牛羊肉及其制品的性別來源的鑒定引物、試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛羊肉及其制品的性別來源的鑒定引物、試劑盒和方法，屬于動物源成分的性別鑒定【技術領域】，試劑盒包括PCR擴增反應液，具體包括下列組分：熱啟動的TaqDNA聚合酶、氯化鎂、dNTP、上下游引物、SYBRGreen熒光染料；其中上游引物SRY-1F：5'-CGAAGACGAAAGKTGGCTCT-3'，下游引物SRY-1R：5'-TGTGCCTCCTCAAAGAATGG-3'。鑒定方法包括產(chǎn)品DNA的提取、肉類特異性基因的實時熒光PCR擴增和使用熒光定量PCR儀隨機軟件分析擴增結果并進行結果判定。本發(fā)明的優(yōu)點是快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便、成本低。
【專利說明】牛羊肉及其制品的性別來源的鑒定引物、試劑盒和方法【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種牛羊肉及其制品的性別來源的鑒定技術，屬于動物源成分的性別鑒定【技術領域】。
【背景技術】
[0002]不同性別對牛肉品質的影響主要表現(xiàn)在大理石花紋、嫩度和風味上。一般來說，公牛肉的嫩度比閹牛和母牛的差，母牛肉比閹牛肉差。閹牛中公閹牛肉的嫩度也比母閹牛和母牛的差。但也有公牛肉嫩度較好的報道。在肉的色澤和感官特性方面閹牛和小母牛也要好于公牛。公牛沉積脂肪的能力比閹牛和母牛差，肌內(nèi)脂肪含量低，大理石花紋等級低，因此高檔牛肉的生產(chǎn)中必須對公牛實行閹割。公牛肉含有的特殊膻味也會影響肉的風味。性別對風味的影響主要與性激素產(chǎn)生、代謝的遺傳控制以及性激素對脂類組成和代謝的影響有關。雄激素會增加蛋白質的沉積，減少脂肪合成，因此，公牛肉一般比母牛肉和閹牛肉瘦。雄激素也是導致公牛肉特殊膻味的原因。
[0003]在新西蘭和英國等國，對羊肉分類，主要是對綿羊胭體而言。先是將綿羊桐體分為大羊肉和羔羊肉兩大類，羔羊肉為12月齡內(nèi)(沒換乳齒)屠宰的羊肉，其中大部分為4 一 6月齡屠宰的羊胴體，稱之為肥羔肉。大羊肉則泛指滿12月齡并巳換I對以上乳齒才屠宰的羊肉。在大羊肉中，新西蘭又將其分為育成羊肉(指處女羊或屠宰時不超過I對恒齒的揭羊一最高胭體重不超過25.4kg )、揭羊肉和母羊肉(指產(chǎn)過羔羊的母羊)三類。英國則把大羊肉分為育成羊肉、母羊肉和公羊肉三類。在英國對羔羊肉和育成羊肉不進行性別的區(qū)分。
[0004]在國際貿(mào)易貿(mào)易中常常需要對牛、羊肉的公母進行鑒定，本發(fā)明針對此項需求研究開發(fā)。。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種牛羊肉及其制品的性別來源的鑒定技術，具體是用實時熒光PCR技術檢測牛羊肉及其制品的性別來源，為牛羊肉制品檢測提供有效手段，從而加強對食品質量問題的監(jiān)督，保護消費者的合法權益。
[0006] 本發(fā)明的主要原理為:針對保守序列設計一組引物(上游引物:SRY-1F:5’-CGAAGA CGA AAG KTG GCT CT-3’，下游引物 SRY-1R:5’-TGT GCC TCC TCA AAG AAT GG-3’)。進行核酸檢測時，模板DNA經(jīng)加熱至94-95°C—定時間后，DNA雙鏈解離，即變性成單鏈。當溫度下降到退火溫度時，兩條單鏈重新配對，即復性。PCR擴增的產(chǎn)物，變性狀態(tài)下呈單鏈，熒光染料不與其結合就沒有熒光信號。當溫度為退火溫度時，PCR產(chǎn)物復性成為雙鏈DNA，熒光染料與其結合，可以檢測到強的熒光信號。在雙鏈DNA最多時，熒光信號最高，即出現(xiàn)吸收峰，也就是在退火溫度下出現(xiàn)最高的吸收峰。
[0007]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是:
本發(fā)明提供一種鑒定牛羊肉及其制品的性別來源的引物，上游引物 SRY-1F:5’ -CGAAGACGAAAGKTGGCTCT-3’，
下游引物 SRY-1R:5’ -TGTGCCTCCTCAAAGAATGG-3’。
[0008]本發(fā)明還提供牛羊肉及其制品的性別來源鑒定試劑盒，其中的試劑包括如下:
(一)PCR擴增反應液A，包括I XPCR Master Mix和SYBR Green熒光染料
(1)I XPCR Master Mix,具體包括下列組分:
熱啟動的 Taq DNA聚合酶8U/KL、4 mmol/L 氯化續(xù)、0.4 mmol /T, dNTP>400 nmol/L上下游引物；
上游引物 SRY-1F:5’-CGA AGA CGA MG KTG GCT CT-3’，下游引物SRY-1R:5’-TGT GCCTCC TCA AAG AAT GG-3’ ；其中上游引物和下游引物的質量比為1:1 ；
(2)SYBR Green 熒光染 料；
所述PCR擴增反應液A，每管24 μ L的組成為:23.75μL IXPCR Master Mix和1.25μLSYBR Green熒光染料。
[0009](二)陽性對照 DNA。
[0010]使用上述試劑盒鑒定牛羊肉及其制品的性別來源，依次包括下列步驟:
(I)待檢樣品DNA的提取
DNA提取可使用CTAB法。
[0011](2)牛羊肉及其制品的性別來源基因的實時熒光PCR擴增
A.在裝有24PL PCR擴增反應液A的反應管中加入WL待檢樣品DNA，混勻。
[0012]B.將PCR反應管放入熒光PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
950C 15min, I個循環(huán)預變性；
950C 15sec,60°C lmin，40 個循環(huán)。
[0013](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，測定熔點曲線。公牛性別特異性擴增產(chǎn)物熔解曲線峰值在84.5±0.5 °C，母牛的該基因沒有擴增。公羊性別特異性擴增產(chǎn)物熔解曲線峰值在83.5±0.5 °C，母羊的該基因沒有擴增。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明建立了牛羊肉及其制品的性別來源鑒定方法，具有快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便、成本低的特點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0016]圖1牛羊性別特異性引物PCR產(chǎn)物的溶解曲線圖譜。公牛性別特異性擴增產(chǎn)物熔解曲線峰值在84.5±0.5 °C，母牛的該基因沒有擴增。
[0017]圖2牛羊性別特異性引物PCR產(chǎn)物的溶解曲線圖譜。公羊性別特異性擴增產(chǎn)物熔解曲線峰值在83.5±0.5 °C，母羊的該基因沒有擴增。
[0018]圖3鑒定牛肉干性別來源的PCR產(chǎn)物的溶解曲線圖譜。檢測結果2份牛肉干樣品來源于公牛肉，2份來源于母牛肉。公牛性別特異性擴增產(chǎn)物熔解曲線峰值在84.5 V,母牛的該基因沒有擴增。
[0019]圖4鑒定熟羊肉制品性別來源的PCR產(chǎn)物的溶解曲線圖譜。檢測結果2份牛肉干樣品來源于公牛肉，2份來源于母牛肉。公羊性別特異性擴增產(chǎn)物熔解曲線峰值在83.5°c，母羊的該基因沒有擴增。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
按下述方法檢測公牛的肉，使用母奶牛的肉作為實驗的陰性對照:
包括IXPCR Master Mix(內(nèi)含熱啟動的Taq DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP)，400 nmol/L 上下游引物，1.25μL SYBR Green 熒光染料；上游引物 SRY-1F:5’ -CGA AGA CGA AAG KTGGCT CT-3，，下游引物 SRY-1R:5，-TGT GCC TCC TCA AAG AAT GG-3’ ；
按照以下程序進行檢測:
(I)待測樣品DNA的提取
A.稱取經(jīng)過預處理的待測樣本1.00 g至50 mL離心管中。
[0021]B.加入10 mL65°C預熱的CTAB提取緩沖液和RNase A酶(使其終濃度為10 μ g/mL)，顛倒混勻后于65°C溫育30 min，期間顛倒混勻離心管2~3次；12000 g離心10 min，轉移ImL上清液至2 mL離心管中。
[0022]C.在離心管中加入與上清液等體積的三氯甲烷中，上下顛倒充分混勻，12000 g離心10 min，轉移上清液600 μ L至2 mL離心管中。
[0023]D.加入2倍體積CTAB沉淀液，顛倒混勻后，室溫靜置I h ； 12000 g離心10 min,
棄去上清液。
[0024]E.向沉淀中加入400 μ L氯化鈉溶液，使之沉淀溶解，之后轉移溶液至1.5 mL離心管。
[0025]F.在溶解液中加入等體積三氯甲烷，顛倒混勻后，12000 g離心10 min，轉移上層水相至1.5 mL離心管中。
[0026]G.加入0.6倍體積經(jīng)4°C預冷的異丙醇，顛倒混勻后，于4°C下靜置30 min ；12000g離心10 min,小心棄去上清液。
[0027]H.加入500 μ L70%乙醇，震蕩離心柱管，12000 g離心10 min，棄去上清液，重復
一次，在室溫下?lián)]干液體。
[0028]1.加入100 UL TE溶液溶解DNA，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0029](2)待測樣品DNA的實時熒光PCR擴增
A.在PCR反應管中加入24PL PCR反應液A和WL樣品DNA，混勻。
[0030]B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
950C 15min, I個循環(huán)預變性；
950C 15sec,60°C lmin，40 個循環(huán)。
[0031](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，測定熔點曲線。 [0032]結果如圖1所示，公牛性別特異性擴增產(chǎn)物熔解曲線峰值在84.5 °C，母牛的該基因沒有擴增。
[0033]實施例2
按下述方法檢測公羊的肉，使用母羊的肉作為實驗的陰性對照::
包括IXPCR Master Mix(內(nèi)含熱啟動的Taq DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP)，400 nmol/L 上下游引物，1.25PL SYBR Green 熒光染料；上游引物 SRY-1F:5’-CGA AGA CGA AAG KTGGCT CT-3，，下游引物 SRY-1R:5，-TGT GCC TCC TCA AAG AAT GG-3’ ；
按照以下程序進行檢測:
(I)待測樣品DNA的提取
A.稱取經(jīng)過預處理的待測樣本1.0O g至50 mL離心管中。
[0034]B.加入10 mL65°C預熱的CTAB提取緩沖液和RNase A酶(使其終濃度為10 μ g/mL)，顛倒混勻后于65°C溫育30 min，期間顛倒混勻離心管2~3次；12000 g離心10 min，轉移ImL上清液至2 mL離心管中。
[0035]C.在離心管中加入與上清液等體積的三氯甲烷中，上下顛倒充分混勻，12000 g離心10 min，轉移上清液600 μ L至2 mL離心管中。
[0036]D.加入2倍體積CTAB沉淀液，顛倒混勻后，室溫靜置I h ； 12000 g離心10 min,
棄去上清液。
[0037]E.向沉淀中加入400 μ L氯化鈉溶液，使之沉淀溶解，之后轉移溶液至1.5 mL離
心管。
[0038]F.在溶解液中加入等體積三氯甲烷，顛倒混勻后，12000 g離心10 min，轉移上層水相至1.5 mL離心管中。
[0039]G.加入0.6倍體積經(jīng)4°C預冷的異丙醇，顛倒混勻后，于4°C下靜置30 min ；12000g離心10 min,小心棄去上清液。
[0040]H.加入500 μ L70%乙醇，震蕩離心柱管，12000 g離心10 min，棄去上清液，重復
一次，在室溫下?lián)]干液體。
[0041]1.加入100 UL TE溶液溶解DNA，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0042](2)待測樣品DNA的實時熒光PCR擴增
A.在PCR反應管中加入24PL PCR反應液A和WL樣品DNA，混勻。
[0043]B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
950C 15min, I個循環(huán)預變性；
950C 15sec,60°C lmin，40 個循環(huán)。
[0044](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，測定熔點曲線。
[0045]結果如圖2所示，公羊性別特異性擴增產(chǎn)物熔解曲線峰值在83.5 °C，母羊的該基因沒有擴增。
[0046]實施例3
按下述方法檢測4份市售牛肉干，使用母牛的肉作為實驗的陰性對照::
包括IXPCR Master Mix(內(nèi)含熱啟動的Taq DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP)，400 nmol/L 上下游引物，1.25μL SYBR Green 熒光染料；上游引物 SRY-1F:5’ -CGA AGA CGA AAG KTGGCT CT-3，，下游引物 SRY-1R:5，-TGT GCC TCC TCA AAG AAT GG-3’ ；
按照以下程序進行檢測:
(I)待測樣品DNA的提取
A.稱取經(jīng)過預處理的待測樣本1.00 g至50 mL離心管中。
[0047]B.加入10 mL65°C預熱的CTAB提取緩沖液和RNase A酶(使其終濃度為10 μ g/mL)，顛倒混勻后于65°C溫育30 min，期間顛倒混勻離心管2~3次；12000 g離心10 min，轉移ImL上清液至2 mL離心管中。[0048]C.在離心管中加入與上清液等體積的三氯甲烷中，上下顛倒充分混勻，12000 g離心10 min，轉移上清液600 μ L至2 mL離心管中。
[0049]D.加入2倍體積CTAB沉淀液，顛倒混勻后，室溫靜置I h ； 12000 g離心10 min,
棄去上清液。
[0050]E.向沉淀中加入400 μ L氯化鈉溶液，使之沉淀溶解，之后轉移溶液至1.5 mL離心管。
[0051]F.在溶解液中加入等體積三氯甲烷，顛倒混勻后，12000 g離心10 min，轉移上層水相至1.5 mL離心管中。
[0052]G.加入0.6倍體積經(jīng)4°C預冷的異丙醇，顛倒混勻后，于4°C下靜置30 min ；12000g離心10 min,小心棄去上清液。
[0053]H.加入500 μ L70%乙醇，震蕩離心柱管，12000 g離心10 min，棄去上清液，重復
一次，在室溫下?lián)]干液體。
[0054]1.加入100 UL TE溶液溶解DNA，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0055](2)待測樣品DNA的實時熒光PCR擴增
A.在PCR反應管中加入24PL PCR反應液A和WL樣品DNA，混勻。
[0056]B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
950C 15min, I個循環(huán)預變性；
950C 15sec,60°C lmin，40 個循環(huán)。
[0057](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，測定熔點曲線。
[0058]結果如圖3所示，檢測結果2份牛肉干樣品來源于公牛肉，2份來源于母牛肉。公牛性別特異性擴增產(chǎn)物熔解曲線峰值在84.5 °C，母牛的該基因沒有擴增。
[0059]實施例4
按下述方法檢測6份市售熟羊肉，使用母羊的肉作為實驗的陰性對照:
包括IXPCR Master Mix(內(nèi)含熱啟動的Taq DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP)，400 nmol/L 上下游引物，1.25PL SYBR Green 熒光染料；上游引物 SRY-1F:5’-CGA AGA CGA AAG KTGGCT CT-3，，下游引物 SRY-1R:5，-TGT GCC TCC TCA AAG AAT GG-3’ ；
按照以下程序進行檢測:
(I)待測樣品DNA的提取
A.稱取經(jīng)過預處理的待測樣本1.00 g至50 mL離心管中。
[0060]B.加入10 mL65°C預熱的CTAB提取緩沖液和RNase A酶(使其終濃度為10 μ g/mL)，顛倒混勻后于65°C溫育30 min，期間顛倒混勻離心管2~3次；12000 g離心10 min，轉移ImL上清液至2 mL離心管中。
[0061]C.在離心管中加入與上清液等體積的三氯甲烷中，上下顛倒充分混勻，12000 g離心10 min，轉移上 清液600 μ L至2 mL離心管中。
[0062]D.加入2倍體積CTAB沉淀液，顛倒混勻后，室溫靜置I h ； 12000 g離心10 min,
棄去上清液。
[0063]E.向沉淀中加入400 μ L氯化鈉溶液，使之沉淀溶解，之后轉移溶液至1.5 mL離心管。
[0064]F.在溶解液中加入等體積三氯甲烷，顛倒混勻后，12000 g離心10 min，轉移上層水相至1.5 mL離心管中。
[0065]G.加入0.6倍體積經(jīng)4°C預冷的異丙醇，顛倒混勻后，于4°C下靜置30 min ；12000g離心10 min,小心棄去上清液。
[0066]H.加入500 μ L70%乙醇，震蕩離心柱管，12000 g離心10 min，棄去上清液，重復
一次，在室溫下?lián)]干液體。
[0067]1.加入100 UL TE溶液溶解DNA，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0068](2)待測樣品DNA的實時熒光PCR擴增
A.在PCR反應管中加入24PL PCR反應液A和WL樣品DNA，混勻。
[0069]B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
950C 15min, I個循環(huán)預變性；
950C 15sec,60°C lmin，40 個循環(huán)。
[0070](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，測定熔點曲線。
[0071] 結果如圖4所示，檢測結果4份熟羊肉樣品來源于公羊肉，2份來源于母羊肉。公羊性別特異性擴增產(chǎn)物熔解曲線峰值在83.5 V，母羊的該基因沒有擴增。
【權利要求】
1.一種鑒定牛羊肉及其制品的性別來源的引物，其特征在于:
上游引物 SRY-1F:5’ -CGAAGACGAAAGKTGGCTCT-3’，
下游引物 SRY-1R:5’ -TGTGCCTCCTCAAAGAATGG-3’。
2.一種鑒定牛羊肉及其制品的性別來源的試劑盒，其特征在于，包括下列試劑: (一)PCR擴增反應液A，包括IXPCR Master Mix和SYBR Green熒光染料 (1)I XPCR Master Mix,具體包括下列組分: 熱啟動的 Taq DNA聚合酶8U/KL、4 mmol/L 氯化續(xù)、0.4 mmol /T, dNTP、400 nmol/L上下游引物； 上游引物 SRY-1F:5’-CGA AGA CGA MG KTG GCT CT-3’，下游引物SRY-1R:5’-TGT GCCTCC TCA AAG AAT GG-3’ ；其中上游引物和下游引物的質量比為1:1 ； (2)SYBR Green 熒光染料； 所述PCR擴增反應液A，每管24 μ L的組成為:23.75μL IXPCR Master Mix和1.25μLSYBR Green熒光染料； (二)陽性對照DNA。
3.根據(jù)權利要求2所述的鑒定牛羊肉及其制品的性別來源的試劑盒，其特征在于，dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1。
4.一種利用權利要求2所述的試劑盒鑒定牛羊肉及其制品的性別來源的方法，其特征在于，包括下列步驟: (1)待檢樣品DNA的提取 DNA提取使用CTAB法； (2)在PCR反應管中加入24PLPCR擴增反應液A和WL樣品DNA，混勻； (3)將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增: 950C 15min, I個循環(huán)預變性； 950C 15sec,60°C lmin，40 個循環(huán)； (4)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，測定熔點曲線； 公牛性別特異性擴增產(chǎn)物熔解曲線峰值在84.5±0.5 °C，母牛的該基因沒有擴增；公羊性別特異性擴增產(chǎn)物熔解曲線峰值在83.5±0.5 V,母羊的該基因沒有擴增。
【文檔編號】C12Q1/68GK103966354SQ201410241711
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年6月4日 優(yōu)先權日:2014年6月4日
【發(fā)明者】高宏偉, 孫敏, 陳盛盛, 肖西志, 劉彩霞 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心