一株高效底改芽孢桿菌及其制成的復(fù)合底改菌劑和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本 申請人:提供了一株特基拉芽孢桿菌（Bacillustequilensis）ZSGD5，保藏編號為CCTCC?NO：M?2014004，保藏日期為2014年1月6日，保藏地點為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國，武漢，武漢大學(xué)；本 申請人:還提供了一種復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑，由以下菌種組成復(fù)合菌劑：特基拉芽孢桿菌、第一類枯草芽孢桿菌、第二類枯草芽孢桿菌、第一類地衣芽孢桿菌、第二類地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌。本發(fā)明所提供的特基拉芽孢桿菌具有高效水體底部凈化能力，能快速分解和降低池底污泥，有效改善環(huán)境水體的黑水、渾水現(xiàn)象，可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的水體環(huán)境處理和城市廢水治理中。
【專利說明】一株高效底改芽孢桿菌及其制成的復(fù)合底改菌劑和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及工業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種特基拉芽孢桿菌以及由其制備而成的復(fù)合菌劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖及廢水治理中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]利用微生態(tài)制劑進(jìn)行水質(zhì)處理或改良，維護良好生態(tài)環(huán)境，是現(xiàn)代生物工程技術(shù)與實際應(yīng)用有效結(jié)合的一個典型。但由于各種微生物的效用差別較大，如何用最有效和最少量的微生物來達(dá)到優(yōu)異的處理效果，是各科研機構(gòu)、學(xué)校和企業(yè)進(jìn)行不斷研究和開發(fā)的方向。
[0003]現(xiàn)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的殘余餌料以及養(yǎng)殖對象的排泄物對養(yǎng)殖環(huán)境造成嚴(yán)重影響，許多城市的河道，也因為人類的生活垃圾污水排放，導(dǎo)致河道有機質(zhì)富集，最終造成河水發(fā)黑等現(xiàn)象。利用各種不同功效微生物的自身特性，開發(fā)有效的微生物種群組合來對養(yǎng)殖水體以及城市河道中的多余有機質(zhì)進(jìn)行處理，對于未來的水質(zhì)改良和處理，具有十分積極的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本 申請人:提供了一株高效底改芽孢桿菌及其制成的復(fù)合底改菌劑和應(yīng)用。本發(fā)明所提供的特基拉芽孢桿菌具有高效水體底部凈化能力，能快速分解和降低池底污泥，有效改善環(huán)境水體的黑水、渾水現(xiàn)象，可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的水體環(huán)境處理和城市廢水治理中。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本 申請人:提供了一株特基拉芽孢桿菌iBaciIlus tequilensis ) ZS⑶5，保藏編號為CCTCC NO:M 2014004，保藏日期為2014年I月6日，保藏地點為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國，武漢，武漢大學(xué)。
[0006]本 申請人:提供了一種復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑，由以下菌種組成復(fù)合菌劑:
特基拉芽孢桿菌、第一類枯草芽孢桿菌、第二類枯草芽孢桿菌、第一類地衣芽孢桿菌、第二類地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌；
所述特基拉芽孢桿菌的保藏編號為CCTCC NO:M 2014004、第一類枯草芽孢桿菌的保藏編號為CCCTC NO:M 2011443、第一類地衣芽孢桿菌的保藏編號為CCTCC NO:M 2012458，保藏地點均為中國典型培養(yǎng)物保藏中心；其余菌種為市售產(chǎn)品。
[0007]所述復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑的有效活菌數(shù)為5.0X IO8~2.0X 101° cfu/g，使用量為每畝使用20-100 g，各菌種的組成如下:
菌種每克產(chǎn)品對應(yīng)菌種活菌數(shù)，單位為cfu/g 特基拉芽孢桿菌 1.0 X IO8~5.0 X IO9 第一類枯草芽孢桿菌 1.0XlO8~5.0XlO9 第二類枯草芽孢桿菌 1.0XlO8~5.0XlO9第一類地衣芽孢桿菌 5.0X IO7~LOXlO9 第二類地衣芽孢桿菌 0.8 X IO7~5.0XlO8 短小芽孢桿菌0.2 X IO7~1.0 X IO8
巨大芽孢桿菌5.0X IO7~LOXlO9
總活菌數(shù)5.0XlO8~2X1010。
[0008]本 申請人:提供了一種復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑的應(yīng)用，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖對象的池底水質(zhì)底改中，可以有效控制養(yǎng)殖水體中餌料殘渣以及養(yǎng)殖對象排泄物造成的污染，保持溶氧的增長、抑制池底青苔，降低氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫的量。
[0009]本 申請人:提供了一種復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑的應(yīng)用，用于城市河道黑水、渾水的治理中，可以改善河道死黑水的狀態(tài)，降低河道的河水COD為40%。
[0010]特基拉芽孢桿菌的主要生物學(xué)特征為:革蘭氏陽性細(xì)菌，桿狀，大小0.7-0.8um X 2-3 um,無莢膜,有鞭毛,能運動。
[0011]特基拉芽孢桿菌菌株的來源為水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘的底泥，篩選方法為:將從水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中取得的底泥加入無菌生理鹽水，在37°C搖床上120 rpm條件下振蕩20 min,吸取上清液，加入其他污染河流底泥為基質(zhì)的液體中，振蕩6 hr，將富集液稀釋10000倍后，用涂布棒涂布到該污染河流底泥為唯一基質(zhì)的固體平板中，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4(T48 hr，得到在平板上生長的菌株，擴培后進(jìn)行篩選。
[0012]特基拉芽孢桿菌 菌株的培養(yǎng)方法為:
(I)種子培養(yǎng)基配方:蛋白胨10 g/Ι,氯化鈉10 g/Ι,酵母粉5 g/Ι,用蒸懼水配制,全部溶解后調(diào)節(jié)PH 7.5^7.6，固體培養(yǎng)基在調(diào)節(jié)pH后在往培養(yǎng)基中添加15 g/Ι瓊脂粉，上述配制好的溶液在121°C下滅菌20min。
[0013](2)從平板上挑取I環(huán)芽孢桿菌移入滅菌的試管固體斜面培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18~24hr。
[0014](3)將上述長好的菌株斜面在95~100°C水浴中熱處理5~10min，取出迅速冷卻至室溫，挑取I環(huán)接種于裝有50ml液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在37 °C下?lián)u床150 rpm培養(yǎng)18~24 hr，得到的菌液中活菌數(shù)為I X IO7~3X IOltl個/ml。
[0015](4)該菌株能在以硝酸鹽或亞硝酸鹽為單一氮源的培養(yǎng)基中良好生長，單一硝化培養(yǎng)基為:葡萄糖20 g/Ι，硝酸鈉2 g/Ι (或者亞硝酸鈉2 g/Ι)，磷酸二氫鉀2 g/Ι，硫酸鎂
0.5 g/1, pH 6.0~6.2。
[0016]特基拉芽孢桿菌菌株的擴大培養(yǎng)方法為:
擴大培養(yǎng)基配方:葡萄糖20 g/Ι，酵母粉10 g/Ι，蛋白胨15 g/Ι，磷酸二氫鉀5 g/Ι，硫酸鎂I g/1，pH 7.0。擴大培養(yǎng)方法:在液體發(fā)酵罐中進(jìn)行液體發(fā)酵，過程維持通氣量1:2 vvm，攪拌200 rpm，壓力I kg/m2，用NaOH或者HCl溶液控制過程pH 6.0。
[0017]在上述條件下培養(yǎng)24~48小時后，可以得到菌種的芽孢體，芽孢占活菌總數(shù)的95%以上，發(fā)酵液中的總芽孢數(shù)可以達(dá)到IXio9~SXKTcfu/ml。發(fā)酵液經(jīng)過離心、板框過濾等手段收集菌體，再將菌體經(jīng)過噴霧干燥即可獲得所需的芽孢。將獲得的芽孢體菌種，用作配制本發(fā)明中復(fù)合底改菌劑的菌種原料。
[0018]本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于:
本發(fā)明所制備的微生態(tài)復(fù)合菌劑，經(jīng)過高溫造粒，仍然能保持內(nèi)部添加菌種的高效性，在不同的養(yǎng)殖水體和城市河道來源水體的試驗中，該復(fù)合微生態(tài)菌劑菌表現(xiàn)出了良好的功效性，以及內(nèi)部添加微生物菌劑的高存活性。
[0019]本發(fā)明所制備的微生態(tài)制劑菌種，能迅速分解處理對象水體底部的有機質(zhì)(養(yǎng)殖水體的餌料、糞便等)使其徹底轉(zhuǎn)化，去除底部臭味；防止池底發(fā)黑、發(fā)臭；控制池中的硫化氧、氨氮等有毒有害物質(zhì)；預(yù)防黃泥水、醬油水的發(fā)生、紅水、濃水、濁水，對青苔、藍(lán)藻等有害藻類的生長有明顯的抑制作用，使對象水體維持良好的生態(tài)環(huán)境。
【具體實施方式】
[0020]1、高效底改菌種的篩選
從水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘的底泥及水體中分離得到適合水質(zhì)改良的微生物菌株，通過對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗、16S rDNA分析等手段有效而準(zhǔn)確的確定菌種的屬種。
[0021]將從江蘇泰州姜堰某螃蟹養(yǎng)殖池塘中取得的底泥樣品稱取2 g，加入98 ml無菌生理鹽水，在37°C搖床上120 rpm條件下振蕩20 min，吸取上清液I ml加入取自無錫市某污染河底泥為基質(zhì)的液體中，振蕩6 hr，將富集液稀釋10000倍后，用涂布棒涂布到該河流底泥為唯一基質(zhì)的固體平板中，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4(T48 hr，得到三株在平板上生長的菌株，編號為ZSGD-1，ZSGD-5，ZSGD-9，并挑取單菌落進(jìn)行擴陪，后利用擴陪得到的菌體進(jìn)行污染河水的處理測試試驗，挑選出效果較好的其中一株菌種ZS⑶-5，經(jīng)過16S rDNA及生理生化性能的鑒定和測試，該菌種屬于特基拉芽孢桿菌，該芽孢桿菌能在低氧濃度下快速生長消耗污染水體的營養(yǎng)物質(zhì)。
[0022]η-1的分類命名為特基拉芽孢桿菌(ifeci77i/5.tequilensis')，子2014年I月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2014004。
[0023]2、菌株擴大培養(yǎng)及產(chǎn)品收集
按照前面所述菌株的培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)方法，將斜面的特基拉芽孢桿菌CCTCC M 2014004進(jìn)行擴培，得到一定濃度的枯草芽孢桿菌的孢子液，再將其經(jīng)過離心和噴霧干燥等手段，得到芽孢粉劑產(chǎn)品。
[0024]3、復(fù)合底改菌劑(即復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑)制作方法
將篩選到的特基拉芽孢桿菌以及其它有效菌株按照各自固體菌粉的活菌數(shù)配比比例混合，其中各個有效菌株固體菌粉的活菌添加比例(按照占產(chǎn)品的總活菌數(shù)計算)如下:菌種每克產(chǎn)品對應(yīng)菌種活菌數(shù)(cfu/g)
特基拉芽孢桿菌(CCCTC M 2014004) 1.0XlO9 第一類枯草芽孢桿菌(CCCTC M 2011443) 1.0XlO9 第二類枯草芽孢桿菌1.0X109
第一類地衣芽孢桿菌(CCTCC M 2012458) 1.0XlO8 第二類地衣芽孢桿菌0.8 X IO8
短小芽孢桿菌0.2 X IO8
巨大芽孢桿菌1.0X108
總活菌數(shù)5.0XlO9
上述保藏編號均為中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，而第二類枯草芽孢桿菌、第二類地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌均是由泰州綠圣元生物科技有限公司提供。[0025]上述各菌粉按照既定比例混合均勻后，添加載體(麩皮粉、葡萄糖、玉米粉、米糠粉，沸石粉、硅藻土，活性炭、絹云母粉)中的一種或者幾種補充到總重量的100% (以芽孢桿菌作為有效成分，加入載體使產(chǎn)品總重量滿足最終的活菌數(shù)達(dá)到5.0XlO9 cfu/g)，并進(jìn)行造粒，得到菌劑顆粒，然后投入使用。
[0026]各個有效單菌粉按照上述方法嚴(yán)格配制，即可得到本發(fā)明所述的復(fù)合微生物底改菌劑，又稱為復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑。該產(chǎn)品用于對各種有機質(zhì)污染水體進(jìn)行有效底改，使底泥從黑變黃，可以降低養(yǎng)殖水體池底殘餌、糞便，有效去除池底的氨氮、亞硝酸鹽、硫化
氫等物質(zhì)。
[0027]上述整個加工過程應(yīng)保證操作環(huán)境的清潔，避免污染?？刂骗h(huán)境濕度在70%以下，各原料水分含量低于15%，該產(chǎn)品制成后常溫下保存18個月，-18°C下保存期限可以達(dá)到36個月，保質(zhì)期內(nèi)活菌數(shù)穩(wěn)定。
[0028]4、檢測例1:復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑用于鯽魚養(yǎng)殖水體的改性。
[0029]水樣取樣:蘇州太倉某養(yǎng)殖池塘，離岸1.5m,水面下30cm水樣，按照《海洋監(jiān)測規(guī)范》進(jìn)行處理。測試時養(yǎng)殖水溫為22-27°C，對照池為不添加本復(fù)合底改菌劑的結(jié)果。每畝.米池塘中撒入500g菌劑顆粒,處理結(jié)果如表1所示。
[0030]表1
【權(quán)利要求】
1.一株特基拉芽孢桿菌{Bacillus tequilensis) ZS⑶5，保藏編號為CCTCC NO:M2014004，保藏日期為2014年I月6日，保藏地點為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國，武漢，武漢大學(xué)。
2.一種復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑，其特征在于由以下菌種組成復(fù)合菌劑: 特基拉芽孢桿菌、第一類枯草芽孢桿菌、第二類枯草芽孢桿菌、第一類地衣芽孢桿菌、第二類地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌； 所述特基拉芽孢桿菌的保藏編號為CCTCC NO:M 2014004、第一類枯草芽孢桿菌的保藏編號為CCCTC NO:M 2011443、第一類地衣芽孢桿菌的保藏編號為CCTCC NO:M 2012458，保藏地點均為中國典型培養(yǎng)物保藏中心；其余菌種為市售產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑，其特征在于所述復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑的有效活菌數(shù)為5.0X IO8~2.0XlOltl cfu/g，使用量為每畝使用20-100 g，各菌種的組成如下: 菌種每克產(chǎn)品對應(yīng)菌種活菌數(shù)，單位為cfu/g 特基拉芽孢桿菌 1.0 X IO8~5.0 X IO9 第一類枯草芽孢桿菌 1.0XlO8~5.0XlO9 第二類枯草芽孢桿菌1.0XlO8~5.0XlO9 第一類地衣芽孢桿菌5.0X IO7~LOXlO9 第二類地衣芽孢桿菌0.8 X IO7~5.0 X IO8 短小芽孢桿菌 0.2 X IO7~1.0 X IO8 巨大芽孢桿菌 5.0XlO7~1.0XlO9 總活菌數(shù)5.0XlO8~2X1010。
4.一種權(quán)利要求書2所述的復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑的應(yīng)用，其特征在于用于水產(chǎn)養(yǎng)殖對象的池底水質(zhì)底改中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑可以有效控制養(yǎng)殖水體中餌料殘渣以及養(yǎng)殖對象排泄物造成的污染，保持溶氧的增長、抑制池底青苔，降低氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫的量。
6.一種權(quán)利要求書2所述的復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑的應(yīng)用，其特征在于在用于城市河道黑水、渾水的治理中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的復(fù)合微生態(tài)芽孢桿菌制劑可以改善河道死黑水的狀態(tài)，降低河道的河水COD為40%。
【文檔編號】C12R1/11GK104017757SQ201410241782
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月3日
【發(fā)明者】張梁, 石孔泉, 唐旭彪 申請人:江南大學(xué), 泰州綠圣元生物科技有限公司, 江蘇大有生物科技發(fā)展有限公司