改造的人Insulin蛋白表達(dá)基因及表達(dá)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種改造的人Insulin蛋白表達(dá)基因及表達(dá)方法。在花生油體蛋白系統(tǒng)中易于表達(dá)的人Insulin蛋白表達(dá)基因片段，將表達(dá)人Insulin蛋白的表達(dá)基因按照花生偏好的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行如下改造：將表達(dá)A鏈的基因片段中表達(dá)Asn21的核苷酸變?yōu)楸磉_(dá)Gly21的核苷酸，同時(shí)表達(dá)B鏈基因片段的末端添加表達(dá)Arg31、Arg32兩個(gè)氨基酸殘基的核苷酸。本發(fā)明采用油體蛋白系統(tǒng)在花生種子中表達(dá)人Insulin蛋白，利用花生種子含油量豐富的特點(diǎn)，使油體蛋白占種子總蛋白的10％以上，人Insulin蛋白表達(dá)基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化與花生油體蛋白融合表達(dá)實(shí)現(xiàn)了Insulin蛋白的高水平積累。
【專利說明】改造的人Insul in蛋白表達(dá)基因及表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種改造的人Insulin蛋白表達(dá)基因及表達(dá)方法,尤其涉及Insulin序列的改造、密碼子優(yōu)化和利用油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)在花生種子中表達(dá)人Insulin的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]“糖尿病”是一種血液中的葡萄糖容易堆積過多的疾病，四十歲以上的中年人染患率特別高。據(jù)統(tǒng)計(jì)2010年我國(guó)的糖尿病患者人數(shù)居全球之冠，達(dá)到了 9240萬。Insulin是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，在糖尿病治療中具有無可替代的作用和地位。我國(guó)有近億人的糖尿病患者，所以對(duì)Insulin的需求量巨大。
[0003]臨床用Insulin最早主要從動(dòng)物胰臟中提取，存在人畜共患病原菌和朊病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。隨著DNA重組技術(shù)研究深入，已成功在大腸桿菌和酵母如畢赤酵母中表達(dá)了重組Insulin，不過，原核大腸桿菌和低等真核生物酵母表達(dá)重組Insulin存在內(nèi)毒素污染和無法完成蛋白修飾等系統(tǒng)固有缺陷，而用植物系統(tǒng)表達(dá)Insulin具有易于規(guī)模化安全和低成本優(yōu)勢(shì)，可以彌補(bǔ)原核和酵母系統(tǒng)的不足。
[0004]植物生物反應(yīng)器成本低，不存在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞或微生物發(fā)酵中存在的細(xì)胞培養(yǎng)困難、培養(yǎng)基昂貴、在規(guī)?；a(chǎn)時(shí)需要嚴(yán)格的培養(yǎng)條件避免污染、成本加大等問題(Liuand Jia, 2003 ；Gomord et al, 2004);安全性高，不存在病原菌的污染的風(fēng)險(xiǎn)(Commandeuret al, 2003 ；Cai et al, 2004);生產(chǎn)的產(chǎn)品一般含有較高的生物活性及免疫活性(Daniellet al, 2001);遺傳穩(wěn)定性高，通過自交和分離能很快獲得轉(zhuǎn)基因純合體(Verwoerd etal, 1995 ；Liu et al, 2000);并且植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟。利用植物反應(yīng)器生產(chǎn)有用蛋白，即為“分子農(nóng)業(yè)(molecular farming) ” (Commandeur et al, 2003),是一種非常安全的生產(chǎn)方式。目前已有多種植物用作生物反應(yīng)器，如煙草(McCormick et al, 1999 ；Ma et all995)、大豆(Giddings et al, 2000)、擬南芥(Potera, 1999)、玉米、油菜(Arakawa et al, 1998 ；Witcher et al, 1998).、馬鈴薯(Richter et al, 2000 ；Artsaenko et al, 1998)、番爺(Chenet al, 2009)等，其表達(dá)產(chǎn)物也是多種多樣的，如具有重要價(jià)值的藥物蛋白、疫苗、抗體等(Yang et al,2009)。
[0005]國(guó)際上在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中表達(dá)人Insulin的融合蛋白，Insulin只占馬鈴薯塊莖中可溶性蛋白的0.022%。SemBioSys生物工程公司利用油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)在紅花中表達(dá)人Insulin,每畝紅花所產(chǎn)的紅花籽中能提取到165克Insulin,
[0006]油體蛋白系統(tǒng)比其他表達(dá)系統(tǒng)Insulin的含量高，可能由于油體蛋白在種子中高水平表達(dá)并大量積累(Y1-hui and Sh1-rong，2003)，并且利用油體蛋白脂溶性的特點(diǎn)很容易將融合蛋白分離純化，長(zhǎng)時(shí)間的忙存仍能保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(Frandsen et al, 2001),其應(yīng)用前景非常廣泛。目前利用油體蛋白系統(tǒng)已經(jīng)成功獲得了有生物活性的水蛭素、納豆激酶、β -葡聚糖醛酸酶、木聚糖酶、表皮生長(zhǎng)因子等多種蛋白(Zhao et al, 2009)。
[0007]花生(Arachis hypogaea)作為我國(guó)最重要的油料作物之一，既可以榨油和深加工，又可以生食，而且花生產(chǎn)量高，如果在花生中生產(chǎn)Insulin，按照每畝600斤花生，如果Insulin占種子總蛋白的1%算，每畝花生生產(chǎn)的Insulin約900克,為紅花的5倍多。人Insulin蛋白具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，經(jīng)檢索，目前還沒有關(guān)于在花生種子中利用油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人Insulin蛋白的方法的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改造的人Insulin蛋白表達(dá)基因及表達(dá)方法，實(shí)現(xiàn)Insulin在花生種子中高水平的表達(dá)積累。
[0009]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
[0010]—種在花生油體蛋白系統(tǒng)中易于表達(dá)的人Insulin蛋白表達(dá)基因片段，將表達(dá)人Insulin蛋白的表達(dá)基因按照花生偏好的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行如下改造:將表達(dá)A鏈的基因片段中表達(dá)Asn21的核苷酸變?yōu)楸磉_(dá)Gly21的核苷酸，同時(shí)表達(dá)B鏈基因片段的末端添加表達(dá)Arg31、Arg32兩個(gè)氨基酸殘基的核苷酸。
[0011]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述人Insulin蛋白表達(dá)基因片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0012]胰島素原(Insulin蛋白)是一個(gè)含21個(gè)氨基酸的A鏈和30個(gè)氨基酸B鏈以及C連接肽，共86個(gè)氨基酸，由N端至C端的連接順序?yàn)锽-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A ;將人Insulin的序列將編碼區(qū)改造成花生偏好的密碼子，并將A鏈的Asn21變?yōu)镚ly21，同時(shí)B鏈末端添加Arg31、Arg32兩 個(gè)氨基酸殘基,使Insulin的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,作用效果更持久。改造以后可以交給生物公司合成Insulin的編碼序列。
[0013]一種利用油體蛋白系統(tǒng)在花生種子中表達(dá)人Insulin蛋白的方法，步驟如下:
[0014](I)將上述在花生種子中易于表達(dá)的人Insulin蛋白表達(dá)基因片段進(jìn)行人工合成，制得改造后表達(dá)基因片段；
[0015](2)以步驟(1)制得的改造后表達(dá)基因片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物如下:
[0016]正向引物:GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA；
[0017]反向引物:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA；
[0018]將經(jīng)測(cè)序正確的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和限制性內(nèi)切酶Xba I雙酶切后，與同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和限制性內(nèi)切酶Xba I雙酶切的載體連接，制得植物表達(dá)載體；
[0019](3)步驟(2)制得的植物表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化花生，獲得轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)育繁后，收獲第二代轉(zhuǎn)基因花生純合體的花生種子，經(jīng)純化，制得人Insulin蛋白。
[0020]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，PCR反應(yīng)體系如下:
[0021]模板1μ 1，2XLA Taq π?χ?ομ 1，正向引物(10μΜ)0.5μ1，反向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1，ddH208.0 μ I。
[0022]PCR反應(yīng)程序如下:
[0023]94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C再延伸IOrnin0
[0024]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的測(cè)序?yàn)閷CR產(chǎn)物連接到T載體，經(jīng)人工測(cè)序正確，即得。[0025]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟⑵的載體為pCAMBIA2301-Ah01eosin載體，通過在載體PCAMBIA2301上插入序列如SEQ ID N0.2所示的花生油體蛋白啟動(dòng)子及花生油體蛋白基因和序列如SEQ ID N0.3所示的終止子獲得。
[0026]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中純化的步驟如下:
[0027]將花生種子勻漿、壓榨；離心后去掉沉淀，回收上層的油相，清洗后、離心，再取上層的油相，加入腸肽酶進(jìn)行酶消化反應(yīng)，然后離心去掉上層的油相，回收水相，提取得到人Insulin 蛋白。
[0028]有益效果
[0029]1、本發(fā)明采用油體蛋白系統(tǒng)在花生種子中表達(dá)人Insulin蛋白，利用花生種子含油量豐富的特點(diǎn)，使油體蛋白占種子總蛋白的10%以上，人Insulin蛋白表達(dá)基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化與花生油體蛋白融合表達(dá)實(shí)現(xiàn)了 Insulin蛋白的高水平積累；
[0030]2、由于花生種子便于貯藏，運(yùn)輸方便，而且重組蛋白在種子中的穩(wěn)定性高，能在種子中長(zhǎng)期保持活性，從而解決了人Insulin蛋白儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)膯栴}；
[0031]3、花生適應(yīng)性強(qiáng)，種植面積廣，融合表達(dá)的Insulin分離純化簡(jiǎn)單易操作，成本低，增加了農(nóng)產(chǎn)品的附加 值，為分子農(nóng)業(yè)和生物制藥的發(fā)展提供了技術(shù)支持；與微生物和動(dòng)物反應(yīng)器相比，植物表達(dá)系統(tǒng)在免疫原性、安全性、來源和成本等方面都更具有潛在的優(yōu)勢(shì)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1、本發(fā)明構(gòu)建的載體pCAMBIA2301-Aholeosin_Insulin的構(gòu)建示意圖；
[0033]圖2、Western檢測(cè)轉(zhuǎn)基因花生種子中Insulin蛋白的表達(dá)結(jié)果照片；
[0034]其中:1，2:轉(zhuǎn)經(jīng)優(yōu)化改造的Insulin蛋白表達(dá)基因的花生，WT:野生型，3，4:轉(zhuǎn)未經(jīng)優(yōu)化改造的Insulin蛋白表達(dá)基因的花生；
[0035]圖3、轉(zhuǎn)基因花生Western檢測(cè)Insulin蛋白的柱狀分析圖；
[0036]其中:1，2:轉(zhuǎn)經(jīng)優(yōu)化改造的Insulin蛋白表達(dá)基因的花生，WT:野生型，3，4:轉(zhuǎn)未經(jīng)優(yōu)化改造的Insulin蛋白表達(dá)基因的花生。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
[0038]實(shí)施例1、人Insulin序列進(jìn)行改造和合成
[0039]根據(jù)NCBI中人Insulin的編碼序列(基因登錄號(hào):ΒΤ006808.I)，將編碼序列改造成花生偏好密碼子，同時(shí)將Insulin A鏈的Asn21變?yōu)镚ly21，同時(shí)B鏈末端添加Arg31，Arg32兩個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)化改造后的人Insulin蛋白表達(dá)基因片段核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示，將人Insulin蛋白表達(dá)基因片段由生物公司合成。
[0040]實(shí)施例2、構(gòu)建 pCAMBIA2301-Aholeosin-1nsulin 植物表達(dá)載體
[0041]構(gòu)建過程如圖1所示，其中Insulin序列的擴(kuò)增和獲得如下:
[0042]以正向引物 primer I: GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA,和反向引物 primer2:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA，用合成的序列如SEQ ID N0.1所示的人Insulin蛋白表達(dá)基因片段為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為:模板I μ 1，2XLA Taq π?χΙΟμ 1，正向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1，反向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1，ddH208.0 μ I。
[0043]PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72°C再延伸IOmin。
[0044]PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5wt%的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收300bp左右條帶，連接到T載體上(pEASY T3,購(gòu)自Transgen Biotech公司)，連接體系為:
[0045]回收產(chǎn)物4μ 1，T載體1μ 1，25°C連接15min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
[0046]大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備:
[0047](I)取-70°C冰凍E.coli DH5 a菌種，用劃線法接種細(xì)菌于LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜。
[0048](2)取一環(huán)新鮮的菌落于裝有3ml LB試管中，在37°C振蕩培養(yǎng)約16h。
[0049](3)取Iml上述菌液轉(zhuǎn)接到裝有30ml LB三角燒瓶中(接種量按菌液濃度而定，一般在I %左右)，劇烈振蕩培養(yǎng)至OD6tltl值0.2-0.4。
[0050](4)將菌液冰浴IOmin,倒入冰上遇冷50ml的離心管中。4°C, 4000rpm離心5min,
棄上清，收集菌體。
[0051 ] (5)用50mmol/L預(yù)冷的CaCl2中約IOml,輕輕的懸浮細(xì)胞，冰浴IOmin, 4 V,4000rpm,離心5min,棄上清收集菌體。
[0052](6)將菌體懸浮在l_2ml的50mmol/L冷CaCl2中。置冰上作為轉(zhuǎn)化用的感受態(tài)細(xì)胞。
[0053](7)用預(yù)冷的槍頭，取100 μ I分裝到預(yù)冷的EP管中，加入等體積的30% (體積百分比)的甘油，放入液氮速凍，_70°C保存。
[0054]大腸桿菌的轉(zhuǎn)化:將上述5 μ I的連接產(chǎn)物加入100 μ I DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中混勻。冰上放置30min，42°C熱激90s，冰浴5min，加入800 μ I液體LB (NaC110g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)，37°C IOOrpm振蕩培養(yǎng)lh，將菌液均勻涂抹布在含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，瓊脂粉15g/L)，37°C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落到ImL液體LB中，37°C搖菌4-6h，用primerl和primer2進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性克隆用通用引物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證(見序列表SEQ ID N0.1)，得到克隆載體T-1nsulin質(zhì)粒。
[0055]將人Insulin蛋白基因連接到pCAMBIA2301_Ah01eosin表達(dá)載體:
[0056]將花生油體蛋白啟動(dòng)子及花生油體蛋白基因(序列如SEQ ID N0.2所示)以及tRUBP終止子(序列如SEQ ID N0.3所示)連接至Ij pCAMBIA2301 (Cambia公司有售)的植物表達(dá)載體，構(gòu)建成 pCAMBIA2301-Ah01eosin。將 pCAMBIA2301_Ah01eosin 和 T-1nsulin質(zhì)粒同時(shí)用Xba I和BamH I雙酶切，回收載體和Insulin蛋白表達(dá)基因片段，T4連接酶將兩個(gè)片段連接:10XT4DNA ligase buffer2y I, Insulin蛋白表達(dá)基因片段6 μ 1，pCAMBIA2301-Ah01eosin2 μ 1，T4DNA Iigasel μ 1，H209 μ 1，16°C連接過夜。
[0057]連接產(chǎn)物按實(shí)施例1中的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，同樣挑取單菌落PCR驗(yàn)證，測(cè)序驗(yàn)證表達(dá)載體構(gòu)建成功。
[0058]表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化:
[0059]制備農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞:[0060](I)將_80°C保存的根癌農(nóng)桿菌LBA4404劃板，28°C培養(yǎng)兩天；
[0061](2)挑取單克隆，接種于5ml YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜；
[0062](3)取 Iml 稀釋 50ml YEP (NaC15g/L,蛋白胨 10g/L,酵母粉 10g/L)培養(yǎng)基中，28 0C 250rpm 震蕩培養(yǎng)至 0D600 值 0.6 ;
[0063](4)將培養(yǎng)物置于冰上20min，并不時(shí)的輕搖，保證內(nèi)容物充分的冷卻；
[0064](5)將菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的50ml離心管中，4°C，5000rpm離心10min，棄上清液；
[0065](6)菌體用 IOml 預(yù)冷的 0.15M 的 NaCl 重懸；4°C, 5000rpm 離心 IOmin ；
[0066](7)棄上清，用Iml預(yù)冷的20mM CaCl2 (含15 %的甘油)(250 μ 160 %的甘油加750 μ ICaCl2)重懸；分裝到預(yù)冷的eppendorf管中(200 μ I/管)；
[0067]重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌:200 μ I感受態(tài)細(xì)胞中加入I μ I重組質(zhì)粒，冰浴30min ;液氮冷凍Imin ;37°C水浴融化細(xì)胞2-3min ;加入1ml YEP，28°C輕輕震蕩2_4h，低速離心lmin，用0.1ml YEP懸浮沉淀，將細(xì)胞懸浮液涂布于含50 μ g/ml卡那霉素，50 μ g/ml利福平的YEP (NaC15g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，瓊脂粉15g/L)平板上28°C培養(yǎng)2_3天，挑取單菌落，ImlYEP搖菌，菌液用primerl和primer2PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性菌株_80°C保存。
[0068]實(shí)施例3、花生的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因花生種子的獲得:
[0069](I)花生胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化
[0070]外植體的制備:將成熟莢果去果皮，先后浸于濃度為75%的酒精中l(wèi)min，在質(zhì)量濃度為0.1% HgCl2溶液中浸泡15min，進(jìn)行表面消毒，再用無菌水漂洗3次。將種皮剝離，放入MS0培養(yǎng)基，于光下培養(yǎng)。培養(yǎng)4天左右取胚軸作為外植體。
[0071 ] MS0培養(yǎng)基按如下步驟配制:
[0072]取母液I 50mL,母液 I1、II1、IV 各 5mL ；再取 2,4-D (2，4- 二氯苯氧乙酸)5mL、NAA(萘乙酸)ImL —起放入燒杯中，無菌水定容到1L。固體培養(yǎng)基再加入9g瓊脂。
[0073]母液I組分如表1所示:
[0074]表1
【權(quán)利要求】
1.一種在花生油體蛋白系統(tǒng)中易于表達(dá)的人Insulin蛋白表達(dá)基因片段，將表達(dá)人Insulin蛋白的表達(dá)基因按照花生偏好的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行如下改造:將表達(dá)A鏈的基因片段中表達(dá)Asn21的核苷酸變?yōu)楸磉_(dá)Gly21的核苷酸，同時(shí)表達(dá)B鏈基因片段的末端添加表達(dá)Arg31、Arg32兩個(gè)氨基酸殘基的核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的人Insulin蛋白表達(dá)基因片段,其特征在于,上述人Insulin蛋白表達(dá)基因片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.一種利用油體蛋白系統(tǒng)在花生種子中表達(dá)人Insulin蛋白的方法，其特征在于，步驟如下: (1)將上述在花生種子中易于表達(dá)的人Insulin蛋白表達(dá)基因片段進(jìn)行人工合成，制得改造后表達(dá)基因片段； (2)以步驟(1)制得的改造后表達(dá)基因片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物如下: 正向引物:GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA ； 反向引物:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA ； 將經(jīng)測(cè)序正確的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和限制性內(nèi)切酶Xba I雙酶切后，與同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和限制性內(nèi)切酶Xba I雙酶切的載體連接，制得植物表達(dá)載體； (3)步驟(2)制得的植物表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化花生，獲得轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)育繁后，收獲第二代轉(zhuǎn)基因花生純合體的花生種子，經(jīng)純化，制得人Insulin蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，PCR反應(yīng)體系如下: 模板 1μ 1，2XLA Taq mixlO μ 1，10 μ M 正向引物 0.5 μ 1，10 μ M 反向引物 0.5 μ 1，ddH208.0 μ I ο PCR反應(yīng)程序如下: 94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s，30個(gè)循環(huán);72°C再延伸IOmin0
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的測(cè)序?yàn)閷CR產(chǎn)物連接到T載體，經(jīng)人工測(cè)序正確，即得。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟⑵的載體為pCAMBIA2301-Ah01eosin載體，通過在載體pCAMBIA2301上插入序列如SEQ ID N0.2所示的花生油體蛋白啟動(dòng)子及花生油體蛋白基因和序列如SEQ ID N0.3所示的終止子獲得。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中農(nóng)桿菌為L(zhǎng)BA4404。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中純化的步驟如下:將花生種子勻漿、壓榨；離心后去掉沉淀，回收上層的油相，清洗后、離心，再取上層的油相，加入腸肽酶進(jìn)行酶消化反應(yīng)，然后離心去掉上層的油相，回收水相，提取得到人Insulin蛋白。
【文檔編號(hào)】C12N15/17GK104017809SQ201410247746
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】畢玉平, 鄭玲, 彭振英, 邊斐, 焦其慶, 陳高 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心