間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株k3及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株K3及其應(yīng)用，此細胞株采用大鼠骨髓間質(zhì)干細胞尾靜脈反復(fù)注射體內(nèi)成瘤，將瘤體細胞分離培養(yǎng)獲得的體外細胞，再經(jīng)過單克隆篩選獲得間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株,保藏編號為CGMCCNO.9158。還公開了K3在腫瘤干細胞的SP分離和裸鼠體內(nèi)的K3分離腫瘤干細胞的相關(guān)研究中的應(yīng)用。本發(fā)明建立了一套分離、培養(yǎng)和鑒定間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株的方法。間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株的建立為研究間質(zhì)干細胞體內(nèi)瘤化的機制及腫瘤干細胞的生物學(xué)研究具有重要作用，為盡量減少間質(zhì)干細胞在體內(nèi)瘤化，提高其應(yīng)用的安全性具有重要科研價值。
CGMCC No9158
2014.04.24
【專利說明】間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株K3及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細胞的體外培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種大鼠骨髓來源的間 質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 間質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells, MSCs)是一類具有自我更新 (self-renewal)和多向分化（multiple differentiation)潛能的細胞群體。MSCs存在于 骨髓、脂肪組織、臍帶及外周血等多種組織器官，在體外可以誘導(dǎo)成各種組織細胞，如成骨 細胞、脂肪細胞、橫紋肌及平滑肌細胞以及神經(jīng)膠質(zhì)細胞等。MSCs存在范圍廣，易于獲得，增 殖能力強，便于體外分離培養(yǎng)，研究報道MSCs可誘導(dǎo)分化為心肌細胞、神經(jīng)細胞、成骨細胞 并能夠下調(diào)免疫應(yīng)答。目前，MSCs成為細胞工程和基因治療中理想的工具。 許多研究提示應(yīng)用MSCs進行細胞治療時應(yīng)采用第4代以前的MSCs，以避免其發(fā)生突 變致瘤，但也有少數(shù)研究者在MSCs應(yīng)用的安全性方面提出質(zhì)疑。我們實驗室于2004年首 次建立了人胚胎骨髓MSCs體外突變細胞株F6,此突變是在MSCs定向誘導(dǎo)分化過程中發(fā)生 的，突變后的MSCs形態(tài)變圓，核型異常，對免疫缺陷裸鼠有較強的致瘤能力，瘤組織病理類 型為纖維肉瘤。另外也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MSCs分離后在用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)時也會發(fā) 生突變，突變的細胞增殖速度變快，接觸抑制現(xiàn)象消失，靜脈注射入裸鼠體內(nèi)可在肺部形成 纖維肉瘤。
[0003] 除了體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化過程中發(fā)現(xiàn)MSCs突變致瘤外，MSCs用于在體內(nèi)研究時 也出現(xiàn)了致瘤現(xiàn)象。將熒光素酶基因標記的MSCs用于體內(nèi)活體成像觀察時發(fā)現(xiàn)一些高表 達熒光蟲素酶的小鼠死亡，而存活的小鼠肺中都出現(xiàn)纖維肉瘤，并且有兩只小鼠還出現(xiàn)了 骨肉瘤，同時MSCs突變的肉瘤細胞可以二次致瘤。多個研究提示MSCs突變可以在裸鼠體 內(nèi)形成肉瘤，甚至有學(xué)者提出尤文氏等骨肉瘤是來源于MSCs體內(nèi)突變產(chǎn)生的。本實驗室 為深入探討骨髓MSC體內(nèi)致瘤的可能性，利用大鼠骨髓MSC反復(fù)尾靜脈注射后，20個月后 在原位注射點形成了自發(fā)突變的腫瘤，隨后克隆培養(yǎng)了大鼠骨髓MSC體內(nèi)突變的腫瘤細胞 株，并將其命名為K3細胞株，進一步證明了 K3細胞具有腫瘤細胞的多種生物學(xué)特性，為研 究MSC突變的腫瘤細胞的生物學(xué)特性及MSC安全應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
[0004] 因為目前對MSCs的致瘤性觀察時間多以月計算，缺乏長期的實驗室監(jiān)測，對突變 的MSC研究也不夠深入。因此間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株的建立為研究間質(zhì)干細胞體 內(nèi)瘤化的機制及腫瘤干細胞的生物學(xué)研究具有重要作用，為盡量減少間質(zhì)干細胞在體內(nèi)瘤 化，提高其應(yīng)用的安全性具有重要科研價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此本專利提供了一種新的間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述的間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株，命名為K3,保藏編號CGMCC N0. 9158。 本發(fā)明間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0007] (1)雄性大鼠骨髓MSC的分離培養(yǎng)；
[0008] (2) SD大鼠致瘤試驗：得到的雄性大鼠 MSC制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為 2X 106,取10只雌性SD大鼠，每只在0d，3d，7d，14d，21d分別尾靜脈注射大鼠 MSC。長期觀 察注射部位是否成瘤，20個月后自發(fā)突變成瘤；
[0009] (3)突變腫瘤細胞培養(yǎng)：在無菌條件下取尾部腫瘤組織，200目鋼網(wǎng)過濾掉大的團 塊后收集沖洗液，用密度為1. 〇77g/mL的Ficoll液分離，lOOOrpm離心5min。取單個核細 胞，PBS洗滌3次后棄上清，DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，置5% C02、飽和濕度、37°C二氧化碳培養(yǎng) 箱培養(yǎng)；
[0010] (4)有限稀釋克隆法獲得單克隆的間質(zhì)干細胞源腫瘤細胞株：培養(yǎng)的致瘤大鼠的 瘤細胞有限稀釋至1個細胞/200 μ L，接種于96孔培養(yǎng)板，顯微鏡觀察，標記上有單個細胞 的每孔，置5% C02、飽和濕度、37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天持續(xù)觀察，篩選出單個貼壁 瘤細胞孔后繼續(xù)培養(yǎng)，獲取有增殖能力的一株單細胞克?。麨镵3);
[0011] (5)雄性的性別決定（SRY)基因擴增鑒定K3細胞的來源：提取雄性大鼠 MSC、K3 細胞和致瘤鼠骨髓MSC的基因組DNA，PCR擴增SRY基因；
[0012] (6)裸鼠梯度致瘤試驗驗證K3細胞致瘤能力：K3細胞用PBS配制成各107、10 6、 ΙΟ5、ΙΟ4、103細胞濃度，分別接種裸鼠前肢右側(cè)背部皮下0. 2mL/只。裸鼠接種細胞后由中國 科學(xué)院上海實驗動物中心負責(zé)飼養(yǎng)，每天觀察一次，并記錄致瘤時間及瘤體大小。裸鼠致瘤 后，取致瘤裸鼠腫瘤組織作細胞培養(yǎng)、流式細胞儀分析、病理學(xué)及分子生物學(xué)等分析；
[0013] (7)K3細胞浸潤和轉(zhuǎn)移試驗：用K3細胞5X 106/0. 2mL注射裸鼠腹腔，觀察浸潤和 轉(zhuǎn)移；
[0014] (8)K3細胞生長曲線測定：制備正常大鼠骨髓MSC、K3細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為 4 X 104/mL，各接種于24孔培養(yǎng)板，每孔200 μ L培養(yǎng)體系，每3d換液1次。從第2d起每隔 24h計數(shù)3個孔的細胞數(shù)，取其平均值作為該天的細胞數(shù)，繪制12d的細胞生長曲線；
[0015] (9)病理學(xué)分析：取所有致瘤大鼠、致瘤裸鼠新鮮腫瘤組織，4%甲醛固定，石臘包 埋，切成5 μ m厚切片，經(jīng)HE染色后顯微鏡觀察；
[0016] (10)免疫組織化學(xué)染色：P53、PCNA免疫組化分析嚴格按操作說明書操作，主要 步驟：切片經(jīng)二甲苯脫蠟，抗原修復(fù)，小牛血清封閉后與各自抗體37°C孵育lh后加二抗 37°C 30min，再加 DAB顯色劑5-10min，封片后鏡檢。細胞漿或細胞核內(nèi)有棕黃色沉積者為 陽性；
[0017] (11)K3細胞株表面標志流式細胞分析：鑒定的主要標記有⑶29、⑶44、⑶45和 CD90 ;
[0018] (12)總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴增：提取正常大鼠骨髓MSC和突變的K3細胞的 總RNA，RT-PCR檢測Abcg2、0ct4和Bmi-1等基因表達情況，以β -actin基因為內(nèi)參照；
[0019] (13)染色體核型檢查：對所建立的K3細胞株進行核型分析；
[0020] 在其中一個實例中，步驟（2)中應(yīng)用得到的大鼠 MSC制備成單細胞懸液，其細胞濃 度為2 X 106,每只在0d，3d，7d，14d，21d尾靜脈注射大鼠 MSC5次，長期觀察尾部是否成瘤；
[0021] 在其中一個實例中，步驟（3)中應(yīng)用密度為1.077g/mL的Ficoll液分離，lOOOrpm 離心5min。取單個核細胞，PBS洗滌3次后棄上清，DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，置5% C02、飽和 濕度、37 °C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
[0022] 在其中一個實例中，步驟（4)通過有限稀釋克隆法得到了單克隆間質(zhì)干細胞來源 的腫瘤細胞株K3 ;
[0023] 在其中一個實例中，步驟（5-13)通過SRY基因鑒定、裸鼠梯度致瘤試驗、浸潤和轉(zhuǎn) 移試驗、生長曲線測定、病理學(xué)分析、免疫組織化學(xué)染色、流式細胞分析表面標記、RT-PCR擴 增干細胞標記基因及染色體核型檢查方法鑒定間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株的建立是 否成功。
[0024] 在其中一個實例中，通過對大鼠 MSC的體內(nèi)突變株K3細胞生物學(xué)特性的研究，為 MSC安全性應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
[0025] 在其中一個實例中，由于干細胞來源的腫瘤突變株更易獲得腫瘤干細胞，通過對 K3的流式細胞儀分選得到SP(side population)細胞，為腫瘤干細胞的研究提供可能。 本發(fā)明建立了一套分離、培養(yǎng)和鑒定間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株的方法，通過性 別特異基因 SYR的擴增、裸鼠梯度致瘤試驗、浸潤和轉(zhuǎn)移試驗、生長曲線測定、病理學(xué)分析、 免疫組織化學(xué)染色、流式細胞分析表面標記、PCR擴增Abcg2等干細胞相關(guān)基因及染色體核 型檢查方法鑒定間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株的建立成功。間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細 胞株的建立為研究間質(zhì)干細胞體內(nèi)瘤化的機制及腫瘤干細胞的生物學(xué)研究具有重要作用， 為盡量減少間質(zhì)干細胞在體內(nèi)瘤化，提高其應(yīng)用的安全性具有重要科研價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為間質(zhì)干細胞尾部體內(nèi)致瘤的照片；
[0027] 圖2為尾部致瘤的HE切片（40倍）；右圖為局部放大。
[0028] 圖3為倒置相差顯微鏡觀察本發(fā)明得到的間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株 K3 (200 倍）；
[0029] 圖4為雄性性別決定（SRY)基因的PCR擴增；
[0030] 圖5為間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株K3與正常大鼠骨髓間質(zhì)干細胞生長曲線 的比較；
[0031] 圖6為間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株K3裸鼠體內(nèi)的致瘤情況；
[0032] 圖7為間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株K3裸鼠體內(nèi)致瘤時產(chǎn)生肝轉(zhuǎn)移；
[0033] 圖8為正常大鼠骨髓MSC和間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株K3的P53和PCNA的 組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0034] 圖9為流式細胞儀對間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株K3的表面標記⑶29、⑶40、 ⑶90及⑶45陽性率的檢測；
[0035] 圖10為RT-PCR對間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株K3干性基因 Abcg2、0ct4和 Bmi-1基因表達情況的檢測；
[0036] 圖11為間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株K3的核型分析結(jié)果。 圖12為K3細胞Hoechst33342染色A:K3光學(xué)顯微鏡下形態(tài)（400X)B:K3熒光顯微鏡 下形態(tài)（400X)箭頭為Hoechst33342拒染細胞。
[0037] 圖13為流式細胞儀K3細胞中K3-SP細胞含量分析。 本發(fā)明所述的間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株K3于2014年4月24日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國 科學(xué)院微生物研究所），分類命名為wistar大鼠間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株K3,保藏 編號為 CGMCC NO. 9158。

【具體實施方式】
[0038] 以下實例所使用的主要材料和來源分別如下：
[0039] SD大鼠（江蘇大學(xué)實驗動物中心提供）；
[0040] BALB/c裸鼠（中國科學(xué)院上海實驗動物中心，周齡4-5W);
[0041] MSC培養(yǎng)試劑低糖DMEM、胎牛血清（Gibco公司產(chǎn)品）、胰蛋白酶（Sigma公司產(chǎn) 品）；
[0042] 免疫組織化學(xué)染色試劑（武漢博士德公司）；
[0043] 流式細胞分析試劑PE或FITC標記⑶29、⑶45、⑶44和⑶90購自美國BD公司；
[0044] RNA、DNA 提取試劑、RT-PCR 試劑盒（Invitrogen 公司）；
[0045] 二氧化碳培養(yǎng)箱（Forma公司）；PCR儀（2720, ABI公司），定量PCR儀為 Rotor_gene6000 real-time cycler (澳大利亞 Corbett Research 公司）。
[0046] 倒置顯微鏡，生物顯微鏡，超凈工作臺，臺式離心機，電熱恒溫水浴箱，凝膠成像分 析系統(tǒng)（SYNGENE BIO IMAGING SYSTTEMS)，深低溫冰箱，液氮罐，全自動消毒鍋，流式細胞 儀（BD 公司，F(xiàn)ASC Calibar);
[0047] 實施例一：細胞株的建立，對本發(fā)明具體實施步驟描述如下
[0048] (1)大鼠骨髓MSC(雄性）培養(yǎng)：將大鼠頸椎脫臼致死，75%酒精消毒大鼠的后肢， 在無菌條件下取出其雙側(cè)股骨備用。剔除股骨表面的肌肉，PBS沖洗表面，剪去兩端，露 出髓腔。用DMEM液沖洗髓腔至沖洗液變得澄清。輕輕吹打沖洗液，用200目鋼網(wǎng)過濾掉 大的團塊后收集沖洗液，l〇〇〇rpm離心5min。棄上清，DMEM培養(yǎng)基重懸細胞。顯微鏡下計 數(shù)后，以5 X 105單個核細胞/mL接種于50ml培養(yǎng)瓶中，每瓶含5ml完全DMEM培養(yǎng)液（完全 DMEM培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液中含10% FBS，青、鏈霉素100U/mL)，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 3d后換液，去掉非貼壁細胞，以后每3d換液1次。大約培養(yǎng)10d左右，貼壁細胞形成融合 層，用0. 25%胰蛋白酶（用lmmol/L EDTANa2配制）消化，見細胞皺縮，加入胎牛血清終 止消化，，輕輕吹打使貼壁細胞脫落，按1:3的比例再次接種傳代，每日于倒置顯微鏡下觀 察細胞形態(tài)與增殖情況，拍照并記錄。當(dāng)這些細胞生長接近融合層時，通過表面標記和誘導(dǎo) 成脂成骨實驗鑒定獲得的細胞為MSC ;
[0049] (2) SD大鼠體內(nèi)MSC致瘤試驗：得到的大鼠 MSC制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度 為2 X 106,取10只SD大鼠（雌性），每只在0d，3d，7d，14d，21d尾靜脈注射大鼠 MSC，長期 觀察。培養(yǎng)的SD大鼠骨髓間質(zhì)干細胞尾靜脈注射20個月后，其中大鼠出現(xiàn)肉眼可見腫瘤 結(jié)節(jié)（圖1);組織病理結(jié)果顯示瘤組織結(jié)構(gòu)欠規(guī)則，編織樣排列，有出血、壞死，毛細血管豐 富，與周圍正常組織境界不清，呈浸潤性生長，瘤細胞周圍多核巨細胞反應(yīng)即為致瘤成功。 瘤細胞呈梭形，大小欠一致，核深染，異形明顯，分裂相多見（圖2);
[0050] (3)間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞分離培養(yǎng)：致瘤大鼠、裸鼠頸椎脫日致死，在無 菌條件下取腫瘤組織，用200目鋼網(wǎng)過濾掉大的團塊后收集沖洗液，用密度為1.077g/mL的 Ficoll液分離，lOOOrpm離心5min，取單個核細胞，PBS洗滌3次后，棄上清，用DMEM培養(yǎng) 基重懸細胞。置5% C02、飽和濕度、37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。致瘤大鼠、裸鼠的瘤細胞培 養(yǎng)第2d倒置顯微鏡下可見單個或少量成群落生長的貼壁細胞，形態(tài)大多呈短梭形、菱形， 有一個核位于中央，可見核仁。3d后細胞集落不斷的擴大并形成融合單層，細胞形態(tài)大多呈 長梭形或多角形。與MSC-樣經(jīng)胰酶消化傳代培養(yǎng)后，不再以集落方式生長，而呈均勻分布 生長，形態(tài)以長梭形為主（圖3)。從形態(tài)上觀察各瘤細胞的形態(tài)特點并不完全一樣，與正常 MSC存在明顯差異。生長增殖有顯著差異，腫瘤細胞存在明顯的異質(zhì)性。
[0051] (4)間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤單細胞克隆的建立：致瘤大鼠瘤細胞有限稀釋至1 個細胞/200 μ L，接種于96孔培養(yǎng)板，顯微鏡觀察，標記上有一個細胞的每孔，置5% C02、 飽和濕度、37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第二天顯微鏡觀察，篩選出單個貼壁瘤細胞孔，繼續(xù) 培養(yǎng)，獲取了有增殖能力的單細胞克隆（命名為K3);
[0052] (5) PCR擴增雄性的性別決定（SRY)基因：提取雄性大鼠 MSC、K3細胞和致瘤鼠骨 髓MSC的基因組DNA，PCR擴增SRY基因以鑒定腫瘤細胞株的來源，結(jié)果顯示腫瘤細胞株來 源于雄性證明為雄性骨髓間質(zhì)干細胞瘤化形成（圖4); 表1擴增SRY，β -actin基因組DNA的引物序列

【權(quán)利要求】
1. 一株大鼠間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株，命名為K3,保藏編號CGMCC NO. 9158。
2. 權(quán)利要求1所述大鼠間質(zhì)干細胞體內(nèi)突變腫瘤細胞株K3在腫瘤干細胞的SP分離 和裸鼠體內(nèi)的K3分離腫瘤干細胞的相關(guān)研究中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/095GK104232583SQ201410236304
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】錢暉, 許文榮, 張斌, 毛飛, 朱偉, 丁小青, 王興忠, 謝穎, 葉惠慧 申請人:江蘇大學(xué)