一種用于煙草黑脛病抗性基因Ph輔助選擇的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于煙草黑脛病抗性基因Ph輔助選擇的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的分子標(biāo)記為TM29和TM50，在第20號(hào)基因連鎖群上分別位于基因Ph兩側(cè)，與之緊密連鎖，分子標(biāo)記TM29與Ph基因的遺傳距離為0.091cM，分子標(biāo)記TM50與Ph基因的遺傳距離為0.148cM。本發(fā)明還提供了一種利用所述分子標(biāo)記檢測(cè)煙草黑脛病抗性基因Ph的分子標(biāo)記方法，以及所述分子標(biāo)記在煙草分子輔助育種和煙草黑脛病抗性基因Ph定位中的應(yīng)用。利用本發(fā)明的分子標(biāo)記輔助育種選擇目標(biāo)明確，節(jié)約成本，顯著提高了選擇效率，不僅為煙草黑脛病的育種提供了抗源篩選方法，而且可進(jìn)一步通過(guò)染色體步移法接近基因Ph，從而為基因Ph的克隆奠定基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】—種用于煙草黑脛病抗性基因Ph輔助選擇的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子遺傳學(xué)和煙草種質(zhì)創(chuàng)新【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于煙草黑脛病抗性基因/?輔助選擇的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草黑胚病是由煙草黑胚病菌{Phytophthora parasitica ν?τ.nicotianae)弓丨起的一種土傳真菌病害，是影響煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一，其發(fā)生蔓延很快，往往在f 2周之內(nèi)可以使整個(gè)煙田毀滅，破壞性極強(qiáng)，大田侵染后常造成煙株整株死亡，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(王萬(wàn)能，肖崇剛.煙草黑脛病的綜合防治及其研究進(jìn)展.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003(2):42-43.)。防治煙草黑脛病最安全、經(jīng)濟(jì)有效的措施之一是培育抗病品種。
[0003]煙草黑脛病的抗源主要有4個(gè)，即雪茄煙品種Florida301，晾曬煙品種Beinhart-1000、煙草野生種藍(lán)茉莉葉煙草iNicotiana Plumbaginifolia)和長(zhǎng)花煙草(Mcotiana 1ngiflora )0目前,煙草生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的抗源大都來(lái)自N.plumbaginifolia和 Florida30U 應(yīng)的抗性為顯性單基因/? 控制(Campbell KG, WernsmanE A.Selection among haploid saprophytes for resistance to black shank in tobacc0.Crop Scencei, 1994, 6 (34): 662-667.),高抗煙草黑胚病的 O 號(hào)小種(Nielsen M T.BlackShank Collaborative Study.C0RESTA Paris France: Crestar Information Bulletin,1995: 36-41.)。其余3個(gè)抗源的黑脛病抗性是由微效多基因控制的數(shù)量性狀，極易受環(huán)境影響且遺傳機(jī)制較為復(fù)雜，因此很難在煙草育種中應(yīng)用。
[0004]迄今，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)與煙草黑脛病抗性基因/?兩側(cè)緊密連鎖的分子標(biāo)記的報(bào)道。利用近幾年發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建重要抗源的遺傳圖譜和基因定位分析，可以找到與煙草黑脛病抗性基因/?兩側(cè)緊密連鎖(或共分離)的分子標(biāo)記。使用與某一特定抗源抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，不僅可對(duì)該特定抗源的后代及其衍生品種(系)在苗期進(jìn)行早世代篩選，淘汰感病植株，節(jié)約成本，提高育種和選擇效率，而且還可以為進(jìn)一步克隆相關(guān)的抗病基因并分析其功能奠定基礎(chǔ)。因此，開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記用于定位煙草黑脛病抗性基因Ph和輔助選擇抗煙草黑脛病材料對(duì)抗病育種具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明第一目的在于提供一種用于煙草黑脛病抗性基因/?輔助選擇的分子標(biāo)記；第二目的在于提供一種所述分子標(biāo)記在檢測(cè)煙草黑脛病抗性基因/?中的應(yīng)用；第三目的在于提供所述分子標(biāo)記在煙草分子輔助育種中的應(yīng)用；第四目的在于提供所述分子標(biāo)記在煙草黑脛病抗性基因/?定位中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明第一目的這樣實(shí)現(xiàn)的，用于煙草黑脛病抗性基因Ph輔助選擇的分子標(biāo)記為TM29或TM50，在第20號(hào)基因連鎖群上分別位于基因Ph兩側(cè)，與之緊密連鎖，分子標(biāo)記TM29與Ph基因的遺傳距離為0.091cM，分子標(biāo)記TM50與Ph基因的遺傳距離為0.148cM。[0007]本發(fā)明第二目的這樣實(shí)現(xiàn)的，所述分子標(biāo)記在檢測(cè)煙草黑脛病抗性基因/?中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明第三目的這樣實(shí)現(xiàn)的，所述分子標(biāo)記在煙草分子輔助育種中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明第四目的這樣實(shí)現(xiàn)的，所述分子標(biāo)記在煙草黑脛病抗性基因/?定位中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明具備的有益效果:
(1)本發(fā)明的分子標(biāo)記具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高，
(2)標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方法操作簡(jiǎn)便快捷，對(duì)檢測(cè)設(shè)備和引物模板質(zhì)量要求不高，實(shí)驗(yàn)試劑用量少，速度快，成本低，適合高通量、自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，非常適合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)分子育種的實(shí)踐；
(3)本發(fā)明為煙草黑脛病抗性基因/?的克隆提供了重要的分子遺傳學(xué)信息；
(4)如本發(fā)明的煙草黑脛病抗性基因/?分子標(biāo)記和引物對(duì)應(yīng)用于煙草育種工作中，將極大降低煙草黑脛病流行對(duì)煙草生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)顯著地減少農(nóng)藥使用量，有益于降低生產(chǎn)成本，具有很大的應(yīng)用潛力和極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；
(5)本發(fā)明篩選出與基因/?兩側(cè)緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以有效地用于基因/?的標(biāo)記輔助選擇，可進(jìn)一步通過(guò)染色體步移法接近基因Ph，從而為基因Ph的克隆奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為利用BC1F1單株作為定位群體構(gòu)建的黑脛病抗性基因/?連鎖圖(局部圖)； 圖中，左側(cè)的數(shù)字代表每個(gè)分子標(biāo)記的遺傳距離(單位:cM)，右側(cè)為各個(gè)分子標(biāo)記的名稱。
[0012]圖2為分子標(biāo)記TM29對(duì)BC1F1作圖群體材料進(jìn)行基因型分析(局部圖)；
圖中，1-36分別為BC1F1作圖群體中的前36個(gè)單株，即RH001，RH002,…，RH035,RH036, M-1OObp DNA Ladder。
[0013]圖3為分子標(biāo)記TM50對(duì)BC1F1作圖群體材料進(jìn)行基因型分析(局部圖)；
圖中，1-36分別為BC1F1作圖群體中的前36個(gè)單株，即RH001，RH002,…，RH035、RH036, M-1OObp DNA Ladder。
[0014]圖4為分子標(biāo)記TM29在含有/?基因的抗病材料和不含/?基因的感病材料中的分布譜帶圖；
圖中，l-Λ plumbaginifolia (野生煙，含/? 基因)，2-Coker371_Gold (烤煙，含/? 基因)，3-RBST (抗病親本，含/?基因XfF1 (RBSTX紅花大金元，含/?基因)，5_紅花大金元(感病親本，不含/?基因)，6_云煙85 (烤煙，不含/?基因)，7_云煙87 (烤煙，不含/?基因)，8-K326 (烤煙，不含/?基因)，9-Hicks (烤煙，不含/?基因)，10-單育二號(hào)(烤煙，不含/?基因)，11-中煙100 (烤煙，不含/?基因)，12-Florida301 (雪茄，不含/?基因)，13-Beinhart-1OOO (晾曬煙，不含/? 基因)，14-Samsun (香料煙，不含/? 基因)，M-1OObp DNALadder0
[0015]圖5為分子標(biāo)記TM50在含有基因Ph的材料和不含基因Ph的材料中的分布譜帶圖；
圖中，l-Λ plumbaginifolia (野生煙，含/? 基因)，2-Coker371_Gold (烤煙，含/? 基因)，3-RBST (抗病親本，含/?基因XfF1 (RBSTX紅花大金元，含/?基因)，5_紅花大金元(感病親本，不含/?基因)，6_云煙85 (烤煙，不含/?基因)，7_云煙87 (烤煙，不含/?基因)，8-K326 (烤煙，不含/?基因)，9-Hicks (烤煙，不含/?基因)，10-單育二號(hào)(烤煙，不含/?基因)，11-中煙100 (烤煙，不含/?基因)，12-Florida301 (雪茄，不含/?基因)，13-Beinhart-1OOO (晾曬煙，不含/? 基因)，14- Samsun (香料煙，不含/? 基因)，M-1OObp DNALadder。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換，均落入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0017]如圖1所示，本發(fā)明所述的煙草黑脛病抗性基因/?輔助選擇的分子標(biāo)記為TM29或TM50，在第20號(hào)連鎖群上分別位于基因Ph兩側(cè)，與之緊密連鎖，分子標(biāo)記TM29與Ph基因的遺傳距離為0.091cM,分子標(biāo)記TM50與Ph基因的遺傳距離為0.148cM。
[0018]本發(fā)明所述的煙草黑脛病抗性基因/?輔助選擇的分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方法，具體過(guò)程如下:
(I)SSR位點(diǎn)信息分析
利用 SSRIT 軟件(http://www.gramene.0rg/gramene/searches/ssrtool)在紅花大金元基因組數(shù)據(jù)(基因組數(shù)據(jù)以FASTA文件格式下載自中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(ChinaTobacco Genome Database, CT⑶B)內(nèi)進(jìn)行SSR位點(diǎn)信息的搜索,該軟件僅用于查找二、三、四、五、六堿基5種類型的SSR。對(duì)于單堿基類型的SSR信息則利用TRF軟件(Tandem RepeatsFinder, http://tandem.bu.edu/trf/trf.html )進(jìn)行搜尋。SSR 搜索的參數(shù)設(shè)置為:單堿基重復(fù)≥20bp (基序M=I ;重復(fù)次數(shù)N≥20) ;二堿基重復(fù)≥12bp (M=2 ；N≥6);三堿基重復(fù)≥15bp (M=3 ；N≥5);四堿基重復(fù)≥16bp (M=4 ；N≥4);五堿基重復(fù)≥15bp (M=5 ；N≥3);六堿基重復(fù)≥18bp (M=6 ；N≥3)。
[0019](2) SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與PCR擴(kuò)增分析
利用Perl語(yǔ)言編寫程序，在符合條件的SSR位點(diǎn)兩側(cè)各截取長(zhǎng)度為200bp的核苷酸序列，用 Primer3 (http://www.frod0.w1.mit.edu/cgi_bin/primer3)設(shè)計(jì) SSR 引物。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，主要考慮以下幾個(gè)關(guān)鍵因素:l)引物長(zhǎng)度，18~25bp (理想值為20bp);2)PCR預(yù)期擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度，15(T400bp (理想值為200bp) ;3)退火溫度(Tm), 55~62°C (理想值為58°C )；4)6(:含量(60%)，40~60% (理想值為50%) ;5)盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)及錯(cuò)配。PCR擴(kuò)增體系為 20 μ L，其中 15~30叩/^1^嫩樣品 1.5uL、10XPCR Reaction Buffer(Mg2+pIus)2μ L、25mmol/L dNTPs 1.2 μ L、10 μ mol/L 正反向引物各 2 μ L、0.75U，最后用 ddH20 補(bǔ)足20μ L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性5 min ;然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95°C變性30s、60°C復(fù)性30s、72°C延伸30s ;最后72°C延伸5 min。PCR產(chǎn)物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，220V恒壓下電泳1.5h,按照Sanguinetti等(SANGUINETTI C J,DIAS N E, SIMPSON A J.Rapid silver staining and recovery of PCR products separatedon polyacrylamide gels.Biotechniques，1994, 17: 915-919)的快速銀染法進(jìn)行染色，并拍照保存。
[0020](3)多態(tài)性SSR標(biāo)記篩選與遺傳圖譜構(gòu)建
以親本RBST、紅花大金元及其雜交F1為材料，對(duì)新開(kāi)發(fā)的約20000對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，獲得607對(duì)在兩親本間有差異且在F1中呈共顯性的清晰、穩(wěn)定、可靠的多態(tài)性SSR引物用于213個(gè)BC1F1作圖單株基因型分析。利用作圖軟件JoinMap? v4.0對(duì)有多態(tài)的煙草SSR引物在213個(gè)BC1F1作圖單株中所獲得的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析并構(gòu)建煙草全基因組遺傳連鎖圖譜。
[0021](4)煙草黑脛病抗性基因/?的精細(xì)定位
基于已構(gòu)建的遺傳連鎖圖并結(jié)合9000個(gè)BC1F1定位單株材料的基因型數(shù)據(jù)和黑脛病抗性鑒定數(shù)據(jù)，利用JoinMap? v4.0軟件將/?基因定位在第20號(hào)連鎖群上。軟件JoinMap?v4.0 的參數(shù)設(shè)置為:Kosambi ' s mapping function ； Goodness-of-fit Jump thresholdfor removal loci = 5.0 ；Number of added loci after which to perform a ripple = I ；Recombination frequency ^ 0.35 ；L0D score > 2.0 和 Third round = Yes。利用 JoinMap?v4.0軟件中的Regression Mapping算法,對(duì)第20號(hào)連鎖群上標(biāo)記的順序和標(biāo)記間的遺傳距離進(jìn)行了計(jì)算并繪制連鎖圖，最終，將目的基因/?定位在SSR標(biāo)記TM29和TM50之間0.239cM的區(qū)間內(nèi)，其中標(biāo)記TM29和TM50與/?基因的遺傳距離分別為0.09IcM和
0.148cM。
[0022] 擴(kuò)增本發(fā)明所述的煙草黑脛病抗性基因/?的分子標(biāo)記TM29的引物對(duì)序列為: TM29F:5/ -AGACGGGGCTAAATTTGACA-3'；
TM29R:5/ -AGCGGAAGAGTTGAGGACAA-3,。
[0023]如圖2所示，利用該引物對(duì)擴(kuò)增得到的片段大小為469bp或479bp ;所述的469bp片段為含/?基因的植株所特有，其序列為SEQ ID N0.1 ;所述的479bp片段為不含/?基因的植株所特有，其序列為SEQ ID N0.2。
[0024]擴(kuò)增本發(fā)明所述的煙草黑脛病抗性基因/?的分子標(biāo)記TM50的引物對(duì)序列為: TM50F:5/ -TCCTCTGAAGGCAGATGGAG-3'；
TM50R:5/ -TGCCTTTACGAGATGCTGTG-3'。
[0025]如圖3所示，利用該引物對(duì)擴(kuò)增得到的片段大小為459bp或433bp ;所述的459bp片段為含/?基因的植株所特有，其序列為SEQ ID N0.3 ;所述的433bp片段為不含/?基因的植株所特有，其序列為SEQ ID N0.4。
[0026]本發(fā)明所述分子標(biāo)記在檢測(cè)煙草黑脛病抗性基因/?中的應(yīng)用，包括如下具體步驟:
(1)CTAB法提取植株DNA;
(2)建立PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)體系總體積為20μ L，包括所述分子標(biāo)記ΤΜ29或ΤΜ50的正反向引物各 0.8Mmol/L, 1.5mmol/L dNTPs, 2μL 10Χ PCR Buffer (Mg2+plus)，0.75~1.0U Taq 聚合酶TaKaRa Ltd.), DNA 模板 30~50ng ；
(3)運(yùn)行PCR反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性5min;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5min ；
(4)用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR產(chǎn)物，硝酸銀銀染顯色；
(5)電泳分離的片段與分子量標(biāo)記或標(biāo)準(zhǔn)樣品作比較，判斷是否含有/?基因。
[0027]本發(fā)明所述的分子標(biāo)記在煙草分子輔助育種中的應(yīng)用，利用所述的分子標(biāo)記TM29或/和TM50對(duì)待檢測(cè)樣品的全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，依據(jù)擴(kuò)增出的片段大小篩選出含有黑脛病抗性基因/?的材料，用于培育具有抗性的品種。[0028]本發(fā)明所述的分子標(biāo)記在煙草黑脛病抗性基因/?定位中的應(yīng)用，通過(guò)染色體步移法接近基因/?，一方面利用當(dāng)前距煙草黑脛病抗性基因/?最近的分子標(biāo)記TM29和TM50并結(jié)合紅花大金元基因組數(shù)據(jù)序列，在介于最近兩個(gè)標(biāo)記之間重新開(kāi)發(fā)新的標(biāo)記；另一方面重新擴(kuò)大定位群體并利用新開(kāi)發(fā)的標(biāo)記進(jìn)行基因型分析，如此反復(fù)，逐步縮小連鎖標(biāo)記與目的基因/?間的遺傳距離，從而為基因/?的克隆奠定基礎(chǔ)。
[0029]實(shí)施例1:驗(yàn)證分子標(biāo)記TM29檢測(cè)Ph基因的準(zhǔn)確性
選擇屬于5種不同煙草類型的14份材料..N.P lumbagini folia (野生煙,含/?基因)；Coker371-Gold (烤煙，含/?基因)；RBST (烤煙，含/?基因)；F1 (RBSTX紅花大金元，含/?基因);紅花大金元(烤煙，不含/?基因);云煙85 (烤煙，不含/?基因);云煙87 (烤煙，不含/?基因)；K326 (烤煙，不含/?基因);Hicks (烤煙，不含/%);單育二號(hào)(烤煙，不含/?基因);中煙100 (烤煙，不含/?基因);Florida301 (雪茄，不含/?基因);Beinhart_1000(晾曬煙，不含/?基因)；Samsun (香料煙，不含/?基因)。
[0030]提取14份材料的DNA，建立PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)體系總體積為20 μ L，包括分子標(biāo)記 ΤΜ29 的正反向引物 TM29F 和 TM29R 各 0.8Mmol/L，1.5mmol/L dNTPs, 2μL IOX PCRBuffer (Mg2+ plus), 0.75~1.0 U Taq 聚合酶TaKaRa Ltd.), DNA 模板 30~50ng。運(yùn)行PCR反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min ;用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR產(chǎn)物，硝酸銀銀染顯色；電泳分離的片段與分子量標(biāo)記作比較，判斷是否含有/?基因。
[0031]試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，電泳條帶的結(jié)果與材料的實(shí)際情況完全吻合。其中，基因型檢測(cè)為陽(yáng)性的材料，均含有來(lái)源于況plumbagini/b7ia的基因/?,且田間抗病鑒定為高抗，并確定是由O號(hào)小種引起的煙草黑脛病。4-F1 (RBSTX紅花大金元，含/?基因)是雜合體，故具有2條片段。而12-Florida301和13 -Beinhart-1000雖然田間的抗病鑒定為抗，但二者的黑脛病抗性是受微效多基因控制的而非由/?基因單獨(dú)控制，因此，分子標(biāo)記TM29不能在其二者中檢測(cè)到陽(yáng)性譜帶。試驗(yàn)證明了本發(fā)明所述的分子標(biāo)記TM29對(duì)由/?基因控制的煙草黑脛病抗性能夠進(jìn)行有效可靠的檢測(cè)。
[0032]實(shí)施例2:驗(yàn)證分子標(biāo)記TM50檢測(cè)Ph基因的準(zhǔn)確性
選擇屬于5種不同煙草類型的14份材料..N.plumbagini folia (野生煙,含/?基因)；Coker371-Gold (烤煙，含/?基因)；RBST (烤煙，含/?基因)；F1 (RBSTX紅花大金元，含/?基因);紅花大金元(烤煙，不含/?基因);云煙85 (烤煙，不含/?基因);云煙87 (烤煙，不含/?基因)；K326 (烤煙，不含/?基因);Hicks (烤煙，不含/%);單育二號(hào)(烤煙，不含/?基因);中煙100 (烤煙，不含/?基因);Florida301 (雪茄，不含/?基因);Beinhart_1000(晾曬煙，不含/?基因)；Samsun (香料煙，不含/?基因)。
[0033]提取14份材料的DNA，建立PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)體系總體積為20 μ L，包括分子標(biāo)記 ΤΜ50 的正反向引物 TM50F 和 TM50R 各 0.8Mmol/L，1.5mmol/L dNTPs, 2μL IOX PCRBuffer (Mg2+ plus), 0.75~1.0 U Taq 聚合酶TaKaRa Ltd.), DNA 模板 30~50ng。運(yùn)行PCR反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min ;用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR產(chǎn)物，硝酸銀銀染顯色；電泳分離的片段與分子量標(biāo)記作比較，判斷是否含有/?基因。
[0034]試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，電泳條帶的結(jié)果與材料的實(shí)際情況完全吻合。其中，基因型檢測(cè)為陽(yáng)性的材料，均含有來(lái)源于況plumbagini/b7ia的基因/?,且田間抗病鑒定為高抗，并確定是由O號(hào)小種引起的煙草黑脛病。4-F1 (RBSTX紅花大金元，含/?基因)是雜合體，故具有2條片段。而12-Florida301和13 -Beinhart-1000雖然田間的抗病鑒定為抗，但二者的黑脛病抗性是受微效多基因控制的而非由/?基因單獨(dú)控制，因此，分子標(biāo)記TM50不能在其二者中檢測(cè)到陽(yáng)性譜帶。試驗(yàn)證明了本發(fā)明所述的分子標(biāo)記TM50對(duì)由/?基因控制的煙草黑脛病抗性能夠進(jìn)行有效可靠的檢測(cè)。
[0035]實(shí)施例1和2表明，分子標(biāo)記TM29和TM50的檢測(cè)結(jié)果完全一致。因此，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，可使用這兩種分子標(biāo)記進(jìn)行雙重檢測(cè)，以保證檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。再利用分子標(biāo)記篩選出的含有黑脛病抗性基因Ph的材料，培育具有抗性的品種。
【權(quán)利要求】
1.一種用于煙草黑脛病抗性基因/?輔助選擇的分子標(biāo)記，其特征在于所述的分子標(biāo)記為TM29和TM50，在第20號(hào)基因連鎖群上分別位于基因/?兩側(cè)，與之緊密連鎖，分子標(biāo)記TM29與Ph基因的遺傳距離為0.091cM，分子標(biāo)記TM50與Ph基因的遺傳距離為0.148cM。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于煙草黑脛病抗性基因/?輔助選擇的分子標(biāo)記，其特征在于，擴(kuò)增分子標(biāo)記TM29的引物對(duì)序列為:
TM29F:5/ -AGACGGGGCTAAATTTGACA-3'；
TM29R:5/ -AGCGGAAGAGTTGAGGACAA-3,； 擴(kuò)增分子標(biāo)記TM50的引物對(duì)序列為:
TM50F:5/ -TCCTCTGAAGGCAGATGGAG-3'；
TM50R:5/ -TGCCTTTACGAGATGCTGTG-3'。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于煙草黑脛病抗性基因/?輔助選擇的分子標(biāo)記，其特征在于利用分子標(biāo)記TM29的引物對(duì)擴(kuò)增得到的片段大小為469bp或479bp ;所述的469bp片段為含/?基因的植株所特有，其序列為SEQ ID N0.1 ;所述的479bp片段為不含/?基因的植株所特有，其序列為SEQ ID N0.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于煙草黑脛病抗性基因/?輔助選擇的分子標(biāo)記，其特征在于利用分子標(biāo)記TM50的引物對(duì)擴(kuò)增得到的片段大小為459bp或433bp ;所述的459bp片段為含/?基因的植株所特有，其序列為SEQ ID N0.3 ;所述的433bp片段為不含/?基因的植株所特有，其序列為SEQ ID N0.4。
5.一種權(quán)利要求f 4任一所述的分子標(biāo)記在檢測(cè)煙草黑脛病抗性基因/?中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分子標(biāo)記在檢測(cè)煙草黑脛病抗性基因/?中的應(yīng)用，其特征在于是將待檢測(cè)的植株DNA為反應(yīng)模板，對(duì)所述的用于煙草黑脛病抗性基因/?輔助選擇的分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增得到的分子標(biāo)記的片段大小判斷植株中是否含有/?基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分子標(biāo)記在檢測(cè)煙草黑脛病抗性基因/?中的應(yīng)用，其特征在于包括如下具體步驟: (1)提取植株DNA； (2)建立PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)體系總體積為20μ L，包括分子標(biāo)記引物對(duì)的正反向引物各 0.8Mmol/L, 1.5mmol/L dNTPs，2PL IOX PCR Buffer (Mg2+ plus)，0.75~1.0 U 聚合酶TaKaRa Ltd.), DNA 模板 30~50ng ； (3)運(yùn)行PCR反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性5min;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5min ； (4)用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR產(chǎn)物，硝酸銀銀染顯色； (5)電泳分離的片段與分子量標(biāo)記或標(biāo)準(zhǔn)樣品作比較，判斷是否含有/?基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分子標(biāo)記在檢測(cè)煙草黑脛病抗性基因/?中的應(yīng)用，其特征在于步驟(2)所述的分子標(biāo)記引物對(duì)為TM29的引物對(duì)或TM50的引物對(duì)，其序列如下: TM29的引物對(duì)序列為:
TM29F:5/ -AGACGGGGCTAAATTTGACA-3'；
TM29R:5/ -AGCGGAAGAGTTGAGGACAA-3,； TM50的引物對(duì)序列為:
TM50F:5/ -TCCTCTGAAGGCAGATGGAG-3'；TM50R:5; -TGCCTTTACGAGATGCTGTG-3'。
9.一種權(quán)利要求1~4任一所述的分子標(biāo)記在煙草分子輔助育種中的應(yīng)用。
10.一種權(quán)利要求1~4任一所述的分子標(biāo)記在煙草黑脛病抗性基因/?定位中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103993013SQ201410250226
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月9日
【發(fā)明者】童治軍, 肖炳光, 李永平, 陳學(xué)軍, 方敦煌 申請(qǐng)人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院