一種基因載體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基因載體及其制備方法和應用。該基因載體包括作為核心的金屬納米顆粒以及連接在金屬納米顆粒表面的陽性聚合物，該陽性聚合物為多聚賴氨酸。本發(fā)明還公開了基因載體的制備方法及其在表皮干細胞轉染中的應用。本發(fā)明的基因載體通過多聚賴氨酸、穿膜肽與金屬納米顆粒的連接，提高了基因載體的轉染效率、降低了其對細胞毒性的影響，有效地利用了多聚賴氨酸的低毒特性，并成功優(yōu)化了多聚賴氨酸的低轉染效率特性。
【專利說明】一種基因載體及其制備方法和應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學【技術領域】，尤其涉及一種含金屬納米材料和陽離子聚合物的基因載體及其制備方法和應用。

【背景技術】
[0002]近年來，隨著人類基因組計劃的進展及對功能基因的不斷探索，基因治療的研究受到越來越多人的關注，基因治療自20世紀八十年代進入臨床試驗以來，其應用已從遺傳性病癥的治療擴展到獲得性疾病的防治，如組織工程與再生醫(yī)學等。對于基因重組及基因轉染而言，安全性好且能產(chǎn)生基因高效、定位表達的載體是構建載體的關鍵所在。
[0003]目前常用的基因轉染載體有病毒型和非病毒型兩種。病毒載體有高效傳遞和表達基因的能力，但存在制備復雜、生物安全性低和非導向性的特點。對于創(chuàng)傷、燒傷、輻射等非內(nèi)源性疾病導致的急性皮膚損傷，病毒載體轉染后，目標基因在宿主體內(nèi)長時間的高效表達在組織修復以后會給機體帶來不利的影響和潛在的致癌風險。相比之下，非病毒載體介導外源性基因瞬時表達的特點更適于急性創(chuàng)傷的基因給藥。此外，低毒、低免疫原性、相對靶向性和制備簡單等優(yōu)點也使非病毒載體的應用越來越廣。但與病毒載體不同，結構簡單的非病毒載體很難幫助基因穿過從細胞外到細胞內(nèi)的所有屏障從而實現(xiàn)基因的高效表達。傳遞效率低，基因表達不穩(wěn)定是非病毒載體應用過程中亟待解決的問題。
[0004]公布號為CN103320471A的專利文獻公開了一種非病毒基因載體，包括超支化乙烯亞胺、金銀合金納米顆粒；所述金銀合金納米顆粒以硫金鍵和硫銀鍵與超支化聚乙烯亞胺結合。本發(fā)明提供的非病毒基因載體能夠與基因物質較好的復合，將基因物質導入細胞進行表達，并實現(xiàn)治療的目的。該發(fā)明中的超支化聚乙烯亞胺與基因物質能夠良好的復合，且金銀合金納米顆粒能夠促進基因的轉染，提高了基因的轉染效率。
[0005]上述專利文獻所公開的非病毒基因載體雖然能夠提高基因的轉染效率，但其生物毒性卻較高。以聚乙亞胺為材料合成的載體雖然能夠顯著提高轉染效率，但由于該材料容易被細胞內(nèi)的酶類分解產(chǎn)生有毒物質，所以具有較高細胞毒性。因此如何能夠在保證基因載體具有高轉染率的同時降低細胞毒性是一個非常重要的研究課題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對目前現(xiàn)有技術中的不足之處，提供一種轉染效率高、毒性低的基因載體。
[0007]本發(fā)明提供了一種基因載體，包括作為核心的金屬納米顆粒以及連接在金屬納米顆粒表面的陽性聚合物，所述陽性聚合物為多聚賴氨酸。
[0008]多聚賴氨酸(PLL)是一種陽離子聚合物材料，其作為基因載體組成部分，能夠在正負電荷相互吸引的靜電作用下，與帶負電荷的DNA分子結合，可以將質粒由幾百納米的松散線性分子壓縮成直徑數(shù)十納米的致密顆粒。并且，與其它基因轉染試劑相比，多聚賴氨酸擁有較高的生物相容性、具有較低的細胞毒性。
[0009]所述基因載體的粒徑為13~37nm，表面電荷為23~30mV。
[0010]多聚賴氨酸的分子量影響基因載體及DNA復合物的粒徑，分子量過大會導致復合物無法穿過細胞膜，所述多聚賴氨酸的分子量選用60000~300000道爾頓較為適宜。
[0011]穿膜肽(TAT)是一些具有細胞膜穿透能力的小分子多肽，可攜帶比其分子量大100倍的外源性疏水大分子進入細胞，毒副作用小。因此優(yōu)選的，所述金屬納米顆粒表面連接有穿膜肽。
[0012]穿膜肽的分子量及數(shù)量影響基因載體的轉染效率，所述穿膜肽的分子量優(yōu)選為100~10000道爾頓；所述穿膜肽與金屬納米顆粒的質量比優(yōu)選為0.5~100。
[0013]所述穿膜肽的氨基酸序列為CCYGRKKRRQRRR，該氨基酸序列的穿膜肽能夠高效地幫助基因載體穿透細胞膜，從而提高整個基因載體的轉染效率。
[0014]所述金屬納米顆粒為金納米顆粒或銀納米顆粒；金納米顆粒(Au)和銀納米顆粒(Ag)，具有獨特的物理化學特性，如粒徑小、光學特性、比表面積和表面電荷高、易于修飾等優(yōu)勢，以它們作為核心，與陽性聚合物連接，能夠顯著提高基因載體的轉染效率。
[0015]本發(fā)明還提供了一種基因載體的制備方法，包括:
[0016]將多聚賴氨酸加入金屬離子溶液中混合均勻，然后在攪拌條件下加入還原劑進行氧化還原反應，反應完成后從反應液中分離獲得所述基因載體。
[0017]所述的還原劑為NaBH4 ;所述的金屬離子溶液分別為HAuCl4溶液或AgNO3溶液。
[0018]所述制備方法中多聚賴氨酸與HAuCl4溶液或AgNO3溶液的反應時間為0.5-100h,反應溫度為10-200°C。
[0019]所述制備方法中分離純化的方法為超濾管離心分離反應液，去除游離的多聚賴氨酸與穿膜肽，得到純化的基因載體。此外，也可采用透析袋進行基因載體的分離純化。
[0020]所述超濾管的分子量為1-100萬；所述離心的轉速為100-10000rpm，離心時間為10-1000 分鐘。
[0021]本發(fā)明還提供了一種基因載體與DNA形成的復合物。
[0022]所述復合物中基因載體和DNA的質量比為1:1~10:1，其中，Au-PLL基因載體和Au-PLL-TAT基因載體與DNA的質量比為10: I時轉化效率最高；Ag_PLL基因載體和Ag-PLL-TAT基因載體與DNA的質量比為7: I時轉化效率最高。
[0023]所述復合物的粒徑為100~170nm，表面電荷為20~40mV。
[0024]本發(fā)明還提供了一種所述復合物的制備方法，包括以下步驟:
[0025](I)分別配制基因載體溶液和DNA溶液；
[0026](2)基因載體溶液和DNA溶液等體積渦旋混勻，室溫放置后，加入等體積5%蔗糖溶液。
[0027]所述DNA為任何可在真核細胞表達的質粒DNA。
[0028]本發(fā)明還提供了所述的基因載體在表皮干細胞轉染中的應用。
[0029]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0030](I)本發(fā)明使用陽離子聚合物多聚賴氨酸與金屬納米顆粒連接，利用多聚賴氨酸生物相容性好的特點，顯著降低了基因載體的毒性，并且通過將多聚賴氨酸連接在金屬納米顆粒表面，克服了多聚賴氨酸單獨作為基因載體轉染效率低的缺陷。
[0031](2)本發(fā)明中金屬納米顆粒除連有多聚賴氨酸外，還連接了穿膜能力強的穿膜肽，大大的提聞了基因載體的穿I旲能力，進而提聞了基因載體的轉染效率。
[0032](3)本發(fā)明將金屬納米材料、多聚賴氨酸和穿膜肽三者有效連接，顯著提高了基因載體在表皮干細胞中的轉染效率，降低了其對細胞的毒性影響。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為本發(fā)明的基因載體的透射電子顯微鏡結構示意圖；
[0034]a =Au-PLL 基因載體；b =Ag-PLL 基因載體；c =Au-PLL-TAT 基因載體；d:Ag-PLL-TAT基因載體。

【具體實施方式】
[0035]表皮干細胞的制備
[0036]I)取下大鼠背部、頭部皮膚，去除脂肪、血絲，剪成長1.5cm、寬2mm的大鼠皮條；
[0037]2)用普通D-Hanks (無鈣鎂離子的磷酸緩沖鹽溶液，北京弘博康醫(yī)藥科技有限公司)，清洗3次，20mL/次，每次清洗3分鐘；
[0038]3)再用高抗D-Hanks (高抗D-Hanks由普通D-Hanks溶液與雙抗溶液混合得到，其中，混合時，普通D-Hanks溶液與雙抗溶液的體積比為100: 4，雙抗為青霉素和鏈霉素這兩種抗生素，雙抗溶液購自于Gibico，Brl，USA)浸泡150分鐘；
[0039]4)放入含dis pasell中性蛋白酶(購自于Gibico，Brl, USA)重量百分含量為
0.25 %的中性蛋白酶水溶液，中性蛋白酶水溶液的體積為浸沒大鼠皮條，在4°C過夜放置15小時；
[0040]5)過夜放置后，用鑷子輕輕將表皮剝離下來；
[0041]6)用含胎牛血清的DMEM低糖/F12培養(yǎng)液(含胎牛血清的DMEM低糖/F12培養(yǎng)液由重量百分含量為60%的DMEM低糖培養(yǎng)液、重量百分含量為30%的F12培養(yǎng)液和重量百分含量為10%的胎牛血清混合得到，其中，DMEM低糖培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液和胎牛血清均購自于Gibico，Brl，USA)將含胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)重量百分含量為
0.25%的胰酶細胞消化液(胰酶細胞消化液由胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶解于pH = 7.4的磷酸緩沖液得到)稀釋至0.02%，得到含Trypsin-EDTA重量百分含量為0.02%的胰酶細胞消化液；
[0042]向含Trypsin-EDTA重量百分含量為0.05%的胰酶細胞消化液中加入步驟5)中剝離下來的表皮，含Trypsin-EDTA重量百分含量為0.05 %的胰酶細胞消化液浸沒剝離下米的表皮，在37°C消化分離表皮5分鐘；
[0043]7)用15mL離心管輕輕震蕩5分鐘，反復吹打；
[0044]8)用PBS溶液反復沖洗4次，并依次過200目和300目篩選，在100rpm離心3分鐘；
[0045]9)用細胞計數(shù)器(北京卓川電子科技有限公司)計數(shù)細胞密度；
[0046]10)用DMEM低糖/F12培養(yǎng)液(DMEM低糖/F12培養(yǎng)液由重量比為2:1的DMEM低糖培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液組成，DMEM低糖培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液均購自于Gibico，Brl, USA)將細胞重懸，調(diào)整細胞密度至5X 15個/mL，并注入培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)瓶采用含IV型膠原蛋白和醋酸的水溶液預包被，含IV型膠原蛋白和醋酸的水溶液中IV型膠原蛋白的重量百分含量為0.01%，含IV型膠原蛋白和醋酸的水溶液中醋酸的重量百分含量為0.1% );靜置10分鐘后，棄去上清液，換新鮮DMEM低糖/F12培養(yǎng)液，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每一天換一次液，第8天時細胞達到80%的融合，形成消化細胞，用于細胞毒性試驗與細胞轉染試驗。
[0047]實施例1:含金納米顆粒和多聚賴氨酸(Au-PLL)的基因載體
[0048]一、Au-PLL基因載體的制備
[0049]將PLL 加入 1mLlmM(410 μ g/mL)的 HAuCl4 溶液中，使 PLL 濃度達到 5mg/mL，室溫下攪拌20min,使其充分混合。在劇烈攪拌下，加入40 μ L的NaBH4 (0.lM4mg/mL)直至溶液立即變紅色，再繼續(xù)攪拌30min。采用分子量為10萬的超濾離心管將所得膠體溶液在3000rpm條件下離心30min，即得Au-PLL基因載體。所制備的Au-PLL基因載體粒徑為
12.25±0.3nm,表面電荷為 23±1.5mV。
[0050]二、Au-PLL基因載體與質粒DNA結合的復合物(Au-PLL-DNA)的制備
[0051]將Au-PLL基因載體與DNA以不同質量比(詳見表1)等體積(載體溶液與DNA溶液各?ο μ L)混合，共孵育15分鐘，再加入等體積的5 %蔗糖溶液，過0.8 μ m濾膜即得Au-PLL-DNA復合物。所得Au-PLL-DNA復合物的粒徑與表面電荷如下:
[0052]表1基因載體與DNA的不同質量比下Au-PLL-DNA復合物的粒徑大小和表面電荷值。
[0053]

【權利要求】
1.一種基因載體，包括作為核心的金屬納米顆粒以及連接在金屬納米顆粒表面的陽性聚合物，其特征在于，所述陽性聚合物為多聚賴氨酸。
2.如權利要求1所述的基因載體，其特征在于，所述基因載體的粒徑為13~37nm，表面電荷為23~30mV。
3.如權利要求1所述的基因載體，其特征在于，所述多聚賴氨酸的分子量為60000~300000道爾頓。
4.如權利要求1所述的基因載體，其特征在于，所述金屬納米顆粒表面連接有穿膜肽。
5.如權利要求1所述的基因載體，其特征在于，所述金屬納米顆粒為金納米顆粒或銀納米顆粒。
6.一種如權利要求1所述基因載體的制備方法，包括: 將多聚賴氨酸加入金屬離子溶液中混合均勻，然后在攪拌條件下加入還原劑進行氧化還原反應，反應完成后從反應液中分離獲得所述基因載體。
7.—種如權利要求1所述的基因載體與DNA形成的復合物。
8.如權利要求7所述的復合物，其特征在于，所述復合物中基因載體和DNA的質量比為1:1 ~10:1。
9.如權利要求7所述的復合物，其特征在于，所述復合物的粒徑為100~170nm，表面電荷為20~40mV。
10.如權利要求1~9所述的基因載體在表皮干細胞轉染中的應用。
【文檔編號】C12N15/64GK104073516SQ201410231411
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權日:2014年5月27日
【發(fā)明者】彭麗華, 高建青 申請人:浙江大學