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      3號染色體上與水稻干尖線蟲抗性qtl連鎖的ssr標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:477997閱讀:334來源:國知局
      3號染色體上與水稻干尖線蟲抗性qtl連鎖的ssr標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明的實質(zhì)是根據(jù)連鎖分離規(guī)律,以水稻干尖線蟲抗病品種Tetep和感病品種淮稻5號雜交后代F2群體為作圖群體,通過水稻干尖線蟲抗性鑒定結(jié)果和SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)間的連鎖分析,獲得了3號染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的SSR標(biāo)記RM5626和RM7097。通過檢測Tetep及其衍生品種(系)與水稻干尖線蟲感病品種雜交組合后代單個水稻植株的SSR標(biāo)記帶型,可以判斷該植株是否具有水稻干尖線蟲抗性,將其應(yīng)用于Tetep及其衍生品種(系)/感病品種水稻干尖線蟲抗病品種的輔助選擇育種中,可以克服常規(guī)育種中水稻干尖線蟲抗性鑒定穩(wěn)定性和重復(fù)性差和費時費力等缺點,其結(jié)果可以簡化選擇方法和提高育種效率,進(jìn)而加快抗水稻干尖線蟲水稻病品種的選育進(jìn)程。
      【專利說明】3號染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的SSR標(biāo)記及其應(yīng)用
      【技術(shù)領(lǐng)域】:
      [0001]本發(fā)明涉及3號染色體上一種與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記RM5626和RM7097,可應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種,屬于水稻抗病育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
      【背景技術(shù)】:
      [0002]水稻干尖線蟲是一種水稻外寄生病原物,其典型癥狀是葉片尖部扭曲成干尖,該病害一旦發(fā)生會使糧食產(chǎn)量損失慘重(Journal ofthe faculty of Agriculture,Kyushu, University,1950, 9(3):309-333 ;Nematologica,1975,21 (3):351-357 ; JournalofAgricultural Technology, 2011, 337-344)。水稻干尖線蟲傳統(tǒng)控制方法成本大,還會造成嚴(yán)重的環(huán)境問題(Journal of Agricultural Science and Technology, 2011,14 (I):195-203)。利用水稻品種自身抗性是控制水稻干尖線蟲最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、有效的策略(Annualreview ofphytopathology,2001,39 (I):285-312 ;Plant resistance to parasiticnematodes,2002,141-151)。
      [0003]育種家曾篩選到一些水稻干尖線蟲抗性品種,如cvs Arkansas Fortuna,Nira43, Asa-Hi, Binam, Domsiah 等(Phytopathology, 1949, 39 ;Bulletin of the KyushuAgricultural Experiment Station, 1953,1 (3):339-349 ;Journal of AgriculturalScience and Technology, 2011,14 (I): 195-203)。但有些水稻干尖線蟲抗性品種要么僅在特一地區(qū)表現(xiàn)抗性,要么僅對水稻干尖線蟲表現(xiàn)抗性,對其他病原物高度敏感或僅有較低的產(chǎn)量(Plant parasitic nematodes in subtropical and tropical agriculture, 2005,87-130)。另外,水稻干尖線蟲種群的遺傳變異會降低抗性品種的有效抗性,甚至造成品種抗性的消失。目前,水稻品種對水稻干尖線蟲抗性的遺傳基礎(chǔ)及其分子機(jī)制也不清楚。闡明水稻對干尖線蟲的抗性遺傳基礎(chǔ)及其分子機(jī)制有助于更深入的了解線蟲與水稻的互作機(jī)制,為線蟲抗性育種奠定基礎(chǔ)(The Plant Journal2004, 38 (2):285-297)。另外,為寄主植物線蟲抗性基因的鑒定和分離以及進(jìn)一步在分子和生化水平上研究線蟲與植物的互作機(jī)制提供了新的視野(The Plant Journal, 2002, 31 (2):127-136)。迄今,在甜菜、番茄、馬鈴薯、大豆等作物中定位到Hl、GroVl、Cre、Mi3等許多線蟲抗性位點(Genome, 1993, 36 (I):152-156 ;Molecular Breeding,1996,2(I):51-60 !Theoretical and Applied Genetics,
      1994,89(7-8):927-930 !Theoretical and Applied Genetics,1995,91(3):457-464)。而且,已克隆到Hslpro-1、M1-1、Hero A和Gpa2等幾個線蟲抗性基因并對這些抗性基因進(jìn)行了遺傳和功能分析(Sciencel997, 275 (5301):832-834 ;Nature biotechnology, 1998,16(13):1365-1369 ;The Plant Journal,2002,31(2):127-136 ;The Plant Journal,2000,23(5):567-576),這極大的增強(qiáng)了我們對這些寄主作物線蟲抗性的分子機(jī)制的認(rèn)識。然而,目前未見關(guān)于水稻品種對水稻干尖線蟲抗性的數(shù)量性狀位點(Quantitative TraitLocus, QTL)或基因的報道,對水稻干尖線蟲的抗性研究僅在品種抗性鑒定水平上,這極大的限制了水稻干尖線蟲抗性資源在抗性育種中的有效利用。[0004]分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)有效的解決了這一問題,通過構(gòu)建重要抗源的遺傳連鎖圖譜和QTL分析,可以有效的找到與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記,使用這些標(biāo)記可以對該抗源的后代及其衍生品系在苗期進(jìn)行早世代篩選,淘汰感病植株,不僅節(jié)約了成本,還提聞了育種效率。

      【發(fā)明內(nèi)容】
      :
      [0005]本發(fā)明針對上述研究背景,以篩選到的水稻干尖線蟲抗病品種Tetep和感病主栽品種淮稻5號為材料,在842對(http://www.gramene.0rg)微衛(wèi)星標(biāo)記中篩選到160個多態(tài)性SSR標(biāo)記,從中選用127個SSR標(biāo)記對淮稻5號/Tetep F2群體進(jìn)行分析,構(gòu)建水稻遺傳連鎖圖譜,將其與F2: 3家系水稻干尖線蟲人工接種鑒定后百粒線蟲數(shù)(The number ofA.besseyi inlOOgrains, NA)間進(jìn)行連鎖分析,獲得了 3號染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的SSR標(biāo)記RM5626和RM7097,可應(yīng)用于水稻干尖線蟲抗病品種的分子輔助選擇育種。[0006]本發(fā)明所提供的3號染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的SSR標(biāo)記RM5626和RM7097,是通過以下方法獲得的:
      [0007]I)感病品種淮稻5號(早)與抗病品種Tet印(^ )雜交獲得雜種F1, F1自交得F2群體,單株收獲F2: 3家系種子用于水稻干尖線蟲抗性鑒定;
      [0008]2) CTAB法提取親本、F1及F2群體138個單株的DNA ;
      [0009]3)利用選出的127對SSR引物對親本、F1及F2群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,獲得分子標(biāo)記數(shù)據(jù),構(gòu)建遺傳連鎖圖;
      [0010]4)親本淮稻5號、Tetep及其雜交后代F1和F2: 3家系進(jìn)行水稻干尖線蟲人工接種鑒定,種子成熟后單穗收種,統(tǒng)計NA。
      [0011]5)根據(jù)標(biāo)記帶型用MAPMAKER/EXP3.0軟件計算出標(biāo)記間連鎖遺傳距離,并用Mapdraw根據(jù)各標(biāo)記在染色體上的位置畫圖,構(gòu)建水稻遺傳連鎖圖譜;
      [0012]6)采用基于復(fù)合區(qū)間作圖法軟件Windows QTL Cartographer V2.5檢測水稻干尖線蟲的抗性QTL。LOD值的閾值定為2.5,按P = 0.05概率值檢測抗性QTL的數(shù)目及其在染色體上的位置。
      [0013]3號染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記RM5626和RM7097的應(yīng)用包括:以Tetep及其衍生品種(系)與水稻干尖線蟲感病品種雜交組合后代的單個水稻植株為對象,通過檢測其3號染色體上RM5626和RM7097標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù),可以預(yù)測該植株對水稻干尖線蟲的抗性。
      [0014]本發(fā)明能克服常規(guī)育種中水稻干尖線蟲抗性鑒定穩(wěn)定性、重復(fù)性較差及費時費力等缺點,其結(jié)果可以簡化選擇方法和提高育種效率,進(jìn)而加快抗病品種的育種進(jìn)程。
      【專利附圖】

      【附圖說明】:
      [0015]圖1利用淮稻5號/Tet印F2群體構(gòu)建的分子遺傳連鎖圖譜
      [0016]圖2 3號染色體上水稻干尖線蟲抗性QTL遺傳連鎖群定位分析示意圖
      [0017]注:抗性QTL連鎖群區(qū)段;左側(cè)為標(biāo)記間遺傳距離(CM);右側(cè)為標(biāo)記名稱【具體實施方式】:
      [0018]下面實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
      [0019]實施例1,與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記的獲得
      [0020]1、植物材料
      [0021]2008年在江蘇省農(nóng)科院大田種植淮稻5號和Tet印,并雜交獲得雜種F1,次年F1自交得F2種子,2009年在海南繁殖F2群體,作為作圖群體。F2單株編號,分蘗期取親本、雜種F1及F2群體各單株的部分葉片,_70°C冰箱保存用于SSR分析,F(xiàn)2群體單株收種,以備表型鑒定。
      [0022]2、線蟲的培養(yǎng)與分離
      [0023]將灰葡萄抱菌(Botrytiscinerea)菌塊接種在 Potato Dextrose Agar (PDA)培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng),待灰葡萄孢菌長滿培養(yǎng)基后,用3%雙氧水對水稻干尖線蟲表面消毒IOmin,滅菌超純水洗滌3次后,將約400頭水稻干尖線蟲接種到長滿培養(yǎng)基的灰葡萄孢菌上,于 25°C 培養(yǎng) 20d 左右(Journal of nematology, 2009,41 (I):17)。用 Baermann 漏斗技術(shù)分尚培養(yǎng)的水稻干尖線蟲,并用3%雙氧水表面消毒(Rice Science, 2009,16 (4):301-306),無菌水沖洗后收集線蟲,作為接種材料。
      [0024]3、CTAB 法提取 DNA
      [0025]I)稱取500mg水稻葉片置于2.0mL Eppendorf管中,將離心管置于液氮中冷卻,灌滿液氮后迅速取出,用研磨棒研磨成粉末狀;
      [0026]2)65°C條件下水浴 1-1.5h,15min 震蕩 I 次;
      [0027]3)4°C條件下13,OOOrpm離心10min,取上層水相;
      [0028]4)加入900 μ L氯仿:異戊醇溶液(24: I),充分混勻震蕩至溶液顏色由綠色變?yōu)榘咨?br> [0029]5)4°C條件下13,OOOrpm離心10min,取上層水相;
      [0030]6)加入等體積異丙醇,_20°C條件下靜置20-30min,沉淀出絮狀DNA ;
      [0031]7)4°C條件下13,OOOrpm離心10min,棄上清,加入lmL70%乙醇洗滌,4°C條件下13, OOOrpm離心5min,棄上清,置于超凈臺上晾干;
      [0032]8)加30 μ L去離子水溶解DNA,4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0033]用EppendorfBioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀測定OD值和濃度,將各樣品DNA稀釋至20ng/ μ L備用。
      [0034]4、SSR標(biāo)記分析
      [0035](I) PCR 擴(kuò)增
      [0036]采用10 μ L 的 PCR 反應(yīng)體系:DNA (IOng/ μ L) 1.3 μ L,Primer (4pmol/ μ L) 1.5 μ L,10 X PCR buffer (w/Mg) 1.5 μ L,dNTP (2.5mM) 0.2 μ L, Taq (5U/ μ L)0.1 μ L, ddH205.4 μ L。PCR反應(yīng)程序:95°C變性5min ;95°C變性30s、54°C退火30s、72°C延伸lmin,進(jìn)行35個循環(huán);72°C延伸lOmin。產(chǎn)物加入loading buffer中止反應(yīng),待用。
      [0037](2)聚丙烯酰胺凝膠電泳
      [0038]采用8%聚丙烯酰胺凝膠檢測上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物,所用的電泳儀為雙板夾芯垂直電泳槽DYCZ-30型(北京六一儀器廠)。具體操作步驟如下:
      [0039]I)用洗潔精把玻璃板反復(fù)擦洗干凈,用蒸餾水沖洗,烘箱烘干,組裝玻璃板之前可用酒精擦拭;
      [0040]2)將兩塊玻璃板放進(jìn)橡膠封條內(nèi),瓊脂糖凝膠封住底部安裝至電泳槽上;
      [0041]3)按表1順序加入各儲液配制丙烯酰胺凝膠,充分搖勻后用移液器將配好的膠均勻注入兩玻璃板之間,再插入梳子,注意防止梳子底部產(chǎn)生氣泡。靜置Ih左右待其凝固;
      [0042]表1制備聚丙烯酰胺凝膠所用試劑的體積
      [0043]
      【權(quán)利要求】
      1.一種與水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記,其特征在于:以水稻干尖線蟲感病品種與抗病品種Tetep雜交后代F2群體為作圖群體,通過簡單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)數(shù)據(jù)與水稻干尖線蟲人工接種鑒定后百粒線蟲數(shù)(NA)之間的連鎖分析,獲得3號染色體上與水稻干尖線蟲抗性QTL(qNA3)連鎖的SSR標(biāo)記RM5626和RM7097。
      2.按照權(quán)利I所獲得一種與水稻干尖線蟲感病品種/Tetep雜交組合中水稻干尖線蟲抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記的應(yīng)用,其特征在于:以Tetep及其衍生品種(系)與水稻干尖線蟲感病品種雜交后代的單個水稻植株為對象,通過檢測其分子標(biāo)記RM5626和RM7097的帶型數(shù)據(jù),可以判斷該植 株是否抗水稻干尖線蟲。
      【文檔編號】C12N15/11GK103981181SQ201410239721
      【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月25日
      【發(fā)明者】周彤, 杜琳琳, 周益軍, 高存義, 蘭瑩, 孫楓 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
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