濕熱法美拉德反應(yīng)制備蕎麥蛋白-糖接枝物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了濕熱法美拉德反應(yīng)制備蕎麥蛋白-糖接枝物，將蕎麥蛋白、糖、水按1:1:1000～1:7:1000的質(zhì)量比混合，調(diào)pH到10～12，50～70℃水浴90～120min，冰浴5～10min，-15～-25℃冷凍6-12h后進(jìn)行冷凍干燥。本發(fā)明還公開(kāi)了由以上方法得到的蕎麥蛋白-糖接枝物及其在功能性食品的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)量較高的蕎麥蛋白的提取方法，經(jīng)處理，得到了蕎麥蛋白，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，效果良好。測(cè)定上述蕎麥蛋白-糖接枝物的抗氧化效果，并用相同量的糖類、蕎麥蛋白、抗壞血酸作對(duì)照，結(jié)果顯示，蕎麥蛋白-糖接枝物表現(xiàn)出良好的抗氧化性。
【專利說(shuō)明】濕熱法美拉德反應(yīng)制備蕎麥蛋白-糖接枝物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物蛋白領(lǐng)域，具體涉及濕熱法美拉德反應(yīng)制備蕎麥蛋白-糖接枝物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物蛋白具有資源豐富、價(jià)格低廉、能量轉(zhuǎn)化效率高、幾乎不含膽固醇和飽和脂肪酸等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為人類主要的蛋白質(zhì)來(lái)源。蕎麥屬于寥科蕎麥屬雙子葉植物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，被現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為21世紀(jì)有前途的最風(fēng)行的綠色食品。蕎麥蛋白是蕎麥中的主要生物活性成分，它不同于谷類作物蛋白，蕎麥蛋白質(zhì)主要是谷蛋白、水溶性清蛋白和鹽溶性球蛋白等。這類蛋白質(zhì)的粘性差，無(wú)面筋性，近似于豆類植物蛋白，其蛋白質(zhì)質(zhì)量?jī)?yōu)于大米、小麥和玉米蛋白。從氨基酸組成來(lái)看，蕎麥蛋白含有19種氨基酸，其中包括人體必需的8種氨基酸，且氨基酸配比適宜，符合或超過(guò)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織對(duì)食物蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量規(guī)定的指標(biāo)，與雞蛋蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)相似。蕎麥蛋白還具有降低液膽固醇、抑制脂肪蓄積、改善便秘、抗衰老、抑制有害物的吸收等生理功能。蕎麥蛋白具有較高的持水性、乳化性、起泡性和咀嚼性及良好的生理生化性質(zhì)。這為蕎麥蛋白在食品工業(yè)的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。這正是本發(fā)明的出發(fā)點(diǎn)。
[0003]美拉德反應(yīng)，又稱羰氨反應(yīng)，是指含有氨基的化合物和含有羰基的化合物之間經(jīng)縮合、聚合，最終生成類黑精的反應(yīng)。由于其產(chǎn)物是棕色的，也被稱為褐變反應(yīng)。反應(yīng)物中羰基化合物包括還原糖、醛、酮；氨基化合物包括氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、胺。MRPs中含有類黑精、還原酮及一系列含1、H的雜環(huán)化合物，它們有一定的抗氧化性能。通常美拉德反應(yīng)所需要的氨基化合物和羰基化合物的選擇范圍非常廣泛，但是接枝物的抗氧化性各有差異。選擇適當(dāng)?shù)陌被衔锖汪驶衔?，可以顯著提高接枝物的抗氧化性。
[0004]濕熱法是以液相為反應(yīng)體系，一般用于蛋白質(zhì)與單糖或雙糖的接枝反應(yīng)中。其反應(yīng)的初始步驟與干熱法類似，將蛋白質(zhì)和糖按照一定的糖配比混合，并用特定PH值的緩沖溶液將其溶解，攪拌均勻后，利用水浴或者油浴進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后立即冰浴。濕熱法的反應(yīng)時(shí)間相對(duì)于干熱法來(lái)說(shuō)要短，通常適用于蛋白質(zhì)-單糖(或雙糖)接枝物的制備。
[0005]冷凍干燥是將待干燥物快速凍結(jié)后，再在高真空條件下將其中的冰升華為水蒸氣而去除的干燥方法。由于冰的升華帶走熱量使凍干整個(gè)過(guò)程保持低溫凍結(jié)狀態(tài)，有利于保留一些生物樣品的活性。因此用冷凍干燥法制備一種蕎麥蛋白-木糖接枝物。
[0006]與很多化學(xué)和酶法對(duì)蛋白質(zhì)改性的方法相比，美拉德反應(yīng)的方法具有很好的安全性；此外，該法還能極大的改善蛋白乳化性，改善不溶的面筋蛋白溶解性。這種以美拉德反應(yīng)制備的蕎麥蛋白-糖接枝物可用作乳化劑、抗氧化劑和抑菌劑，可應(yīng)用于食品、藥品和化妝品中。蕎麥蛋白被糖類接枝后，其消化率增加，利于人體吸收，本身的很多功能性質(zhì)也會(huì)有所提高。因此，本發(fā)明以蕎麥蛋白為氨基化合物，以糖類為羰基化合物，利用濕熱法美拉德反應(yīng)制備蕎麥蛋白-糖接枝物。以羥基自由基(.0Η)的清除率，二苯基苦基苯肼自由基(DPPH.)的清除率和超氧陰離子((V.)的清除率為考察指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)，確定制備蕎麥蛋白-糖接枝物各因素的最佳參數(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于由濕熱法美拉德反應(yīng)制備蕎麥蛋白-糖接枝物，制備方法簡(jiǎn)單、效果良好、易于生產(chǎn)。
[0008]本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0009]濕熱法美拉德反應(yīng)制備蕎麥蛋白-糖接枝物，蕎麥蛋白、糖、水按1:1:1000?1:7:1000的質(zhì)量比混合，調(diào)pH到10?12，50?70 °C水浴90?120min，冰浴5?IOmin, -15?_25°C冷凍6?12h后冷凍干燥。
[0010]優(yōu)選地，所述糖為單糖。
[0011]優(yōu)選地，所述蕎麥蛋白由蕎麥粉經(jīng)堿溶酸沉法的提取方法制備。
[0012]優(yōu)選地，所述提取方法的操作步驟如下:
[0013]第一步、取質(zhì)量比為1:6?1:14的蕎麥粉和水混合，調(diào)節(jié)pH到10?12，攪拌，離心得到上清液；調(diào)節(jié)所述上清液的pH到4.5，離心獲得沉淀物；
[0014]第二步、將第一步所得的沉淀物經(jīng)透析、冷凍干燥得蕎麥蛋白。
[0015]優(yōu)選地，第一步中，所述攪拌是在2(TC磁力攪拌30?120min ；
[0016]所述離心是10 ?30°C下，4000 ?5000r/min 離心 10 ?20min。
[0017]優(yōu)選地，所述第二步具體操作為所得的沉淀物用流動(dòng)水透析18?24h，用去離子水透析18?24h后，低溫靜置18?24h，經(jīng)冷凍干燥獲得蕎麥蛋白粉末。
[0018]本發(fā)明還提供所述濕熱法制備的蕎麥蛋白-糖接枝物。
[0019]本發(fā)明還提供所述蕎麥蛋白-糖接枝物在功能性食品中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明提供了一種蕎麥蛋白的制備方法，經(jīng)處理，得到了蕎麥蛋白，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白。這種蛋白與糖經(jīng)過(guò)濕熱法美拉德反應(yīng)，制備了蕎麥蛋白-糖接枝物。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，效果良好。測(cè)定上述蕎麥蛋白-糖接枝物的抗氧化效果，并用相同量的糖、蕎麥蛋白、抗壞血酸作對(duì)照，結(jié)果顯示，蕎麥蛋白-糖接枝物表現(xiàn)出良好的抗氧化性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]本發(fā)明附圖4幅，
[0022]圖1、蕎麥蛋白-糖接枝物對(duì)羥自由基(.0H)的清除；
[0023]圖2、蕎麥蛋白-糖接枝物對(duì)二苯基苦基苯肼自由基(DPPH.)的清除；
[0024]圖3、蕎麥蛋白-糖接枝物對(duì)超氧陰離子(02_.)的清除；
[0025]圖4、蕎麥蛋白-糖接枝物的溶解率。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0027]以下結(jié)合具體的實(shí)例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明:
[0028]本發(fā)明所用蕎麥粉為市售普通蕎麥粉。
[0029]實(shí)施例1[0030]蕎麥蛋白的制備
[0031]蕎麥蛋白的提取方法如下:
[0032]第一步、取蕎麥粉與水按1:10的質(zhì)量比混合，用Imol/LNaOH調(diào)pH到10后，20°C磁力攪拌30min ；20°C >5000r/min離心20min得到上清液；再用lmol/LHCl調(diào)pH到4.5,產(chǎn)生沉淀后2(TC、4000r/min離心15min,離心獲得沉淀物；
[0033]第二步、所得的沉淀物用流動(dòng)水透析18?24h，用去離子水透析18?24h后，低溫靜置18?24h，經(jīng)冷凍干燥獲得米白色蕎麥蛋白粉末。
[0034]實(shí)施例2
[0035]蕎麥蛋白-木糖接枝物的制備及抗氧化性的研究
[0036]—、將所得米白色蕎麥蛋白粉末與木糖制備成蕎麥蛋白-木糖接枝物，接枝物的的原材料是以蕎麥蛋白為氨基化合物，以木糖為羰基化合物:將蕎麥蛋白、木糖、水按1:5:1000的質(zhì)量比混合，用Imol/LNaOH調(diào)pH到12，在溫度50°C的條件下水浴120min，反應(yīng)結(jié)束后立即冰浴5min，然后-20°C冷凍6?12h，冷凍干燥成粉末得到蕎麥蛋白-木糖接枝物粗產(chǎn)品，4 V條件下保存。
[0037]二、將所得蕎麥蛋白和蕎麥蛋白-木糖接枝物進(jìn)行抗氧化性比對(duì)
[0038]1、蕎麥蛋白和蕎麥蛋白-木糖接枝物對(duì)羥基自由基(.0H)清除率的測(cè)定
[0039]取磷酸鹽緩沖液(0.15mol/L，pH7.4) 1.5mL, 1.10-菲咯啉(0.75mmol/L) 1.0mL,新配制的硫酸亞鐵溶液(0.75mmol/L) ImL,再加入濃度為1.2mg/mL的蕎麥蛋白水溶液或蕎麥蛋白-木糖接枝物水溶液lmL，最后再加入0.01 %的過(guò)氧化氫1.0mL,混勻后于37°C恒溫水浴中保溫30min，冷卻后在530nm處測(cè)吸光度值。以蒸餾水調(diào)零，空白組以等體積去離子水代替樣品溶液，對(duì)照組以等體積去離子水代替樣品溶液和過(guò)氧化氫溶液，以同一濃度的抗壞血酸水溶液代替樣品作對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果按下式計(jì)算:
[0040]清除率(％ ) = [A對(duì)照-A樣品/A對(duì)照-A空白]X 100
[0041]測(cè)定蕎麥蛋白、蕎麥蛋白-木糖接枝物和抗壞血酸對(duì)羥基自由基(.0H)清除率，蕎麥蛋白-木糖接枝物的清除率較蕎麥蛋白的清除率提高了很多，結(jié)果表明蕎麥蛋白-木糖接枝物的抗氧化能力強(qiáng)于蕎麥蛋白(見(jiàn)表4、圖1)。
[0042]2、蕎麥蛋白和蕎麥蛋白-木糖接枝物對(duì)二苯基苦基苯肼自由基(DPPH.)清除率的測(cè)定
[0043]取濃度為1.2mg/mL的蕎麥蛋白水溶液或蕎麥蛋白-木糖接枝物水溶液2.0mL,分別加入0.2mmol/L的DPPH溶液2.0mL,混勻后避光反應(yīng)靜置30min。以無(wú)水乙醇調(diào)零，在517nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)#s，無(wú)水乙醇代替DPPH溶液的吸光度值為AWM，無(wú)水乙醇代替樣品溶液的吸光度值為Ase,以同一濃度抗壞血酸水溶液代替樣品作對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果按下式計(jì)算:
[0044]清除率(％ ) = [1_(A樣品-A對(duì)照)/A空白]X 100
[0045]測(cè)定蕎麥蛋白、蕎麥蛋白-木糖接枝物和抗壞血酸對(duì)二苯基苦基苯肼自由基(DPPH.)清除率，蕎麥蛋白-木糖接枝物的清除率較蕎麥蛋白的清除率有所提高，結(jié)果表明蕎麥蛋白-木糖接枝物的抗氧化能力強(qiáng)于蕎麥蛋白(見(jiàn)表5、圖2)。
[0046]3、蕎麥蛋白和蕎麥蛋白-木糖接枝物對(duì)超氧陰離子((V.)清除率的測(cè)定
[0047]取4.5mL的Tris-HCl緩沖液(50mmol/L, ρΗ8.2)于比色管中，置于25°C恒溫水浴中預(yù)熱20min，加入濃度為1.2mg/mL的蕎麥蛋白水溶液或蕎麥蛋白-木糖接枝物水溶液
0.1mL,再加入0.4mL在25°C恒溫水浴中早已預(yù)熱好的鄰苯三酹溶液(7mmol/L),搖勻后與25°C恒溫水浴準(zhǔn)確反應(yīng)4min，然后加入2滴濃鹽酸(10mol/L)終止反應(yīng)，于320nm處測(cè)其吸光度值。以同一濃度的抗壞血酸水溶液代替樣品作對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果按下式計(jì)算:
[0048]清除率(%) = [1-(Ab-Ac)/AJ X 100%
[0049]其中:
[0050]Aa:不加樣品，加鄰苯三酚
[0051]Ab:加樣品，加鄰苯三酚
[0052]Ac:加樣品，不加鄰苯三酚(見(jiàn)表6、圖3)。
[0053]測(cè)定蕎麥蛋白、蕎麥蛋白-木糖接枝物和抗壞血酸對(duì)超氧陰離子(02_.)清除率，蕎麥蛋白-木糖接枝物的清除率較蕎麥蛋白的清除率有所提高，結(jié)果表明蕎麥蛋白-木糖接枝物的抗氧化能力強(qiáng)于蕎麥蛋白。
[0054]三、將所得蕎麥蛋白與蕎麥蛋白-木糖接枝物做體內(nèi)抗氧化性評(píng)價(jià)，測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活力、過(guò)氧化氫酶(CAT)的活力及丙二醛(MDA)的含量。
[0055]選取健康昆明種小鼠72只，體重20±2g，用普通飼料喂養(yǎng)7天以適應(yīng)環(huán)境；之后隨機(jī)分為6組，每組12只，雌雄各半。空白對(duì)照組小鼠每天灌胃生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠每天灌胃抗壞血酸水溶液，正常對(duì)照組小鼠每天灌胃蕎麥蛋白水溶液，三劑量組每日分別按10mg/kg.d、20mg/kg.d、50mg/kg.d劑量灌胃蕎麥蛋白-木糖接枝物,各組自由飲水，自由攝食，飼喂40天后，禁食12h，摘除眼球進(jìn)行眼眶采血，并解剖取肝臟，冷凍備用。
[0056](I)超氧化物歧化酶(SOD)活力測(cè)定
[0057]按照試劑盒(生產(chǎn)廠商:南京建成)說(shuō)明書要求采用黃嘌呤氧化酶法。
[0058]測(cè)定原理:通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在550nm處測(cè)定其吸光度。
[0059]
【權(quán)利要求】
1.濕熱法美拉德反應(yīng)制備蕎麥蛋白-糖接枝物，其特征在于蕎麥蛋白、糖、水按1:1:1000?1:7:1000的質(zhì)量比混合，調(diào)pH到10?12，50?70°C水浴90?120min，冰浴5?lOmin，-15?_25°C冷凍6?12h后進(jìn)行冷凍干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的濕熱法美拉德反應(yīng)制備蕎麥蛋白-糖接枝物，其特征在于所述糖為單糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的濕熱法制備蕎麥蛋白-糖接枝物，其特征在于所述蕎麥蛋白由蕎麥粉經(jīng)堿溶酸沉的提取方法制備。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的濕熱法制備蕎麥蛋白-糖接枝物，其特征在于所述提取方法的操作步驟如下: 第一步、取質(zhì)量比為1:6?1:14的蕎麥粉和水混合，調(diào)節(jié)pH到10?12，攪拌，離心得到上清液；調(diào)節(jié)所述上清液的PH到4.5，離心獲得沉淀物； 第二步、將第一步所得的沉淀物經(jīng)透析、冷凍干燥得蕎麥蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的濕熱法制備蕎麥蛋白-糖接枝物，其特征在于: 第一步中，所述攪拌是在20°C磁力攪拌30?120min ;所述離心是10?30°C下,4000?5000r/min 離心 10 ?20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的濕熱法制備蕎麥蛋白-糖接枝物，其特征在于: 所述第二步具體操作為所得的沉淀物用流動(dòng)水透析18?24h，用去離子水透析18?24h后，低溫靜置18?24h，經(jīng)冷凍干燥獲得蕎麥蛋白粉末。
7.權(quán)利要求1?6任意一項(xiàng)所述濕熱法制備蕎麥蛋白-糖接枝物得到的蕎麥蛋白-糖接枝物。
8.權(quán)利要求7所述蕎麥蛋白-糖接枝物在功能性食品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23J1/12GK104000003SQ201410251060
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】葉淑紅, 王心宇, 王際輝 申請(qǐng)人:大連工業(yè)大學(xué)