎng)溫度45°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵時(shí)間為72h。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:木聚糖 10.7g，酵母粉 5.6g，蛋白胨 2g，NH4N034g, (NH4)2S046g, KH2PO40.9g，MgSO4.7H201g, NaC15g，蒸餾水 100mL0
[0015]3)發(fā)酵制 備木聚糖酶用于小麥秸桿半纖維素的酶解:將步驟2)獲得的發(fā)酵液在5500r/min, 4°C條件下離心5min。收集上清液即得到發(fā)酵所產(chǎn)耐高溫木聚糖酶液,并將其應(yīng)用于玉米秸桿半纖維素的酶解。酶解過(guò)程以100~150IU/g半纖維素的比例加入木聚糖酶液，在55°C條件下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾收集酶解液，利用HPLC法測(cè)定酶解液中各還原糖含量，并以此計(jì)算該過(guò)程的酶解效率。
[0016]有益效果
[0017]本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶菌株Xyn-Ι，其培養(yǎng)條件相對(duì)溫和，篩選菌株通過(guò)鑒定屬于球狀賴氨酸芽孢桿菌，此前對(duì)于該菌株的木聚糖酶研究尚未進(jìn)行過(guò)報(bào)道，本發(fā)明進(jìn)一步豐富了該種屬菌系的相關(guān)研究?jī)?nèi)容。
[0018]篩選得到的菌株Xyn-1產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的發(fā)酵水平達(dá)到5678.5IU/mL,比較發(fā)現(xiàn)該菌株的木聚糖酶生產(chǎn)能力較高，同時(shí)發(fā)酵獲得的耐高溫木聚糖酶具有很好的熱穩(wěn)定性，可以廣泛應(yīng)用于造紙、食品等行業(yè)。
[0019]采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)菌株Xyn-1的生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化研究，獲得了最佳的培養(yǎng)方案，菌株的木聚糖酶發(fā)酵水平有了顯著的提高，由初始發(fā)酵3245.5IU/mL提高到5678.5IU/mL。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1球狀賴氨酸芽孢桿菌Xyn-1平板菌落形態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例1高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶菌株的篩選及培養(yǎng)
[0022]富集培養(yǎng)基=NaNO30.5g、K2HPO4I g、MgSO4.7Η200.5g、KC10.5g、FeSO4.7H200.005g、蒸懼水 100mL, pH 自然，滅菌 121°C,20min。[0023]篩選培養(yǎng)基:蛋白胨10g，酵母膏3g，NaC15g，木聚糖4g，瓊脂粉15g，
[0024]蒸餾水lOOOmL，ρΗ8.0，滅菌 121°C，20min。
[0025]發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨1g,酵母膏3g, NaC15g,木聚糖4g,蒸懼水100mL, pH自然，滅菌 121°C，20min。
[0026]LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg，瓊脂20g，溶解在100mL蒸餾水中，ρΗ7.0 ~7.2，滅菌 121°C，20min。
[0027]采集位于南京工業(yè)大學(xué)生物甲烷生產(chǎn)車間周圍的秸桿堆肥不同位置若干份樣品5g,將其分別置于250mL錐形瓶中，加入50mL無(wú)菌水，37°C、180r/min培養(yǎng)Ih制備懸液，取5mL懸液加入到盛有50mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，振蕩培養(yǎng)5~7d后，取培養(yǎng)液分別稀釋?duì)│?~10_6，并分別將其均勻涂布到篩選培養(yǎng)基上，55°C培養(yǎng)24~48h，用0.1 %剛果紅溶液處理30min，再用lmol/L NaCl溶液脫色。觀察菌落周圍的透明圈情況，根據(jù)透明圈與菌落尺寸的大小可以比較出菌株產(chǎn)木聚糖酶活力的高低，并以此作為指標(biāo)進(jìn)行菌株的初篩。初篩完成后，對(duì)若干初篩菌株的菌液稀釋10—1~10_6，分別接種到新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中35°C培養(yǎng)72h，以發(fā)酵液中木聚糖酶產(chǎn)量作為直接標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行菌株復(fù)篩。如此繼代培養(yǎng)，淘汰發(fā)酵水平較弱的培養(yǎng)物，最終得到一株保持較高木聚糖酶產(chǎn)酶能力且穩(wěn)定的菌株，利用LB培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行菌株純化保藏，同時(shí)利用甘油培養(yǎng)方式對(duì)純化菌株進(jìn)行凍藏處理。
[0028]實(shí)施例2篩選菌株的生物學(xué)鑒定
[0029]1.菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 [0030]將分離純化菌株接種到固體LB培養(yǎng)基上，在37°C條件下培養(yǎng)24h觀察菌種的平板菌落形態(tài)。如圖1，菌株Xyn-1，在固體LB培養(yǎng)基生長(zhǎng)后，菌落直徑0.6cm，形狀呈規(guī)則的突起物，可形成內(nèi)生芽孢，呈圓形，培養(yǎng)基上呈白色不透明菌落，表面光滑，菌落邊緣規(guī)則。
[0031]2.菌株的分子學(xué)鑒定
[0032]對(duì)篩選細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定，菌種鑒定基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的細(xì)菌16S rDNA序列庫(kù)。利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株的DNA，并利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，弓丨物序列為:27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)、1492R(5’-GGYTACCTTGTTACGACT-3’)。PCR反應(yīng)體系為(25 μ L):模板0嫩10叩，10\?0?緩沖液2.5 4 1^，25臟01/1]\%(:121.5 4 1^ dNTP1^叉2.5 4 1^，引物各0.25 4 1^，5~4 1^1^&9聚合酶0.125 μ L0 PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min,隨后35個(gè)循環(huán)(94°C變性30s，55°C退火lmin，72°C延伸2min)，最后72°C反應(yīng)lOmin。將純化后的PCR擴(kuò)增片段送檢測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI中Genbank的BLAST程序進(jìn)行相似性比對(duì)。
[0033]分子學(xué)鑒定結(jié)果:篩選菌株Xyn-1的16S rDNA區(qū)序列如SEQ ID NO:1所示，該序列已提交至Genbank,注冊(cè)號(hào)為KJ755851,與其最相近種屬Lysinibacillus sphaericus的相似性為91 %，為一新種屬細(xì)菌，命名為球狀賴氨酸芽孢桿菌Xyn-1。
[0034]實(shí)施例3發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化
[0035]采用單因素分析法對(duì)菌株Xyn-1培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的培養(yǎng)條件:培養(yǎng)基用量25mL/250mL錐形瓶，培養(yǎng)溫度45°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min，菌懸液濃度為5 X 16個(gè)/mL,每瓶接種量為1.0mL,初始pH7.0，發(fā)酵時(shí)間為72小時(shí)。培養(yǎng)基組成的優(yōu)化:
[0036]通過(guò)單因素分析法確定與Xyn-1產(chǎn)酶的培養(yǎng)基相關(guān)9因素。采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選產(chǎn)酶重要影響因子，選用試驗(yàn)次數(shù)N = 12的設(shè)計(jì)，對(duì)培養(yǎng)基中的乳糖、麥芽糖、木聚糖、酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸銨和磷酸二氫鉀)等9個(gè)因素進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表1~2，對(duì)產(chǎn)酶影響的順序?yàn)?木聚糖 > 酵母粉 > 磷酸二氫鉀 > 蛋白胨。
[0037]表1菌株Xyn-1培養(yǎng)因素Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一株高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌，其分類命名為球狀賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sphaericus) Xyn-1,已于2014年5月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 CCTCC，保藏編號(hào)為 CCTCCM 2014183。
2.權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在降解秸桿半纖維素中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的應(yīng)用，其特征在于包括如下步驟: 1)斜面培養(yǎng):將球狀賴氨酸芽孢桿菌Xyn-1接種至斜面培養(yǎng)基上，37°C下，培養(yǎng)48~72h ； 2)種子培養(yǎng):挑取步驟I)斜面上的單菌落于LB培養(yǎng)基中，在37°C條件下置于200-250r/min的搖床中，培養(yǎng)12 h，獲得種子液； 3)發(fā)酵產(chǎn)酶:將步驟2)中的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為I~10%(v/v)，45°C下發(fā)酵72 h制備含耐高溫木聚糖酶的發(fā)酵液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的應(yīng)用，其特征在于:步驟I)所述斜面培養(yǎng)基為:牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20 g，溶解在1000 mL蒸餾水中，pH 7.4-7.6。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的應(yīng)用，其特征在于:步驟2)所述LB培養(yǎng)基為:蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，溶解在1000 mL蒸餾水中，pH 7.0~7.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的應(yīng)用，其特征在于:步驟3)所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:木聚糖10.7 g，酵母粉5.6 g，蛋白胨2 g，NH4NO3 4 g, (NH4)2SO4 6 g, KH2PO4 0.9 g, MgSO4.7H20 I g, NaCl 5 g,蒸餾水 1000 mL, pH 自然。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高產(chǎn)耐高溫木聚糖酶的球狀芽孢桿菌在降解秸桿半纖維素中的應(yīng)用，其特征在于:將球狀賴氨酸芽孢桿菌Xyn-1發(fā)酵得到含耐高溫木聚糖酶的發(fā)酵液，以10(T150 IU/g半纖維素的酶解比例加入含耐高溫木聚糖酶的發(fā)酵液，在55°C條件下酶解72h。
【文檔編號(hào)】C12P19/14GK104031860SQ201410228680
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】賈紅華, 鐘超, 王春明, 王鳳學(xué), 韋萍 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)