解脂亞羅酵母、在葡萄采后病害防治中的應用及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及解脂亞羅酵母、在葡萄采后病害防治中的應用及使用方法，屬于生物【技術領域】。該菌株分離自江蘇鎮(zhèn)江的葡萄園中，經鑒定為解脂亞羅酵母（Yarrowialipolytica），命名為解脂亞羅酵母WSL-01并將其保存于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCCNO.8492，保藏日期為2013年11月21日。使用時將解脂亞羅酵母活化、發(fā)酵培養(yǎng)，離心得到菌體，菌體用無菌水稀釋制備成1.0×108個/ml的菌懸液。用噴壺噴射至葡萄外表皮，再風干，放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫或冷藏條件下存放。該菌既能防治葡萄采后病害，又能夠高效降解葡萄上的OTA，對食品安全具有重要的現實意義。
【專利說明】解脂亞羅酵母、在葡萄采后病害防治中的應用及使用方法
[0001]

【技術領域】
本發(fā)明涉及一種解脂亞羅酵母菌種iYarrowia)以及該菌種對葡萄采后病害防治和降解赭曲霉毒素A的應用及使用方法。

【背景技術】
[0002]葡萄是世界范圍內最重要的水果之一。但葡萄的采后腐爛損失嚴重，因處理不足和缺乏適當的方法來防止腐爛和衰老，每年在貯藏過程中都會損失掉將近30%-40%的葡萄。葡萄采后腐爛主要由致病菌引起，由真菌例如灰霉、青霉、曲霉等引起的采后腐爛嚴重影響了葡萄的品質，安全性，貨架期和市場價值。即使在冷庫(0°C )貯藏過程中，由青霉屬、曲霉屬、鏈格孢屬、灰葡萄孢屬、根霉屬、鏈格孢霉屬等微生物引起的腐爛導致的葡萄采后損失約占產量的39%和價值的30%。
[0003]致病真菌除了引起水果采后腐爛以外，部分真菌還能產生真菌毒素，嚴重影響食用者的身體健康。赭曲霉素(Ochratoxins)是曲霉屬和青霉屬的某些種產生的次級代謝產物，主要包括赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B和赭曲霉毒素C等7種結構類似的化合物。其中赭曲霉毒素A分布較廣且毒性較強，有致畸、致突變、致癌的能力，且具有免疫毒性。2004年國際癌癥研究機構(IARC)將其劃分為可能的人類致癌物，即2B類物質。自從1996年葡萄汁里檢出該毒素開始，赭曲霉毒素陸續(xù)從其他各種葡萄制品中檢出。據國外文獻報道，葡萄制品中赫曲霉毒素殘留量一般在0.01~3.4 μ g/kg之間，甜酒中赫曲霉毒素的殘留量在I~3.9 μ g/kg，葡萄汁中赭曲霉毒素的殘留量較高，在1.16~2.32 μ g/kg之間，葡萄干中赭曲霉毒素的殘留量更高，一般超過40 μ g/kg。
[0004]赭曲霉毒素A(OTA)主要是由某些曲霉屬dpergiJJiAs)和青霉屬產生的次級代謝產物。OTA是苯丙氨酸與異香豆素結合體衍生物，分子式為C2tlH18O6ClN,分子量為403.8，為白色針狀晶體，在熒光燈下呈明亮綠色熒光。微溶于水，易溶于極性有機溶劑。OTA是半抗原，需與大分子物質結合后才具有免疫原性。其具有耐熱性，焙烤只能使其毒性減少20%，蒸煮對其毒性不具有破壞作用。
[0005]OTA具有多種毒性，尤其具有腎毒性，且有一定致畸、致癌、致突變性，被認為是巴爾干地方性腎病的主要因素之一，因此對動物和人體健康會造成很大的潛在危害。短期試驗結果顯示，OTA對所有單胃哺乳類動物的腎臟均有毒性，可引起實驗動物腎萎縮或腫大、顏色變灰白、皮質表面不平、斷面可見皮質纖維性變化；顯微鏡下可見腎小管萎縮、間質纖維化、腎小球透明變性、腎小管壞死等，并伴有尿量減少、血尿素氮升高、對氨基馬尿酸清除率降低、尿頻、尿蛋白和尿糖增加等腎功能受損導致的生化指標的改變，而尿蛋白和尿糖增加表明近曲小管對蛋白和糖的重吸收功能降低。母親經膳食攝入的OTA可分泌至乳汁中，通過母乳暴露OTA對嬰兒健康的影響也應引起重視。2004年國際癌癥研究(IARC)將其劃分為人類可能致癌物質(2B類)。我國規(guī)定谷物及其制品中的OTA的限量標準為5 yg/ kg。
[0006]葡萄及其制品中的赭曲霉毒素主要來自于水果在貯藏期污染某些能產生赭曲霉毒素的致病霉菌。因此要控制葡萄及制品中的赭曲霉毒素殘留情況，首先要控制葡萄在貯藏期霉菌的污染，減少赭曲霉毒素產生的機會；其次要采取措施，去除或降解已經產生的赭曲霉毒素。
[0007]由于傳統方法是從控制葡萄在貯藏期霉菌的污染從而防止OTA的產生、去除或降解已經產生的OTA兩方面來控制葡萄及制品中的OTA殘留的，以下從這兩方面來闡述傳統控制方法存在的問題。
[0008]( I)控制葡萄在貯藏期霉菌污染的傳統方法存在的問題
低溫貯藏、氣調貯藏是抑制水果采后病害的有效方法，但兩者都需要相應的設備，在廣大的發(fā)展中國家，已有的設備往往不能滿足大多數水果的需要。另外，有些致病霉菌(包括碳黑曲霉)比較耐低溫，在冷藏情況下仍能夠在水果上生長，并造成葡萄腐爛，甚至產生霉菌毒素。長期以來，控制葡萄采后病害及霉菌毒素污染的主要措施是使用殺菌劑，而葡萄在采前經常使用灑咯菌腈(flud1xonil)和喃菌環(huán)胺(cyprodinil)進行噴灑,在采后忙藏及加工過程中經常使用二氧化硫(SO2)處理[29，3°]。殺菌劑的長期和大量使用，嚴重污染環(huán)境，有損于人類健康。過去十多年，公眾和科學界對于食品和環(huán)境中農藥(尤其殺菌劑)殘毒問題的關注日益增加。美國國家科學院(NAS)的報道(1987)指出，殺菌劑的應用對人類健康造成了危害。全美9種致瘤化合物的銷售量中，殺菌劑占90%左右，在用于食物的全部農藥中，殺菌劑構成60%的致瘤危險。這一報道導致了幾種殺菌劑如克菌丹(captan)和苯菌靈(benomyl)等被美國環(huán)保機構所禁用，并部分或全部地自動退出采后應用市場。對葡萄在采前最常使用的殺菌劑灑咯菌腈(fIud1xonil)和喃菌環(huán)胺(cyprodinil)而言,在澳大利亞等發(fā)達國家，它們已被明令禁止在葡萄采收之前60天內使用[31]。對葡萄在采后貯藏及加工過程中經常使用的SO2而言，SO2除了能引起葡萄顏色漂白、產生不良風味以外，還能造成食用者的過敏反應，對食用者的健康造成傷害[32]。在美國等發(fā)達國家，SO2已被禁止在有機葡萄上使用[33]。
[0009](2)去除葡萄制品中OTA殘留的傳統方法存在的問題
現有葡萄及其制品中OTA的去除方法，如清洗和揀選原料、吸附處理、澄清處理等，使OTA或進入清洗用水中或進一步富集到吸附材料及澄清后的固態(tài)沉淀中，對環(huán)境構成了潛在威脅；最主要的是這些方法的效果都很有限，很難將葡萄及制品中的OTA殘留量降低到安全限度內。另一方面，現有OTA降解方法如輻照、臭氧氧化及添加化學物質處理等，或由于成本昂貴或由于安全性尚未明確，多停留在試驗階段，生產中尚未見有實際應用。
[0010]總之，上述方法在葡萄及葡萄制品中赭曲霉毒素的控制中存在著安全性、經濟性、高效性和實用性低等問題。鑒于以上控制葡萄及制品中OTA殘留的傳統方法存在的問題，研發(fā)環(huán)保、安全、經濟、高效、實用，既具有水果病害防治效果、又具有控制OTA殘留的生物技術，具有重要的社會價值和經濟價值。
[0011]本發(fā)明中的解脂亞羅酵母WSL-01被認為是最安全的酵母之一，研究證明，其能顯著降低葡萄采后病害的發(fā)生，并能夠顯著地降解0ΤΑ。


【發(fā)明內容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一株分離自葡萄園的能夠控制葡萄采后病害、并能高效降解OTA的酵母菌株，因其具有的高安全性，利用該菌株可實現對葡萄及葡萄制品中OTA的控制。
[0013]本發(fā)明所提供的降解OTA的菌株是從江蘇省鎮(zhèn)江市句容的葡萄園中分離到的，這是一株具有極高活力，對OTA降解能力很強的菌株，其培養(yǎng)方法簡單，生長速度較快，不易變異，安全性高。將其編號為WSL-01，已將其保藏于位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年11月21日，保藏編號為:CGMCC N0.8492。該菌株的5.8SrDNA-1TS基因序列已經遞交到了 GenBank數據庫,發(fā)現該序列與解脂亞羅酵母(/arroffialipolytica )菌基因序列高度同源。
[0014]本發(fā)明同時提供了一種利用解脂亞羅酵母進行葡萄采后病害防治及貯藏保鮮方法；步驟如下:將解脂亞羅酵母)活化、發(fā)酵培養(yǎng),離心得到菌體；將菌體用無菌水稀釋制備成1.0XlO8 CFU/mL的菌懸液；用噴壺噴灑至葡萄外表皮，再風干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫下存放。
[0015]本發(fā)明的解脂亞羅酵母WSL-Ol菌株采用常規(guī)的菌種斜面保藏方法，采用培養(yǎng)基首選為NYDA培養(yǎng)基(牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%，瓊脂2%)，也可以使用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15~20克，自來水1000毫升)。在pH
7.(T9.0,26°C~28°C，培養(yǎng)36 h。在發(fā)酵培養(yǎng)時，可將斜面菌種直接接種至發(fā)酵培養(yǎng)基NYDB(牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%)或者PM培養(yǎng)基(酵母浸膏5g，蔗糖10g，蛋白胨5g，麥芽糖2g，蒸餾水100mL)中，pH 7.0~9.0，溫度26°C~28°C，搖床轉速180 r/min的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)4(T48 h。一般在40 h左右可以達到最大生物量。
[0016]本發(fā)明的解脂亞羅酵母lipolytica) WSL-01,可以明顯的抑制葡萄產生腐爛腐敗的病原菌，防止葡萄采后發(fā)生腐爛，并且具有不產生毒素、可以和化學殺菌劑共同使用等優(yōu)點，可以廣泛的用于葡萄采后病害的生物防治過程中，減少采后病害造成的損失。
[0017]本發(fā)明提供的解脂亞羅酵母能夠降解赭曲霉毒素A。
[0018]通過借助以下實施實例將更加詳細的說明本發(fā)明。以下實施例僅是說明性的，本發(fā)明并不受這些實施實例的限制。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明解脂亞羅酵母WSL-Ol的5.8S rDNA -1TS區(qū)序列進化關系圖。
[0020]圖2不同濃度的耶羅維亞酵母對OTA的降解。
[0021]

【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明菌株通過以下方法得到，從鎮(zhèn)江市句容葡萄園中分離得到。經過形態(tài)學觀察、生理生化特征試驗和ITS堿基序列分析，鑒定為解脂亞羅酵母WSL-01 iYarrowialipolytica WSL-01)。已將其保藏于位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年11月21日，保藏編號為=CGMCC N0.8492。
[0023] 本發(fā)明的菌株解脂亞羅酵母WSL-Ol菌株(菌株編號=CGMCC N0.8492)微生物學特性如下:1.形態(tài)學特征
(I)在YEro固體培養(yǎng)基平板(酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000mL,瓊脂20 g，115°C濕熱滅菌20 min)上28°C培養(yǎng)48 h，菌落呈圓形、邊緣粗糙呈絨毛狀、較濕潤、易挑起。細胞形態(tài)呈長橢圓形，單個分散。
[0024](2)在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，不形成醭，菌液渾濁，有沉淀，鏡檢酵母細胞呈橢圓形，芽殖。
[0025]生理特性
本發(fā)明菌株碳源能夠同化甘油、甘露醇，不能同化淀粉、麥芽糖、蔗糖、乳糖等。氮源能夠同化硝酸鹽，37°C可以生長。其生理特性結果具體見下表1和表2。
[0026]分子生物學鑒定
對篩選菌株解脂亞羅酵母WSL-Ol的5.8S rDNA-1TS區(qū)序列分析，在GenBank上檢索，確定為解脂亞羅酵母WSL-01(Zarroffia lipolytica WSL-01)。根據檢索到的同源菌株，應用DNAStar軟件的Mege5.1程序，構建生物進化關系樹如圖1。
[0027]表1解脂亞羅酵母WSL-Ol碳源氮源同化結果

【權利要求】
1.解脂亞羅酵母(Jarrowialipolytica) WSL-OI, CGMCC N0.8492。
2.權利要求1所述的解脂亞羅酵母菌株的用途，其特征在于可以用其對葡萄進行采后病害防治及貯藏保鮮。
3.權利要求1所述的解脂亞羅酵母進行葡萄采后病害防治及貯藏保鮮方法，按照下述步驟進行:將解脂亞羅酵母活化、發(fā)酵培養(yǎng)，離心得到菌體；將菌體用無菌水稀釋制備成18CFU/mL的菌懸液；用噴壺噴灑至葡萄外表皮，再風干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫下存放。
4.權利要求 書I所述的解脂亞羅酵母菌株的用途，其特征是能降解赭曲霉素A(OTA)。
【文檔編號】A23B7/155GK104130953SQ201410231417
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權日:2014年5月29日
【發(fā)明者】張紅印, 楊其亞, 王峻峻, 王海英, 張曉云 申請人:江蘇大學