一種用于篩選肽類和非肽類glp-1類似物的細(xì)胞株及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種用于篩選肽類和非肽類GLP-1類似物的細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于藥物高通量篩選檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定表達(dá)熒光標(biāo)記人胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)蛋白細(xì)胞株GLP-1R/U2OS的建立，以及基于GLP-1R/U2OS細(xì)胞株受到GLP-1類似物Exendin-4刺激后細(xì)胞內(nèi)形成熒光斑點，用高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察分析形態(tài)變化來測定GLP-1類似物生物活性的檢測方法。該檢測方法易標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性好，具有GLP-1受體特異性、成本低、準(zhǔn)確和方便的特點，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種用于篩選肽類和非肽類GLP-1類似物的細(xì)胞株及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于藥物高通量篩選檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種表達(dá)熒光標(biāo)記人胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)蛋白細(xì)胞株GLP-1R/U20S細(xì)胞株及其建立方法，以及基于此細(xì)胞株受到胰高血糖素樣肽-1類似物刺激后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光斑點的形態(tài)變化來測定胰高血糖素樣肽-1類似物生物活性及其受體激動劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑的檢測方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]腸促胰島素是在養(yǎng)分吸收以增加胰島素分泌時胃腸道釋放的激素。占腸促胰島素大多數(shù)效應(yīng)的兩種腸道肽是:1)GLP-1 (Glucagon-like peptide,胰高血糖素樣肽I):是由胰高血糖素原基因編碼、在營養(yǎng)物質(zhì)刺激下由小腸L細(xì)胞(Langerhans cell)分泌的含30或31個氨基酸的激素，GLP-1通過作用于胰腺β細(xì)胞而發(fā)揮促進(jìn)胰島素的分泌和抑制胰高血糖素分泌的作用，GLP-1及其受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺和胃腸道系統(tǒng)。2)GIP(Gastric inhibition polypeptide or glucose-dependent insulinotropicpeptide,葡萄糖依賴性促胰島素多肽):被十二指腸和近端空腸K細(xì)胞分泌。從小腸部位釋放的幾分鐘內(nèi)，GLP-1和GIP被二肽基肽酶-1V (DPP-1V)進(jìn)行迅速代謝(蛋白水解裂解)成無活性代謝物。小量活性激素到達(dá)胰腺作用于在beta-細(xì)胞上的受體位點以葡萄糖依賴方式刺激胰島素分泌；而且GLP-1作用在alpha細(xì)胞和抑制胰高血糖素的分泌。目前基于腸促胰島素的治療主要分為兩大類即DPP-1V抑制劑(如西格列汀、利拉利汀等)和GLP-1受體激動劑(基于Exendin-4治療，如艾塞那肽；人GLP-1類似物，如利拉魯肽)。
[0003]GLP-1目前被認(rèn) 為是最重要的腸促胰島素，其發(fā)揮著大約70-80%的腸促胰島素活性，所有這些生理特征均顯示GLP-1將在2型糖尿病的治療中發(fā)揮重要作用。新型降糖藥物GLP-1受體激動劑可顯著、持久降低糖化血紅蛋白水平，并具有迅速、高效降低血糖，改善胰島β細(xì)胞功能，降低體重等功效。無論是動物水平還是細(xì)胞水平，GLP-1受體激動劑均表現(xiàn)出抗高血糖的生理作用；促進(jìn)胰島素的釋放，抑制胰高血糖素的分泌，延遲胃排空，促進(jìn)β細(xì)胞的增殖和再生，抑制β細(xì)胞的凋亡。
[0004]GLP-1及其類似物的相關(guān)研究雖然已經(jīng)取得了不錯的進(jìn)展，多種類似物也進(jìn)入了臨床試驗階段，然而由于多肽類藥物具有一個共同的弊端，即不能口服給藥，只能通過皮下注射，因此對于長期用藥的二型糖尿病(T2DM)患者來說其依從性仍舊不高。由于多肽類藥物的特性，其穩(wěn)定性依賴于時間、溫度及PH值，保藏條件要求較高。另外，由于這些激動劑都給人體引入了外源蛋白，可能會引發(fā)機體的免疫反應(yīng)。目前上市的GLP-1類似物價格昂貴，會加重患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。目前篩選小分子GLP-1類似物已成為研究熱點。
[0005]建立有效的GLP-1類似物生物活性的測定方法，是評價新藥藥效的關(guān)鍵措施之
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【發(fā)明內(nèi)容】
:[0006]本發(fā)明的目的是提供一種新的體外篩選胰高血糖素樣肽-1受體的肽類和非肽類激動劑、調(diào)節(jié)劑和拮抗劑的方法，提供一種表達(dá)熒光標(biāo)記人胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)蛋白細(xì)胞株GLP-1R/U20S細(xì)胞株及其建立方法，XFP直接標(biāo)記GLP-1R的C末端，以及基于此細(xì)胞株受到胰高血糖素樣肽-1類似物刺激后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光斑點的形態(tài)變化來測定胰高血糖素樣肽-1類似物生物活性的檢測方法。
[0007]本發(fā)明以下述的技術(shù)方案來得以實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的的:
[0008]一株GLP-1R/U20S細(xì)胞株，由下述方法獲得:構(gòu)建人胰高血糖素樣肽_1受體(GLP-1R)熒光蛋白(XFP)真核表達(dá)載體GLP-lR/pCMV6，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U20S細(xì)胞，獲得一株GLP-1R/U20S細(xì)胞株。
[0009]所述的GLP-1R/U20S 細(xì)胞株含有的熒光蛋白(XFP)，是 GFP (green fluorescenceprotein)、YFP (yelow fluorescence protein)、RFP (red fluorescence protein)或任何具有熒光性質(zhì)的蛋白。
[0010]所述的GLP-1R/U20S細(xì)胞株或其它適用的細(xì)胞如HEK293 (human embroynickidney293)細(xì)胞，由下述方法獲得:先構(gòu)建人胰高血糖素樣肽_1受體(GLP-1R)綠色熒光蛋白(GFP)真核表達(dá)載體GLP-lR/pCMV6，再按Lipofectamine2000操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染U20S細(xì)胞。6418(400μ8/πι1)加壓篩選2周，獲得具有抗生素抗性的陽性細(xì)胞克隆，擴增培養(yǎng)即為穩(wěn)定表達(dá)人GLP-1R的U20S細(xì)胞系，命名為GLP-1R/U20S細(xì)胞株。
[0011]用所述的GLP-1R/U20S細(xì)胞株測定GLP-1類似物生物活性的方法，轉(zhuǎn)染了 XFP標(biāo)記的GLP-1R基因的條件下，在受體激動劑刺激下誘導(dǎo)GLP-1R/U20S細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光斑點，轉(zhuǎn)染的GLP-1R能穩(wěn)定表達(dá)。
[0012]如所述的方法，其中所述的受體激動劑為GLP-1類似物，GLP-1受體與配體結(jié)合后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光斑點強度與受體激動劑的活性呈正相關(guān)，用高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察分析測定GLP-1R/U20 S細(xì)胞內(nèi)熒光斑點強度，測定受體激動劑的生物活性。
[0013]如所述的方法，其中所述的GLP-1類似物為促胰島素分泌肽Exendin-4。
[0014]如所述的方法，用高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察GLP-1R的表達(dá)情況結(jié)果，用GLP-1R/U20S細(xì)胞內(nèi)熒光斑點平均強度變化測定GLP-1類似物和GLP-1R生物活性物包括GLP-1受體激動劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑等。
[0015]本發(fā)明提供了穩(wěn)定表達(dá)熒光標(biāo)記人胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)蛋白細(xì)胞株GLP-1R/U20S的建立，以及基于GLP-1R/U20S細(xì)胞株受到GLP-1類似物Exendin-4刺激后細(xì)胞內(nèi)形成熒光斑點，用高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察分析形態(tài)變化來測定GLP-1類似物生物活性的檢測方法。該檢測方法易標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性好，具有GLP-1受體特異性、成本低、準(zhǔn)確和方便的特點，具有良好的應(yīng)用前景。
[0016]目前國內(nèi)篩選GLP-1受體激動劑的方法是將GLP-1受體的基因和報告基因共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，并將GLP-1受體表達(dá)在細(xì)胞表面，通過刺激后細(xì)胞內(nèi)cAMP水平變化對激動劑進(jìn)行篩選。本發(fā)明提供了熒光標(biāo)記人胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)蛋白細(xì)胞株GLP-1R/U20S，相比國內(nèi)的篩選方法具有快速、靈敏、專一性高等優(yōu)點，而且會大大降低假陽性的發(fā)生，并且可以針對混合物進(jìn)行篩選，同時也會降低檢測成本。
【專利附圖】

【附圖說明】:[0017]圖1XFP標(biāo)記GLP-1R示意圖；
[0018] 圖2重組真核表達(dá)載體GLP_lR/pCMV6示意圖；
[0019]圖3高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察分析細(xì)胞表面GLP-1R的表達(dá)情況結(jié)果；
[0020]圖4高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察分析刺激后細(xì)胞內(nèi)形成熒光斑點；
[0021]圖5GLP-1R/U20S細(xì)胞經(jīng)Exendin-4激活后活性反應(yīng)曲線結(jié)果。
【具體實施方式】:
[0022]下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。
[0023]實施例1:
[0024]GFP熒光標(biāo)記人GLP-1R真核表達(dá)載體GLP_lR/pCMV6的構(gòu)建，GLP-1R/U20S細(xì)胞株的建立，以及GLP-1R/U20S細(xì)胞內(nèi)熒光斑點平均強度變化測定GLP-1類似物生物活性。
[0025]一、GFP熒光標(biāo)記人GLP-1R真核表達(dá)載體GLP_lR/pCMV6的構(gòu)建:
[0026]人GLP-1R cDNA擴增:以人GLP-1R cDNA為模板，采用PCR的方式擴增全長人GLP-1R cDNA 編碼區(qū)，全長 1392bp。
[0027]其上游引物:5’-gaggcgatcgccATGGCCGGCGCCCCCGGC-3’ ；
[0028]下游引物:5，-gcgacgcgtGCTGCAGGAGGCCTGGCAAG-3，。
[0029]2.回收、純化PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T Vector上，獲得重組質(zhì)粒GLP-1R/PMD18-T，利用限制性內(nèi)切酶Sgf I和Mlu I對質(zhì)粒進(jìn)行酶切。
[0030]3.用限制性內(nèi)切酶 Sgf I 和 Mlu I 酶切質(zhì)粒 G-D (pCMV6-AC-GFP-DR5)。
[0031]4.回收酶切產(chǎn)物，在16°C連接8小時，獲得重組質(zhì)粒GLP-lR/pCMV6，按照OMEGA去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒說明書提取GLP-lR/pCMV6質(zhì)粒。
[0032]基因序列的克隆PCR反應(yīng)體系為50μ L，由 5μ LlOXEx-Taq bufferU μ L Ex-TaqDNA 聚合酶 5U/y L、3y L2.5mM dNTP、l μ L 上游引物 lOpmol/μ L、1 μ L 下游引物 IOpmoI/μ L、1 μ L質(zhì)粒(BC113493) 100ng/yL和38yL無菌水組成；PCR反應(yīng)條件:95 °C預(yù)變性5min，95°C變性 lmin，65°C退火 0.5min，72°C延伸 lmin，共 30 個循環(huán)，72°C延伸 IOmin ;所用的 IOXEx-Taq buffer 中含有 Mg2+。
[0033]回收PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T Vector反應(yīng)體系為10 μ L，由5 μ L回收PCR產(chǎn)物、
4.5 μ L Solutionl、0.5 μ L pMD18_T Vector 組成；反應(yīng)條件:在 16°C連接 4 小時。
[0034]雙酶切質(zhì)粒GLP-lR/pMD18-T反應(yīng)體系為50μL，由 2μ L Sgf I(5U/y L) ,2 μ L MluI(5U/yL), 5 μ LlOXTango Buffer、25 μ LGLP_lR/pMD18_T 和 16 μ L 無菌水組成；反應(yīng)條件:37°C溫育2小時。
[0035]雙酶切質(zhì)粒G-D (pCMV6-AC-GFP-DR5)反應(yīng)體系為 50 μ L，由 2 μ L Sgf I (5U/ μ L)、2μ L Mlu I(5U/yL), 5 μ LlOXTango Buffer、10 μ LG-D 和 31 μ L 無菌水組成；反應(yīng)條件:37°C溫育2小時。
[0036]構(gòu)建重組質(zhì)粒GLP_lR/pCMV6是用步驟⑵和(3)中的限制性酶切產(chǎn)物，在16°C的條件下連接8小時；反應(yīng)體系為11 μ L，由5μ L Solution〗、步驟(4)中限制性酶切后的質(zhì)粒pCMV6片段和GLP-1R基因序列片段分別為I μ L和5 μ L組成；反應(yīng)條件:在16°C連接8小時。[0037]步驟(4)中獲得的質(zhì)粒可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化E.coli DH5a進(jìn)行保存擴增。
[0038]二、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人GLP-1R的U20S細(xì)胞系的建立:
[0039]U20S細(xì)胞在含10% (體積分?jǐn)?shù))小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C、5% (體積分?jǐn)?shù))CO2的飽和濕度下培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至70% -80%時按Lipofectamine2000操作說明書進(jìn)行重組表達(dá)載體GLP-lR/pCMV6的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，在含有6418(400 μ g/ml)的選擇培養(yǎng)基中加壓篩選2周，獲得具有抗生素抗性的陽性細(xì)胞克隆，擴增培養(yǎng)即為穩(wěn)定表達(dá)人GLP-1R的U20S細(xì)胞系，命名為GLP-1R/U20S細(xì)胞株。用高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察GLP-1R的表達(dá)情況結(jié)果。
[0040]三、GLP-1R/U20S細(xì)胞內(nèi)熒光斑點平均強度變化測定GLP-1類似物生物活性:
[0041]將上述獲得的GLP-1R/U20S細(xì)胞按100 μ L/孔(1000細(xì)胞/孔)培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，用含10% (體積分?jǐn)?shù))小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)24小時。第二天撤去完全培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗，加入不同濃度待測樣本Exendin-4，并在20分鐘后移去孔中溶液， 用4%多聚甲醛室溫固定30分鐘，用PBS緩沖液洗3遍，加入DAPI染料避光染色15分鐘，用PBS緩沖液洗5遍，在孔中留100 μ LPBS緩沖液，用高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察分析突光斑點，并用Transfluor模塊分析計算斑點平均強度,用Excel作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0042]實施例2:
[0043]GLP-1R/U20S 細(xì)胞膜上 GLP-1R 的表達(dá):
[0044]GLP-1R/U20S細(xì)胞按100 μ L/孔(1000細(xì)胞/孔)培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，用含10%(體積分?jǐn)?shù))小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37°C>5% CO2條件下培養(yǎng)24小時。第二天撤去完全培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗，用4%多聚甲醛室溫固定30分鐘，用PBS緩沖液洗3遍，加入DAPI染料避光染色15分鐘，用PBS緩沖液洗5遍，在孔中留100 μ LPBS緩沖液，用高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察熒光。
[0045]實施例3:
[0046]GLP-1R/U20S細(xì)胞表達(dá)GLP-1受體活性分析:
[0047]GLP-1R/U20S細(xì)胞按100 μ L/孔(1000細(xì)胞/孔)培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，用含10%(體積分?jǐn)?shù))小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37°C>5% CO2條件下培養(yǎng)24小時。第二天撤去完全培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗，加入待測樣本Exendin-4，室溫放置20分鐘，移去孔中溶液，用4%多聚甲醛室溫固定30分鐘，用PBS緩沖液洗3遍，加入DAPI染料避光染色15分鐘，用PBS緩沖液洗5遍，在孔中留100 μ LPBS緩沖液，用高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察熒光變化。結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光斑點，而未轉(zhuǎn)染GLP-1R基因的U20S細(xì)胞未有任何變化。以上實驗結(jié)果證實重組GLP-1R/U20S細(xì)胞表達(dá)的GLP-1R蛋白具有天然GLP-1R蛋白相似的生理活性，具有特異性。
[0048]實施例4:
[0049]促胰島素分泌肽生物學(xué)活性測定:
[0050]取不同濃度的促胰島素分泌肽Exendin-4，用實施例3方法刺激生長中的GLP-1R/U20S細(xì)胞，高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察分析各樣本刺激GLP-1R/U20S細(xì)胞后的熒光斑點平均強度。以樣本濃度為橫坐標(biāo)，以斑點平均強度為縱坐標(biāo)，作曲線。結(jié)果表示，經(jīng)Exendin-4刺激后斑點平均強度曲線呈典型的反S型，不同濃度的Exendin-4刺激GLP-1R/U20S細(xì)胞后形成斑點的平均強度存在劑量效應(yīng)相關(guān)性。
【權(quán)利要求】
1.一株GLP-1R/U20S細(xì)胞株，其特征在于由下述方法獲得:構(gòu)建人胰高血糖素樣肽_1受體熒光蛋白真核表達(dá)載體GLP-lR/pCMV6，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U20S細(xì)胞，獲得一株GLP-1R/U20S 細(xì)胞株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GLP-1R/U20S細(xì)胞株含有的熒光蛋白XFP是GFP、YFP、RFP或任何具有熒光性質(zhì)的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GLP-1R/U20S細(xì)胞株或其它適用的細(xì)胞如HEK293細(xì)胞，其特征在于由下述方法獲得:先構(gòu)建人胰高血糖素樣肽-1受體GLP-1R綠色熒光蛋白GFP真核表達(dá)載體GLP-lR/pCMV6，再按Lipofectamine2000操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染U20S細(xì)胞，G418加壓篩選2周，獲得具有抗生素抗性的陽性細(xì)胞克隆，擴增培養(yǎng)即為穩(wěn)定表達(dá)人GLP-1R的U20S細(xì)胞系，命名為GLP-1R/U20S細(xì)胞株。
4.用權(quán)利要求1所述的GLP-1R/U20S細(xì)胞株測定GLP-1類似物生物活性的方法，其特征在于:轉(zhuǎn)染了 XFP標(biāo)記的GLP-1R基因條件下，在受體激動劑刺激下誘導(dǎo)GLP-1R/U20S細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光斑點，轉(zhuǎn)染的GLP-1R穩(wěn)定表達(dá)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的受體激動劑為GLP-1類似物，GLP-1受體與配體結(jié)合后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光斑點強度與受體激動劑的活性呈正相關(guān)，用高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察分析測定GLP-1R/U20S細(xì)胞內(nèi)熒光斑點強度，測定受體激動劑的生物活性。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的GLP-1類似物為促胰島素分泌肽Exendin-4。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于用高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察GLP-1R的表達(dá)情況結(jié)果，用GLP-1R/U20S細(xì)胞內(nèi)熒光斑點平均強度變化測定GLP-1類似物和GLP-1R生物活性物包括GLP-1受體激動劑、拮抗劑和調(diào)節(jié)劑等。
【文檔編號】C12Q1/02GK103966171SQ201410234121
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】姚洪玉, 魏云林, 張敏, 張寬仁, 劉東波, 季秀玲 申請人:昆明貝爾吉科技有限公司, 昆明理工大學(xué)