一種多等位基因型pcr擴增片段的篩選方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多等位基因型PCR擴增片段的篩選方法及其應用。該篩選方法是通過NCBI查找已經(jīng)公布的染色體相關資料，確定疑似存在的SNP聚集，然后針對疑似存在的SNP聚集區(qū)域設計引物并PCR擴增，通過測序以檢測PCR擴增片段是否真正存在多個SNP位點，并進一步通過SNP位點的關聯(lián)性分析，確定擴增片段是否具有多等位基因型，從而篩選出多等位基因型PCR擴增片段，用于動物個體身份識別、肉產(chǎn)品溯源技術(shù)的研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化等。
【專利說明】—種多等位基因型PCR擴增片段的篩選方法及其應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種多等位基因型PCR擴增片段的篩選方法及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來食品安全事件頻發(fā)，政府管理部門及消費者對食品安全的關注也史無前例，因此研發(fā)動物個體身份識別技術(shù)及肉產(chǎn)品溯源技術(shù)，特別是DNA識別技術(shù)迫在眉捷。
[0003]為此，我們對動物個體身份識別及肉產(chǎn)品溯源的SNP條形碼技術(shù)開展了系列研究，并深感如果要真正實現(xiàn)動物個體身份識別等技術(shù)研發(fā)及真正產(chǎn)業(yè)化，需要使動物個體身份DNA識別及肉產(chǎn)品DNA溯源技術(shù)及其研發(fā)變得更為簡單，那么必須要篩選到一些同時含有多個SNP位點的PCR擴增片段，且PCR擴增片段多等位基因型，由這些PCR擴增片段內(nèi)的有效SNP位點組合成SNP條形碼。多等位基因型PCR擴增片段主要針對染色體上的基因間隔序列篩選，不僅只針對功能基因篩選。針對基因間隔序列篩選不僅易于發(fā)現(xiàn)大量的SNP位點，而且大量SNP位點所組成的多等位基因型PCR擴增片段信息量較大，進而使動物個體身份DNA識別及肉產(chǎn)品溯源DNA溯源技術(shù)及其研發(fā)變得更為簡單，技術(shù)產(chǎn)業(yè)化成本更低；而功能基因序列相比較于 染色體上的基因間隔序列相對保守，突變相對較少，SNP篩選效率相對不高，且擴增的PCR片段大多只含有一個SNP位點，信息量相對有限。為此，我們提出了“多等位基因型PCR擴增片段”概念，并建立了一種多等位基因型PCR擴增片段的簡易篩選方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了一種多等位基因型PCR擴增片段的篩選方法。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供該方法的應用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]一種多等位基因型PCR擴增片段的篩選方法，是通過NCBI查找已經(jīng)公布的染色體相關資料，確定疑似存在的SNP聚集，然后針對疑似存在的SNP聚集區(qū)域設計引物并PCR擴增，擴增片段通過測序以檢測PCR擴增片段是否真正存在多個SNP位點，并進一步通過SNP位點的關聯(lián)性分析，確定擴增片段是否具有多等位基因型，從而篩選出多等位基因型PCR擴增片段，用于動物個體身份識別、肉產(chǎn)品溯源等技術(shù)的研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化。
[0008]其中，所述的多等位基因型PCR擴增片段是指PCR擴增片段至少存在2個或以上的SNP位點，且(在群體中)擴增片段分離到的等位基因型數(shù)量> 4。
[0009]所述的染色體相關資料(數(shù)據(jù))，是指NCBI上公布的染色體DNA序列及DNA序列上的疑似SNP位點。
[0010]所述的SNP聚集，是指NCBI公布的DNA序列的某一區(qū)段(一次測序長度為宜)內(nèi)存在多個疑似SNP位點，且疑似存在的SNP位點數(shù)量越多越好。[0011]按照本發(fā)明所述的篩選方法獲得的多等位基因型PCR擴增片段可應用于動物個體身份識別、肉產(chǎn)品溯源技術(shù)研發(fā)、分子遺傳標記篩選等方面，優(yōu)選應用于豬個體身份識別技術(shù)研發(fā)等方面所需的多等位基因型PCR擴增片段的篩選。
[0012]有益效果:本發(fā)明是根據(jù)NCBI已經(jīng)公布的染色體相關資料(數(shù)據(jù))，來篩選基因組DNA的疑似高變區(qū)，并設計引物擴增獲得多等位基因型擴增片段，用于動物個體身份識另O、肉產(chǎn)品溯源技術(shù)的研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化等。不同于目前主要針對功能基因(功能基因序列相對保守)的大多數(shù)SNP篩選，本發(fā)明的多等位基因型PCR擴增片段篩選不考慮篩選對象，且篩選的PCR擴增片段大多位于染色體上的基因間隔序列?；蜷g隔序列相比較于功能基因，序列相對不保守，且存在大量的高變區(qū)，因此SNP篩選更為容易，效率相對較高。而且，篩選的擴增片段多等位基因型，相比較于只有一個SNP位點的PCR擴增片段，信息量相對較大，有利于動物個體身份識別、肉產(chǎn)品溯源等技術(shù)的研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化。例:如果篩選的PCR擴增片段基因型數(shù)在9個以上，那么5對引物(理論上)就可用于95個豬個體(5.9萬頭)的身份識別，基本可以滿足規(guī)模豬場的豬個體身份識別，而如果篩選的PCR擴增片段僅只含有一個SNP位點，那么達到同樣的個體身份識別效果，理論上則需要10對引物。因此，多等位基因型PCR擴增片段的篩選有利于動物個體身份識別等技術(shù)的研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化。同時，由于篩選的多等位基因型PCR擴增片段大多位于染色體上的基因間隔序列，屬于高變區(qū)，因此多等位基因型PCR擴增片段存在一些不同品種共有的SNP位點，或同時存在不同品種的SNP突變位點，這樣篩選到的這些PCR擴增片段可同時用于動物多個品種的個體身份識別或肉產(chǎn)肉溯源等，從而實現(xiàn)動物個體身份識別、肉產(chǎn)品溯源等技術(shù)的深度研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為以69頭杜洛克豬樣本的混合DNA模板為PCR模板，引物對I擴增序列的部分測序峰圖。
[0014]圖2為引物對I擴增的+470和+502 二個SNP位點在69頭杜洛克豬樣本中組合而成的5種基因型。
[0015]圖3 3對引物在杜洛克豬中獲得SNP位點及用于基因分型的有效SNP位點
[0016]圖4 3對引物擴增片段在杜洛克、長白、大約克3個豬種中篩選到的SNP位點，其中有的SNP位點為三個品種所共有，有的二個品種所共有。
【具體實施方式】
[0017]實施例1杜洛克豬基因組DNA的多基因型PCR擴增片段篩選及個體身份識別
[0018]1.1引物設計(以豬10號染色體為例)
[0019]L L I 在 NCBI 的 Nucleotide 數(shù)據(jù)庫(http:1Iwm.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore)中搜索關鍵詞Sus scrofa breed mixed chromosomelO (在其他染色體上設計引物，將“10”改為相應染色體號)。打開頁面后，依次點擊超鏈接Sus scrofa breed mixedchromosomelO, Sscrofal0.2、Graphics。
[0020]在圖 形界面中點擊configure按鈕彈出選項卡,在Tracks選項卡下的所有選項中，僅保留sequence和SNP前的“ V”。點擊configure按鈕確認。
[0021]1.1.2右鍵點擊SNP條形碼中藍色較深(SNP密集)的地方，彈出菜單中選擇“Zoomto sequence”,通過“Zoom bar”調(diào)整至標尺以k為單位顯示。在標尺上按住鼠標左鍵劃出SNP密集區(qū)域,釋放鼠標左鍵時彈出的菜單中點擊“set new marker for selection”。鼠標指向markerl,記錄range的起始位置數(shù)值。
[0022]1.1.3 點擊 “Tools”，彈出菜單中選擇 “sequence text view” 后，點擊 “go toposition”,輸入1.1.2步驟記錄的range起始位置數(shù)值，點擊“0K”鍵，方括號內(nèi)顯示“Makerl”標記序列，復制該序列作為引物設計的模板(使用Ctrl+C按鍵復制)。復制序列用記事本保存后，可通過在線或本地軟件設計引物。
[0023]1.1.4右鍵點擊Markerl區(qū)域，在彈出菜單中左鍵點擊:“Zoom In”，直至markerl區(qū)域充滿可見窗口后，再在該菜單中左鍵點擊“B1AST and Primer Search/PrimerBlAST(visible Range)”。
[0024]1.1.5彈出新頁面按照以下要求填寫:
[0025]Primer Parameters 欄:PCR product size 項目下 Min 項填入 500, Max 項填入1000。Primer Pair Specificity Checking Parameters 欄:石角保 Specificity check 項目被勾選；database 項的下拉菜單中選擇 Genome (chormosomes from all organisms)；Organism 項填入 Sus scrofa (taxid: 9823)。
[0026]最后點擊Get Primers按鈕。在彈出的新頁面中的Detailed primer reports欄目中即可獲得數(shù)個引物組合，結(jié)合后續(xù)的PCR擴增及直接測序，篩選有效引物。
[0027]實施例共篩選3對引物(由于同窩同胞仔豬最難區(qū)分，所以實施例僅列舉了 9頭同窩同胞仔豬的個體身份識別，9頭同胞仔豬僅需3對引物就可實現(xiàn)個體身份識別)。
[0028]表1篩選的3對引物的相關信息
【權(quán)利要求】
1.一種多等位基因型PCR擴增片段的篩選方法，其特征在于所述的多等位基因型PCR擴增片段是指PCR擴增片段至少存在2個或以上SNP位點，且在群體中擴增片段分離到的等位基因型數(shù)量> 4，所述的篩選方法是通過NCBI查找已經(jīng)公布的染色體相關資料，確定疑似存在的SNP聚集，然后針對疑似存在的SNP聚集區(qū)域設計引物并PCR擴增，擴增片段通過測序以檢測PCR擴增片段是否真正存在多個SNP位點，并進一步通過SNP位點的關聯(lián)性分析，確定擴增片段是否具有多等位基因型，從而篩選出多等位基因型PCR擴增片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多等位基因型PCR擴增片段的篩選方法，其特征在于所述的公布的染色體相關資料為NCBI上公布的染色體DNA序列及DNA序列上的疑似SNP位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多等位基因型PCR擴增片段的篩選方法，其特征在于所述的SNP聚集，是指NCBI公布的DNA序列的某一區(qū)段內(nèi)存在多個疑似SNP位點。
4.權(quán)利要求1所述的多等位基因型PCR擴增片段的篩選方法在動物個體身份DNA識別或動物肉產(chǎn)品DNA溯源技術(shù)、分子遺傳標記中的應用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于權(quán)利要求1所述的多等位基因型PCR擴增片段的篩選方法在豬 個體身份DNA識別及豬肉產(chǎn)品DNA溯源中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103966349SQ201410234407
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】邢光東, 丁潛, 胡肄農(nóng), 張浩明, 紀紅軍, 徐銀學, 趙慶順 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院