具有改良特征的植物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于增強(qiáng)植物中多種經(jīng)濟(jì)重要特征的方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于改良產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，如通過(guò)調(diào)節(jié)編碼GRP(生長(zhǎng)相關(guān)蛋白質(zhì))多肽的核酸在植物中的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)產(chǎn)量和/或增強(qiáng)生長(zhǎng)、或改良植物中儲(chǔ)藏物含量。本方面還涉及具有編碼GRP多肽的核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物，所述植物相對(duì)于對(duì)照植物具有改良的特性。本發(fā)明還提供迄今未知的用于實(shí)施本發(fā)明方法的GRP編碼核酸，和包括此核酸的構(gòu)建體。
【專利說(shuō)明】具有改良特征的植物及其制備方法
[0001] 本申請(qǐng)為2007年8月2日提交的、發(fā)明名稱為"具有改良特征的植物及其制備方 法"的PCT申請(qǐng)PCT/EP2007/058043的分案申請(qǐng)，所述PCT申請(qǐng)進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的日期為 2009 年 4 月 1 日，申請(qǐng)?zhí)枮?200780036754. 0。
[0002] 本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于通過(guò)調(diào)節(jié)編碼GRP(生長(zhǎng)相關(guān)蛋 白）的核酸在植物中表達(dá)而改進(jìn)多種植物特征的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼GRP多肽的 核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物，其中所述植物相對(duì)于對(duì)應(yīng)野生型植物或其他對(duì)照植物具有改良 的特征。本發(fā)明還提供用于本發(fā)明方法中的構(gòu)建體。
[0003] 持續(xù)增長(zhǎng)的世界人口和農(nóng)業(yè)用可耕地供應(yīng)萎縮刺激了有關(guān)增加農(nóng)業(yè)效率的研究。 常規(guī)的作物及園藝學(xué)改良手段利用選擇育種技術(shù)以鑒定具有受歡迎特性的植物。然而，此 類選擇育種技術(shù)具有幾個(gè)缺陷，即這些技術(shù)一般耗費(fèi)很多勞動(dòng)并且產(chǎn)生這樣的植物，其經(jīng) 常含有異源性遺傳組分，其可能不總是導(dǎo)致從親代植物中傳遞的所希望性狀。分子生物學(xué) 進(jìn)展已經(jīng)允許人類改良動(dòng)物及植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程使得可以分離和操作遺傳物質(zhì) (一般處于DNA或RNA形式）并且隨后引入該遺傳物質(zhì)至植物中。此類技術(shù)具有產(chǎn)生具備 多種經(jīng)濟(jì)學(xué)、農(nóng)學(xué)或園藝學(xué)改良性狀的作物或植物的能力。
[0004] 具有特殊經(jīng)濟(jì)意義的性狀是增加的產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為來(lái)自作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的 可測(cè)量結(jié)果。該結(jié)果可以就數(shù)量和/或品質(zhì)方面進(jìn)行定義。產(chǎn)量直接取決于幾個(gè)因素，例 如器官的數(shù)目和大小、植物構(gòu)造（例如枝的數(shù)目）、種子產(chǎn)生、葉衰老等。根發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)物攝 入量、脅迫耐受性和早期萌發(fā)勢(shì)（early vigor)也可以是決定產(chǎn)量的重要因素。優(yōu)化前述 因素因而可以對(duì)增加作物產(chǎn)量有貢獻(xiàn)。
[0005] 種子產(chǎn)量是特別重要的性狀，因?yàn)楸姸嘀参锏姆N子對(duì)人與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)是重要的。作 物如玉米、稻、小麥、卡拉諾油菜和大豆占超過(guò)一半的人類總熱量攝入，無(wú)論通過(guò)直接消費(fèi) 種子本身或通過(guò)消費(fèi)基于加工的種子而產(chǎn)生的肉產(chǎn)品。作物也是糖、油及工業(yè)加工中所用 眾多類型代謝物的來(lái)源。種子含有胚（新苗和新根的起源）和胚乳（萌發(fā)期間及幼苗早期 生長(zhǎng)期間用于胚生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源）。種子發(fā)育涉及多種基因并且需要代謝物從根、葉和莖轉(zhuǎn) 移至正在生長(zhǎng)的種子中。胚乳尤其同化糖類、油和蛋白質(zhì)的代謝前體并且將它們合成為貯 藏大分子以灌滿籽粒。
[0006] 對(duì)于眾多作物的另一個(gè)重要性狀是早期萌發(fā)勢(shì)。改進(jìn)早期萌發(fā)勢(shì)是現(xiàn)代稻育種計(jì) 劃在溫帶和熱帶稻品種上的重要目標(biāo)。長(zhǎng)根在水栽稻中對(duì)于正確土壤固定是重要的。在將 稻直接播種至被淹沒(méi)田地的情況下，以及在植物必須從水中迅速出苗的情況下，較長(zhǎng)的苗 與萌發(fā)勢(shì)相關(guān)。在實(shí)施條播的情況下，較長(zhǎng)的中胚軸和胚芽鞘對(duì)于良好出苗是重要的。將 早期萌發(fā)勢(shì)人工改造到植物內(nèi)的能力將在農(nóng)業(yè)中是極其重要的。例如，不良的早期萌發(fā)勢(shì) 已經(jīng)限制了基于玉米帶種質(zhì)（Corn Belt germplasm)的玉米（Zea mayes L.)雜種在歐洲 大西洋地區(qū)的引種。
[0007] 另一個(gè)重要性狀是改進(jìn)的非生物脅迫耐受性。非生物脅迫是世界范圍作物 損失的主要原因，對(duì)于大多數(shù)主要作物植物而言降低平均產(chǎn)量超過(guò)50% (Wang等、 Planta(2003)218 :1-14)。非生物脅迫可以由干旱、鹽度、極端溫度、化學(xué)毒性和氧化脅迫引 起。提高植物對(duì)非生物脅迫耐受性的能力將在世界范圍對(duì)農(nóng)民是極大經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)并且會(huì)允許 在不利條件期間及在作物栽培否則是不可能的陸地上栽培作物。
[0008] 作物產(chǎn)量因而可以通過(guò)優(yōu)化前述因素之一而增加。
[0009] 取決于最終用途，對(duì)某些產(chǎn)量性狀的改良可能優(yōu)先于其他產(chǎn)量性狀。例如對(duì)于應(yīng) 用如飼料或木材生產(chǎn)或生物燃料資源而言，增加植物營(yíng)養(yǎng)體部分可能是希望的，而對(duì)于應(yīng) 用如面粉、淀粉或油生產(chǎn)而言，增加種子參數(shù)可能是尤其希望的。即便在種子參數(shù)當(dāng)中，某 些參數(shù)可以更優(yōu)先于其他參數(shù)，這取決于應(yīng)用。多種機(jī)制可以對(duì)增加種子產(chǎn)量有貢獻(xiàn)，無(wú)論 形式為增加的種子大小或是增加的種子數(shù)目。
[0010] 增加植物中產(chǎn)量（種子產(chǎn)量和/或生物量）的一種方法可以是通過(guò)調(diào)節(jié)植物的內(nèi) 在生長(zhǎng)機(jī)制如細(xì)胞周期或參與植物生長(zhǎng)或參與防御機(jī)制的多種信號(hào)途徑。
[0011] 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)調(diào)節(jié)植物中編碼GRP多肽的核酸在植物中表達(dá)而改進(jìn)植物中 的多種生長(zhǎng)特征。GRP多肽可以是如下蛋白之一：錨定蛋白-鋅指多肽（AZ)、SYT多肽，葉 綠體果糖-1，6-二磷酸酶（cpFBPase)多肽，小誘導(dǎo)性激酶（SIK)，II類同源域亮氨酸拉鏈 (HD Zip)轉(zhuǎn)錄因子，和SYB1多肽。改良的特征包括產(chǎn)量相關(guān)性狀，如增加的產(chǎn)量和/或增 加的生長(zhǎng)、或改良的儲(chǔ)藏化合物物含量。

【背景技術(shù)】
[0012] 錨定蛋白-鋅指多肽
[0013] 植物生物量為飼料作物如苜蓿、青貯谷物和干草的產(chǎn)量。在谷物作物中使用產(chǎn) 量的許多替代參數(shù)。其中首要的是估算植物大小。根據(jù)物種以及發(fā)育階段的不同，可以 通過(guò)許多方法測(cè)量植物大小，但是包括植物總干重、地上干重、地上鮮重、葉面積、莖體 積、植物高度、蓮座植物直徑、葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根生物量、分蘗數(shù)和葉數(shù)。許多物種在給定的 發(fā)育階段維持植物不同部分大小間的保守比。利用這些異速生長(zhǎng)關(guān)系而對(duì)這些有關(guān)大 小的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行由此及彼的外推（如Tittonell等2005Agric Ecosys&Environl05 : 213)。早期發(fā)育階段的植物大小通常將與晚期發(fā)育階段的植物大小有關(guān)。具有更大葉面 積的較大植物通常能夠比較小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重 更多（Fasoula&Tollenaar2005Maydica50 :39)。除了植物所具有的最初達(dá)到較大大小的 微環(huán)境或遺傳優(yōu)勢(shì)的潛在延續(xù)，此為其附加效應(yīng)。植物大小和生長(zhǎng)速率存在著強(qiáng)遺傳組 件（如ter Steege等2005Plant Physiologyl39:1078)，且迄今為止，種種多樣化基因 型植物在一種環(huán)境條件下的大小很可能與另一種環(huán)境條件下的大小有關(guān)（Hittalmani等 2003Theoretical Applied Geneticsl07:679)。以這種方式，使用標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境作為田地中作 物在不同時(shí)間和地點(diǎn)所遭遇的多樣化動(dòng)態(tài)環(huán)境的替代參數(shù)。
[0014] 收獲指數(shù)為種子產(chǎn)量與地上干重的比值，其在許多環(huán)境條件下相對(duì)穩(wěn)定，因此 在植物大小和谷物產(chǎn)量之間通常能夠獲得比較穩(wěn)固的相關(guān)性（如Rebetzke等2002Crop Science42 :739)。這些方法固有地聯(lián)系在一起，因?yàn)榇蠖鄶?shù)谷物生物量取決于植物葉和莖 當(dāng)前或C存的光合作用生產(chǎn)力（Gardener 等 1985Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press,pp68-73)。因此，對(duì)植物大小的選擇，甚至是在發(fā)育早期階段的選擇，已 經(jīng)用作為未來(lái)潛在產(chǎn)量的指標(biāo)（如Tittonell等2005Agric Ecosys&Environl05 :213)。當(dāng) 測(cè)試遺傳差異對(duì)脅迫耐受性的影響時(shí)，溫室或植物培養(yǎng)室與田地相比具有固有的優(yōu)勢(shì)：即 能夠使土壤性能、溫度、水和營(yíng)養(yǎng)的可用性以及光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。不過(guò)，因缺乏風(fēng)力或昆蟲導(dǎo) 致不良授粉，或由于空間不足以讓成熟根或冠層生長(zhǎng)等等，對(duì)產(chǎn)量造成的這些人工局限性 會(huì)限制這些控制環(huán)境在測(cè)試產(chǎn)量差異中的應(yīng)用。因此，在培養(yǎng)室或溫室標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)量早 期發(fā)育階段的植物大小，是提供潛在遺傳產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)方法。
[0015] 轉(zhuǎn)錄由RNA聚合酶進(jìn)行。這些聚合酶通常與決定轉(zhuǎn)錄過(guò)程特異性的其他蛋白 (轉(zhuǎn)錄因子）相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子與基因的順式調(diào)控元件結(jié)合且也可介導(dǎo)其他調(diào)節(jié)蛋白的結(jié) 合。Stegmaier等提出基于轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子的分類法?；谝韵碌?存在，區(qū)分出5個(gè)超級(jí)類（supperclass) :1)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)域、2)鋅協(xié)同結(jié)構(gòu)域、3)螺旋轉(zhuǎn)角 螺旋結(jié)構(gòu)域、4)具有小溝接觸的β支架結(jié)構(gòu)域和0)其他結(jié)構(gòu)域（Stegmaier等，Genome informaticsl5, 276-286, 2004)。包括鋅協(xié)同結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子組極其多樣且可根據(jù)其保 守的半胱氨酸和組氨酸殘基進(jìn)一步分類，包括WRKY結(jié)構(gòu)域、C6鋅聚簇、DM和GCM結(jié)構(gòu)域。
[0016] 除了 DNA結(jié)合基序，轉(zhuǎn)錄因子還可包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用基序。一種該基 序是錨蛋白基序。其出現(xiàn)在各種各樣的蛋白家族中，通常作為2到超過(guò)20個(gè)單位的重復(fù)。 每個(gè)單位包含兩個(gè)反向平行螺旋和β發(fā)夾。
[0017] 盡管許多具有鋅指結(jié)構(gòu)域的植物蛋白質(zhì)被充分表征，但對(duì)包含C3H1鋅指基序的 植物蛋白質(zhì)所知很少。據(jù)報(bào)道ΡΕΙ1是一種對(duì)胚胎發(fā)育起作用的轉(zhuǎn)錄因子，其具有與C3H1 基序相似的鋅指基序，但缺少錨蛋白基序（Li和Thomas，Plant CelllO, 383-398,1998)。 W002/44389描述了 AtSIZ，一種從擬南芥（Arabidopsis)中分離出來(lái)的轉(zhuǎn)錄因子。發(fā)現(xiàn)在 CaMV35S啟動(dòng)子控制下的AtSIZ表達(dá)促進(jìn)脅迫誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，且據(jù)報(bào)道具有增加的AtSIZ 表達(dá)的植物在鹽脅迫下與對(duì)照植物相比具有較高的存活率，但沒(méi)有提供有關(guān)種子產(chǎn)量的分 析。推斷AtSIZ可用于增加植物對(duì)滲透脅迫的抗性。
[0018] SYT
[0019] 非生物脅迫，如干旱脅迫、鹽脅迫、熱脅迫和冷脅迫、或這些脅迫中一種或多種的 組合，是植物生長(zhǎng)和生長(zhǎng)力的主要限制因素（Boyer(1982)Science218 :443-448)。干旱、 熱、冷和鹽脅迫具有對(duì)于植物生長(zhǎng)極為重要的共同主題，即水的可獲得性。因?yàn)橐恍┩寥?中的高鹽濃度將導(dǎo)致較少的可被細(xì)胞攝入的水，其效應(yīng)與在干旱條件下觀察到的相似。此 夕卜，在冰凍溫度下，由于始于質(zhì)外體（apoplast)中的冰的形成將導(dǎo)致水從共質(zhì)體流出， 由此造成植物細(xì)胞喪失水份（McKersie 和 Leshem，1994. Stress and Stress Coping in Cultivated Plants，Kluwer Academic Publishers)。在熱脅迫中，影響氣孔孔徑以通過(guò)蒸 發(fā)蒸騰作用調(diào)節(jié)冷卻，從而影響植物的水分含量。通常，植物對(duì)這些脅迫條件的每一種條件 的分子反應(yīng)機(jī)制是相似的。
[0020] 植物在其整個(gè)生活史中會(huì)暴露于減少的環(huán)境含水量的條件。大多數(shù)植物已進(jìn)化出 保護(hù)它們自己免受這些條件的傷害的策略。然而，如果干旱條件的嚴(yán)重度和持續(xù)時(shí)間太大， 對(duì)大多數(shù)農(nóng)作物植物的植物發(fā)育、生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響將是深遠(yuǎn)的。持續(xù)暴露于減少的環(huán)境 水可用性下造成植物新陳代謝的重大改變。新陳代謝的這些重大改變最終將導(dǎo)致細(xì)胞死 亡，因此而導(dǎo)致產(chǎn)量損失。由這些脅迫引起的主要農(nóng)作物例如稻、玉米（corn)和小麥的農(nóng) 作物損失和農(nóng)作物產(chǎn)量損失是重要的經(jīng)濟(jì)和政治因素并且在世界上許多地區(qū)造成了食物 短缺。
[0021] 非生物環(huán)境脅迫的另一實(shí)例是植物生長(zhǎng)和發(fā)育需要吸收的一種或更多營(yíng)養(yǎng)物的 減少的可用性。由于營(yíng)養(yǎng)利用效率對(duì)植物產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量的強(qiáng)力影響，大量的肥料施用到 田間，以優(yōu)化植物生長(zhǎng)和質(zhì)量。植物生產(chǎn)力受三種主要營(yíng)養(yǎng)物限制：磷、鉀和氮，它們通常是 植物生長(zhǎng)中的速率限制因素。植物生長(zhǎng)所需的主要營(yíng)養(yǎng)元素是氮（N)。它是生命細(xì)胞中發(fā) 現(xiàn)的包括氨基酸、蛋白質(zhì)（酶）、核酸和葉綠素的大量重要化合物的組分。植物干分的1. 5% 到2%是氮，且約所有植物蛋白質(zhì)的16%是氮。因此，氮的可用性是植物生長(zhǎng)和生產(chǎn)的主要 限制因素 （Frink 等（1999)Proc Natl Acad Sci 美國(guó) 96(4) :1175-1180)，且對(duì)蛋白積累和 氨基酸組成具有主要影響。因此，在氮限制條件下生長(zhǎng)時(shí)具有增加的產(chǎn)量的谷物非常有利。
[0022] 植物生物量為飼料作物如苜蓿、青貯谷物和干草的產(chǎn)量。在谷物作物中使用產(chǎn) 量的許多替代參數(shù)。其中首要的是估算植物大小。根據(jù)物種以及發(fā)育階段的不同，可以 通過(guò)許多方法測(cè)量植物大小，但是包括植物總干重、地上干重、地上鮮重、葉面積、莖體積、 植物高度、蓮座植物直徑、葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根生物量、分蘗數(shù)和葉數(shù)。許多物種在給定的發(fā)育 階段維持植物不同部分大小間的保守比。利用這些異速生長(zhǎng)關(guān)系而對(duì)這些有關(guān)大小的測(cè) 量結(jié)果進(jìn)行由此及彼的外推（如 Tittonell 等（2005)Agric Ecosys&Environl05 :213)。 早期發(fā)育階段的植物大小通常將與晚期發(fā)育階段的植物大小有關(guān)。具有更大葉面積的 較大植物通常能夠比較小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多 (Fasoula&Tollenaar(2005)Maydica50 :39)。除了植物所具有的最初達(dá)到較大大小的微環(huán) 境或遺傳優(yōu)勢(shì)的潛在延續(xù)，此為其附加效應(yīng)。植物大小和生長(zhǎng)速率存在著強(qiáng)遺傳組件（如 ter Steege等（2005)Plant Physiologyl39:1078)，且迄今為止，種種多樣化基因型植物 在一種環(huán)境條件下的大小很可能與另一種環(huán)境條件下的大小有關(guān)（Hittalmani等（2003) Theoretical Applied Geneticsl07:679)。以這種方式，使用標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境作為田地中作物在 不同時(shí)間和地點(diǎn)所遭遇的多樣化動(dòng)態(tài)環(huán)境的替代參數(shù)。
[0023] 發(fā)展耐受脅迫的植物是可能解決或調(diào)解至少一些此類問(wèn)題的策略（McKersie和 Leshem, (1994)Stress and Stress Coping in Cultivated Plants, Kluwer Academic Publishers)。然而，發(fā)展對(duì)此類脅迫呈現(xiàn)抗性（耐受性）的新植物品系的常規(guī)植物育種策 略是相對(duì)緩慢的且需要特定的抗性系以與希望的系進(jìn)行雜交。有限的脅迫耐性種質(zhì)資源以 及遠(yuǎn)源植物物種之間的雜交不相容性是常規(guī)育種中遇到的重大問(wèn)題。然而，這些技術(shù)通常 是勞動(dòng)密集型的，并且產(chǎn)生通常含有從親本植物遺傳的異源遺傳組分的植物，這些遺傳組 分并非總是產(chǎn)生父系期望性狀。分子生物學(xué)的進(jìn)展已經(jīng)允許人類改造動(dòng)物和植物的生殖質(zhì) (germplasm)。植物遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)（通常為DNA或RNA的形式）及隨 后將所述遺傳物質(zhì)引入植物。這樣的技術(shù)能夠提供具有多種改良的經(jīng)濟(jì)、農(nóng)業(yè)或園藝性狀 的作物或植物。
[0024] SYT為轉(zhuǎn)錄共激活劑，在植物中，其與GRF(生長(zhǎng)調(diào)控因子）家族蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄激 活劑形成功能復(fù)合物（Kim HJ，Kende H(2004)Proc Nat Acad SclOl :13374-9)。SYT 在 本文中也稱為GIF，為GRF相互作用因子但RF-interacting factor)的縮寫，和AN3為 angustifolia3 的縮寫，在 Horiguchi 等（2005)Plant J43:68_78 中。GRF 轉(zhuǎn)錄激活劑與 酵母染色質(zhì)重塑復(fù)合物的SWI/SNF蛋白質(zhì)共享結(jié)構(gòu)域（在N末端區(qū)域）（van der Knaap E 等，（2000)Plant Physl22 :695-704)。認(rèn)為這些復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄共激活劑參與將SWI/SNF復(fù) 合物募集至增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域，以實(shí)現(xiàn)局部染色質(zhì)重塑（--ΓΑΜ等綜述，（2001)Annu Rev Bi〇Chem70 :475-501)。局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活。更準(zhǔn)確地說(shuō)，認(rèn)為SYT 與植物SWI/SNF復(fù)合物相互作用，以實(shí)現(xiàn)GRF靶基因的轉(zhuǎn)錄激活（Kim HJ，Kende H(2004) Proc Nat Acad SclOl :13374-9)。
[0025] SYT屬于擬南芥中由三個(gè)成員組成的基因家族。所述SYT多肽與人SYT具有同源 性。已顯示人SYT多肽為轉(zhuǎn)錄共激活劑（Thaete等（1999)Hum Molec Genet8:585-591)。 如下三個(gè)結(jié)構(gòu)域表征了哺乳動(dòng)物SYT多肽：
[0026] (i)N末端SNH(SYT的N末端同源）結(jié)構(gòu)域，在哺乳動(dòng)物、植物、線蟲和魚類中是保 守的；
[0027] (ii)C末端QPGY富含結(jié)構(gòu)域，主要由甘氨酸、脯氨酸、谷酰胺和酪氨酸組成，以不 定的間隔出現(xiàn)；
[0028] (iii)位于前述兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的甲硫氨酸富含（富含Met)結(jié)構(gòu)域。
[0029] 在植物SYT多肽中，SNH結(jié)構(gòu)域充分保守。C末端結(jié)構(gòu)域富含甘氨酸和谷酰胺，但 并不富含脯氨酸或酪氨酸。因此其被命名為富含QG結(jié)構(gòu)域，與哺乳動(dòng)物的QPGY結(jié)構(gòu)域形 成對(duì)照。同哺乳動(dòng)物SYT-樣，在QG結(jié)構(gòu)域N末端可以鑒定到富含Met結(jié)構(gòu)域。富含QG 結(jié)構(gòu)域可視為基本上是多肽C末端的剩余部分（除去SHN結(jié)構(gòu)域）；富含Met結(jié)構(gòu)域通常 包含在富含QG結(jié)構(gòu)域的頭一半之內(nèi)（從N末端到C末端的方向）?？赡苡械诙缓琈et結(jié) 構(gòu)域位于植物SYT多肽SNH結(jié)構(gòu)域之前（見圖1)。
[0030] 據(jù)報(bào)道，喪失功能的SYT突變體以及SYT表達(dá)降低的轉(zhuǎn)基因植物發(fā)育出小且 窄的葉子和花瓣，它們具有較少的細(xì)胞（Kim HJ，Kende H(2004)Proc Nat Acad SclOl: 13374-9)。
[0031] 擬南芥中AN3超量表達(dá)產(chǎn)生的植物具有的葉比野生型的葉大20-30% (Horiguchi 等，（2005)Plant J43 :68-78)。
[0032] 日本專利申請(qǐng)2004-350553中描述了通過(guò)控制AN3基因表達(dá)來(lái)控制水平方向上葉 大小的方法。
[0033] cpFBPase
[0034] 收獲指數(shù)為種子產(chǎn)量與地上干重的比值，其在許多環(huán)境條件下相對(duì)穩(wěn)定，因此 在植物大小和谷物產(chǎn)量之間通常能夠獲得比較穩(wěn)固的相關(guān)性（如Rebetzke等2002Crop Scien ce42 :739)。這些方法本身聯(lián)系在一起，因?yàn)榇蠖鄶?shù)谷物生物量取決于植物葉和莖當(dāng) 前或C存的光合作用生產(chǎn)力（Gardener 等 1985Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press,pp68-73)。因此，對(duì)植物大小的選擇，甚至是在發(fā)育早期階段的選擇，已 經(jīng)用作為未來(lái)潛在產(chǎn)量的指標(biāo)（如Tittonell等2005Agric Ecosys&Environl05 :213)。當(dāng) 測(cè)試遺傳差異對(duì)脅迫耐受性的影響時(shí)，溫室或植物培養(yǎng)室與田地相比具有固有的優(yōu)勢(shì)：即 能夠使土壤性能、溫度、水和營(yíng)養(yǎng)的可用性以及光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。不過(guò)，因缺乏風(fēng)力或昆蟲導(dǎo) 致不良授粉，或由于空間不足以讓成熟根或冠層生長(zhǎng)等等，對(duì)產(chǎn)量造成的這些人工局限性 會(huì)限制這些控制環(huán)境在測(cè)試產(chǎn)量差異中的應(yīng)用。因此，在培養(yǎng)室或溫室標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)量早 期發(fā)育階段的植物大小，是提供潛在遺傳產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)方法。
[0035] 高等植物中光合碳代謝是植物生長(zhǎng)和谷物產(chǎn)量的主要過(guò)程。通過(guò)還原戊糖磷酸 (卡爾文，Calvin)途徑固定大氣二氧化碳在高等植物中產(chǎn)生碳水化合物。此過(guò)程發(fā)生在葉 綠體中，且新合成的丙糖磷酸可至于淀粉合成的基質(zhì)區(qū)室中，或可輸出到蔗糖形成的細(xì)胞 膠質(zhì)中。在光合作用中，新合成的碳水化合物根據(jù)植物的需要和環(huán)境條件形成（channel) 一種或其他形式。
[0036] 卡爾文循環(huán)是復(fù)雜的途徑，包括由11種酶催化的13個(gè)反應(yīng)的三個(gè)階段。一種更重 要的酶是葉綠體果糖 -1，6-二磷酸酶（cpFBPase)，其催化果糖-1,6-二磷酸至果糖-6-磷 酸和Pi (無(wú)機(jī)P)的不可逆轉(zhuǎn)化。與卡爾文循環(huán)的其他酶相比，cpFBPase多肽在葉綠體中 的水平非常低。
[0037] 借助鐵氧化還原蛋白-硫氧化還原蛋白系統(tǒng)由氧化還原電位調(diào)控cpFBPase活性， 所述系統(tǒng)根據(jù)光照/黑暗條件，和pH值和Mg 2+水平上的光依賴性變化調(diào)節(jié)酶活性（Chiadmi 等，（1999)EMB018(23) :6809-6815)。更具體地，cpFBPase多肽在光照下是有活性的，且在 黑暗中是無(wú)活性的，這通過(guò)硫氧化還原蛋白介導(dǎo)的酶分子SH組間還原-氧化互動(dòng)且也借助 葉綠體基質(zhì)中pH值和Mg 2+濃度受光線誘導(dǎo)升高而發(fā)生（Buchanan(1980)Annu Rev Plant Physiol31 :341-374 ;Jacquot (1984) Bot Actal03 :323-334)。
[0038] 高等植物和藻類cpFBPase多肽執(zhí)行同一酶催化步驟，但在酶催化活性調(diào)節(jié)中 稍有不同。更具體地，藻類cpFBPase多肽嚴(yán)格要求還原而具有活性，但對(duì)還原劑特異性 要求不太嚴(yán)格，即，它們可由不同質(zhì)體硫氧化還原蛋白激活（Huppe和Buchanan (1989) Z Naturforsch44(5-6) :487-94).
[0039] 光合（自養(yǎng)）細(xì)胞中，除了 cpFBPase多肽，還有位于細(xì)胞溶膠（cyFBPase)中且參 與蔗糖合成和糖異生的第二FBPase多肽（同種型）。與cpFBPase多肽相比，cyFBPase多 肽具有非常不同的調(diào)控特性：其被過(guò)量底物抑制，通過(guò)AMP和果糖-2,6-二磷酸顯示變構(gòu)抑 制，且呈現(xiàn)中性pH最適宜。在異養(yǎng)系統(tǒng)（如動(dòng)物細(xì)胞）中發(fā)現(xiàn)cyFBPase多肽。cpFBPase 多肽和cyFBPase多肽間的主要區(qū)別是前者中具有氨基酸插入，所述氨基酸插入至少具有 兩個(gè)保守半胱氨酸殘基，所述半胱氨酸殘基是硫氧化還原蛋白調(diào)控的目標(biāo)。
[0040] 在塊莖特異性啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)馬鈴薯cyFBPase核酸序列的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植 物已有報(bào)道（Thorbjornsen等，（2002)Planta214 :616-624)。作者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因塊莖在淀粉 含量方面、或中性糖和磷酸化hexoses方面與野生型塊莖沒(méi)有區(qū)別。
[0041] 來(lái)自藍(lán)細(xì)菌（cyanobacterium Synechococcus) (FBPase/SBPase 和 FBPasell)的 兩個(gè)cyFBPase編碼基因有效連接于葉綠體亞細(xì)胞祀向嵌合蛋白質(zhì)的番爺rbcS轉(zhuǎn)運(yùn)肽編 碼序列（Miyagawa 等，（2001)Nature Biotechl9 :965-969 ;Tamoi 等，（2006)Plant Cell Physiol47 (3) :380-390)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)FBPase/SBPase和FBPasell多肽的活性由鐵氧化還原 蛋白/硫氧化還原蛋白系統(tǒng)的氧化還原條件調(diào)節(jié)，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈ΡＪ匕腚装彼釟埢?。使?番茄rbcS啟動(dòng)子調(diào)控兩個(gè)嵌合基因的表達(dá)。已報(bào)道用嵌合構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草植物 在大氣條件下比野生型植物生長(zhǎng)的明顯更快且更大。
[0042] SIK
[0043] 植物培育者通常根據(jù)所論作物或植物的改良產(chǎn)量的特定方面、和具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的 植物或作物的部分感興趣。例如，對(duì)特定植物、或特定最終用途，植物培育者可以特別地在 植物一個(gè)或多個(gè)部分的植物生物量（重量）方面尋找改良，所述部分包括地上（可收獲） 部分和/或地下（可收獲）部分。尤其有關(guān)的是供消費(fèi)的是植物地上部分或地下部分。對(duì) 許多作物而言，尤其是谷物，種子產(chǎn)量的改良是極其需要的。增加的種子產(chǎn)量本身可以表現(xiàn) 為多種方式，取決于所論作物或植物和其最終用途，種子產(chǎn)量的每個(gè)獨(dú)立方面對(duì)植物培育 者具有變化的重要性。例如種子產(chǎn)量可以表現(xiàn)為或來(lái)自：a)種子生物量（種子總重量）增 力口，這可以基于單粒種子和/或每株植物和/或每平方米；b)每株植物增加的花數(shù)；c)增加 的（飽滿）種子數(shù)；d)增加的種子飽滿率（其通常表述為飽滿種子數(shù)與種子總數(shù)之間的比 率）；e)增加的收獲指數(shù)，其通常表述為可收獲部分（如種子）產(chǎn)量與總生物量的比率；和 f)增加的千粒重（TKW)，這通常從計(jì)數(shù)的飽滿種子數(shù)及其總重量外推而來(lái)。
[0044] 種子產(chǎn)量的增加也可以表現(xiàn)為種子大小和/或種子體積的增加。此外，種子產(chǎn)量 的增加本身也可以自我表現(xiàn)為種子面積和/或種子長(zhǎng)度和/或種子寬度和/或種子周長(zhǎng)的 增加。增加的產(chǎn)量也可以產(chǎn)生改良的結(jié)構(gòu)，或可以因改良的結(jié)構(gòu)而出現(xiàn)。
[0045] 以玉米為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為下列一種或多種指標(biāo)：每平方米植物數(shù)的增加、 每株植物穗數(shù)的增加、行數(shù)的增加、每行粒數(shù)、粒重、千粒重、穗長(zhǎng)度/直徑、種子飽滿率的 增加（其中種子飽滿率是飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)及其他。以稻為例，產(chǎn)量增 加本身可以表現(xiàn)為下列一種或多種指標(biāo)的增加：每平方米植物數(shù)、每株植物圓錐花序數(shù)、每 圓錐花序小穗數(shù)、每圓錐花序花（小花）數(shù)（其表達(dá)為飽滿種子數(shù)對(duì)原圓錐花序數(shù)之比）、 種子飽滿率的增加（其中種子飽滿率是飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)、千粒重的增 加及其他。
[0046] 對(duì)植物培育者來(lái)說(shuō)，能夠挑選到要被改變的種子產(chǎn)量的方面非常有利。非常期望 能夠非定制的挑出，即挑出適合改變種子產(chǎn)量的特定方面或組分的基因。例如與增加的千 粒重組合的飽滿率的增加對(duì)作物如玉米是非常期望的。對(duì)稻和小麥增加的飽滿率、收獲指 數(shù)和增加的千粒重的組合是非常期望的。
[0047] Genomine Inc.的公開的國(guó)際專利申請(qǐng)W002/074801描述了來(lái)自擬南芥 (Arabidopsis thaliana)的AtSIK蛋白質(zhì)和編碼所述蛋白質(zhì)的基因。其提到可以通過(guò)抑制 AtSIK的表達(dá)使植物對(duì)滲透脅迫具有抗性。然而沒(méi)有提到通過(guò)抑制AtSIK的表達(dá)可以改良 那些產(chǎn)量方面。
[0048] HD Zip
[0049] 植物的研究和基因操縱具有長(zhǎng)遠(yuǎn)歷史，其甚至在著名的Gregor Mendel研究之前 就開始了。在完善該科學(xué)中，科學(xué)家完成了植物中特定性狀的改良，所述性狀涵蓋具有增 加的淀粉含量的馬鈴薯塊莖和具有增加的或改變的脂肪酸含量的油籽植物如卡諾拉油菜 和向日葵。隨著增加的植物油消費(fèi)和使用，種子油含量和種子油水平的改良日益普遍（如 Tiipfer等，，1995, Science268 :681-686)。在轉(zhuǎn)基因植物中操縱生物合成途徑為分子生 物學(xué)家和植物生化學(xué)家提供了大量機(jī)會(huì)去影響植物新陳代謝，以引起特定更高價(jià)值產(chǎn)品的 產(chǎn)生。種子油的產(chǎn)生或合成（composition)已在大量傳統(tǒng)油籽植物如大豆（美國(guó)專利第 5, 955, 650號(hào)）、卡諾拉油菜（美國(guó)專利第5, 955, 650號(hào)）、向日葵（美國(guó)專利第6, 084, 164 號(hào)）、油菜（ TUpfer等，1995, Science268 :681-686)、和非傳統(tǒng)油子植物如煙草（Cahoon 等，1992, Proc. Natl. Acad. Sci.美國(guó) 89 :11184-11188)中改變。
[0050] 植物種子油包括中性和極性脂質(zhì)（見表1)。中性脂質(zhì)主要含有三酰甘油，其是在 種子油體中積累的主要儲(chǔ)藏脂質(zhì)。極性脂質(zhì)主要在種子細(xì)胞的各種膜中發(fā)現(xiàn)，如微粒體、質(zhì) 體、和線粒體膜和細(xì)胞膜。中性和極性脂質(zhì)含有幾種常見的脂肪酸（見表2)和一系列不 太常見的脂肪酸。膜脂質(zhì)的脂肪酸合成被高度調(diào)節(jié)且只有少量的脂肪酸在膜脂質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。 另一方面，可將大量非常規(guī)脂肪酸整合到許多植物物種種子中的中性儲(chǔ)藏脂質(zhì)中（Van de Loo F. J.等，1993,Unusual Fatty Acids in Lipid Metabolism in Plants,第91-126頁(yè)， TS Moore 編著，Jr. CRC 出版；Millar 等，2000, Trends Plant Sci. 5 :95-101)。
[0051] 表1植物脂質(zhì)的分類
[0052]

【權(quán)利要求】
1.相對(duì)于對(duì)照植物改良植物產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其中 當(dāng)所述改良產(chǎn)量相關(guān)性狀為在非生物脅迫下增加植物產(chǎn)量時(shí)，所述方法包括調(diào)節(jié)編碼 滑膜肉瘤轉(zhuǎn)運(yùn)（SYT)多肽的核酸序列在植物中的表達(dá)，和任選地選擇具有增加的產(chǎn)量的植 物，其中所述SYT多肽從N末端到C末端包含：（i)按照增加的優(yōu)選順序，與SNH結(jié)構(gòu)域SEQ ID NO :58 具有至少 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的5見1結(jié) 構(gòu)域；和（ii)富含Met結(jié)構(gòu)域；和（iii)富含QG結(jié)構(gòu)域； 當(dāng)所述改良產(chǎn)量相關(guān)性狀為增加植物產(chǎn)量時(shí)，所述方法包括增加編碼cpFBPase多 肽的核酸序列在植物地上部分中的表達(dá)，和任選地選擇具有增加的產(chǎn)量的植物，其中所述 cpFBPase多肽在葉綠體中發(fā)揮功能且包含：（i)至少一個(gè)FBPase結(jié)構(gòu)域；和（ii)至少一個(gè) 氧化還原調(diào)控插入片段； 當(dāng)所述改良產(chǎn)量相關(guān)性狀為增加每株植物花數(shù)時(shí)，所述方法包括調(diào)節(jié)小誘導(dǎo)性激酶 (SIK)核酸和/或SIK多肽在植物中的表達(dá)，其中所述受調(diào)節(jié)的表達(dá)包括編碼SIK多肽的 核酸在植物中的超量表達(dá)；或者當(dāng)所述改良產(chǎn)量相關(guān)性狀為增加千粒重（TKW)、增加收獲 指數(shù)（HI)和增加飽滿率中的一種或多種，所述方法包括調(diào)節(jié)小誘導(dǎo)性激酶（SIK)核酸和/ 或SIK多肽在植物中的表達(dá)，其中所述受調(diào)節(jié)的表達(dá)包括減少或基本去除內(nèi)源SIK基因在 植物中的表達(dá)； 當(dāng)所述改良產(chǎn)量相關(guān)性狀是改良種子中儲(chǔ)藏物含量時(shí)，所述方法包括調(diào)節(jié)II類 HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子的編碼核酸在植物中的表達(dá)； 所述方法包括調(diào)節(jié)編碼SYB1蛋白質(zhì)的核酸在植物中的表達(dá)，其中所述SYB1蛋白質(zhì)的 序列包括3個(gè)RanBP型鋅指結(jié)構(gòu)域和任選地一個(gè)或多個(gè)低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域，但沒(méi)有與所述鋅 指結(jié)構(gòu)域不重疊的其他結(jié)構(gòu)域；或者 當(dāng)所述改良產(chǎn)量相關(guān)性狀是增加植物的種子產(chǎn)量時(shí)，所述方法包括調(diào)節(jié)編碼AZ多肽 的核酸在植物中的表達(dá)，和任選地選擇具有增加的產(chǎn)量的植物，其中所述AZ多肽包含至少 一個(gè)錨蛋白重復(fù)和至少一個(gè)C3H1鋅指結(jié)構(gòu)域。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104099368SQ201410229660
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2007年8月2日 優(yōu)先權(quán)日:2006年8月2日
【發(fā)明者】V·弗蘭卡德, V·米隆諾弗, C·勒佐, A·I·桑茲莫林納羅 申請(qǐng)人:克羅普迪塞恩股份有限公司