與大豆籽粒硬脂酸含量相關的緊密連鎖標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與大豆籽粒硬脂酸含量相關的緊密連鎖標記及其應用。本發(fā)明公開的一對引物，該對引物由SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示的DNA分子組成。本發(fā)明公開的連鎖標記可以應用于評價大豆籽粒中硬脂酸含量及大豆選育。
【專利說明】與大豆籽粒硬脂酸含量相關的緊密連鎖標記及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分子標記及其應用；特別涉及一種與大豆籽粒硬脂酸含量相關的緊密連鎖標記及其應用，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]大豆油占世界植物油的30%，它主要包含有五種脂肪酸:軟脂酸約占11%左右，硬脂酸約占4%左右，油酸約占24%左右，亞油酸約占54%左右，亞麻酸約占7%左右。雖然軟脂酸和硬脂酸都是飽和脂肪酸，但硬脂酸并不同于軟脂酸，有研究證明硬脂酸可以降低血液中總的膽固醇水平，益于人類健康，并且可以不用氫化直接生產(chǎn)人造奶油、潤滑劑，油墨和生物石油等。因此增加大豆飽和脂肪酸含量以滿足用油加工的需要將是一個重要的育種目標。
[0003]近年來，國內(nèi)外對大豆硬脂酸的研究日漸增多，Spencer等(2003)用Dare xFAM94-41雜交的F2:3分離群體鑒定出連鎖群B2上和硬脂酸高度相關的3個SSR標記Satt556, Satt474, Satt070 ；Xianzhi Wang 等利用 SD02-4-59 和 A02-381100 雜交的重組自交系F5，運用CM和頂方法定位到5個和硬脂酸高度相關的標記:BARC-041257-07953、BARC-029787-06340、Satt252、Sat_064、BARC-014699-01621 ;苗興芬等在多種環(huán)境下檢測到6個和硬脂酸有關的位點等，開發(fā)新的與大豆籽粒硬脂酸含量相關的緊密連鎖標記對評價大豆籽粒中硬脂酸含量以及大豆育種具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種與大豆籽粒硬脂酸含量相關的緊密連鎖標記及其應用。
[0005]本發(fā)明提供一對引物，該對引物由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的DNA分子組成。
[0006]一種分子標記也屬于本發(fā)明的保護范圍，該分子標記是以植物組織的基因組DNA為模板，以所述的引物對為引物進行PCR擴增得到的DNA片段。
[0007]上述分子標記中，所述植物為大豆；
[0008]所述組織具體為葉片；
[0009]所述大豆具體為冀豆12號和/或黑豆。
[0010]所述黑豆為黑豆(ZDD03651)。
[0011]一種評價待測大豆的籽粒硬脂酸含量高低的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍，，包括如下步驟:以待測大豆組織的基因組DNA為模板，以所述的引物對為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；PCR擴增產(chǎn)物大小在140-155bp之間的大豆的籽粒硬脂酸含量高于PCR擴增產(chǎn)物含有大小分別在140-155bp之間的片段和在160-170bp之間的片段的大豆的籽粒硬脂酸含量，PCR擴增產(chǎn)物含有大小分別在140-155bp之間的片段和在160_170bp之間的片段的大豆的籽粒硬脂酸含量高于PCR擴增產(chǎn)物大小在160-170bp之間的大豆的籽粒硬脂酸含量。[0012]上述方法中，所述PCR擴增產(chǎn)物大小在140_155bp之間的片段，與以冀豆12號組織的基因組DNA為模板，以所述的引物對為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物的片段一致；
[0013]所述PCR擴增產(chǎn)物大小在160-170bp之間的片段，與以黑豆ZDD03651組織的基因組DNA為模板，以所述的引物對為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物的片段一致。
[0014]上述任一所述的方法中，所述組織為葉片。
[0015]上述任一所述的方法中，所述待測大豆為冀豆12號和黑豆ZDD03651的雜交后代。
[0016]上述任一所述的方法中，所述冀豆12號為母本；
[0017]所述黑豆ZDD03651為父本；
[0018]所述雜交后代為Fl代和/或Fl代自交得到的F2代和/或F2代連續(xù)自交得到的后代。
[0019]上述引物對、上述任一所述的分子標記在評價大豆籽粒的硬脂酸含量高低中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0020]上述引物對、上述任一所 述的分子標記在大豆選育中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0021]上述任一所述的應用中，所述大豆為冀豆12號和黑豆的雜交后代；
[0022]所述冀豆12號具體為母本；
[0023]所述黑豆具體為父本；
[0024]所述黑豆具體為黑豆(ZDD03651)；
[0025]所述雜交后代為Fl代和/或Fl代自交得到的F2代和/或F2代連續(xù)自交得到的后代。
[0026]本發(fā)明提供的連鎖標記可以應用于評價大豆籽粒中硬脂酸含量及大豆選育。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為群體1、群體II以及兩親本的籽粒硬脂酸含量的表型分布。
[0028]圖2為satt556附近的5個標記間遺傳連鎖圖。
【具體實施方式】
[0029]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0030]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0031]冀豆12號(Glycine max(L.)Merr)在文獻“陳強等.冀豆12遺傳背景下3個回交組合高低蛋白含量后代品系SSR標記分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2014，47 (2): 230-239”中公開過，公眾可從河北省農(nóng)林科學院糧油作物研究所獲得。
[0032]黑豆(ZDD03651)(Glycine soja Sieb.Et Zucc.)在文獻“雷雅坤.大豆五種脂肪酸含量遺傳分析與QTL定位[D].石家莊:河北師范大學，2012.”中公開過，公眾可從河北省農(nóng)林科學院糧油作物研究所獲得。
[0033]實施例1、大豆籽粒硬脂酸含量檢測方法
[0034]將待檢大豆樣品用研磨儀充分研磨，磨好后取0.1g豆粉放入2.0mL離心管中，加ImL脂肪提取液(苯:石油醚體積比1: 1，混勻)，振蕩混勻60min，離心后取上清，加1.5mL的0.4mol/L甲醇鉀(IOmL甲醇中加入0.2g氫氧化鉀)甲酯化，靜置60min，加5ml蒸餾水，使樣品分層。吸取2 μ L最上層油份萃取物進行氣相色譜分析(采用安捷倫6890Ν氣相色譜儀)。
[0035]色譜條件:FID檢測器，F(xiàn)FAP彈性石英毛細管柱，恒壓的模式，載氣:高純氮氣流速:lmL/min ;H2 流速:35mL/min ;空氣流速:350mL/min。進樣量:2yL。分流比:10:1,進樣口的溫度:250°C。檢測器的溫度:250°C。程序溫:180°C，3min，9°C /min升到225°C /min,保持 25min。
[0036]通過氣相色譜計算檢測的硬脂酸占總脂肪酸的含量，最終得到待檢大豆籽粒總脂肪酸中的硬脂酸含量。
[0037]實施例2、與大豆籽粒硬脂酸含量相關的緊密連鎖標記的篩選
[0038]一、群體的構建
[0039]以冀豆12號(Glycine max(L.)Merr)為母本，地方半野生品種黑豆(ZDD03651)(Glycine soja Sieb.Et Zucc.)為父本雜交，在初定位的基礎上，選擇與硬脂酸含量緊密連鎖標記satt556附近的3個標記(satt474、sct_094、satt556)在其衍生的F2:6代次級群體中進行掃描，篩選出3個標記均雜合的剩余雜合體，將其衍生的85個單株組成RHL (剩余雜合系)。
[0040]2012年6月將RHL播種于石家莊堤上試驗站，篩選3個標記均雜合的單株I株。2012年11月該單株200粒種子衍生成次級群體I，采用單粒點播種植于三亞試驗站，單株收獲。2013年6月從群體I每株的種子中取一粒種子衍生成次級群體II，單粒播種于石家莊堤上試驗站，單株收 獲。
[0041]二、DNA的提取及SSR引物的篩選
[0042]在田間采集次級群體I和次級群體II的單株苗期第4周的第三片復葉，采用SDS 法提取 DNA。參照文獻“Song QJ, Jia GF, Zhu YL, Grant D, Nelson RT, Hwang EY, HytenDL, Cregan PB (2010) Abundance of SSR motifs and development of candidate polymorphicSSR markers(BARCS0YSSR_1.0)in soybean.Crop Sci50:1950 - 1960.Cregan, P.B.，T.Jarvik, A.L.Bush, R.C.Shoemaker, K.G.Lark, A.L.Kahler, N.Kaya, T.T.VanToai, D.G.Lohnes, J.Chung, and J.E.Specht.1999.An integrated genetic linkage map of thesoybean.Crop Sc1.39:1464 - 1490”公開的標記，從中選擇48個在satt556附近的標記，篩選出3個在母本和父本中有差異的SSR引物,并根據(jù)Soybase網(wǎng)站(http://soybase.0rg/)提供的大豆SSR序列合成擴增相應標記的引物。
[0043]三、帶型檢測
[0044]分別以步驟二提取的DNA為模板，以各SSR引物為引物進行PCR擴增，進行相應分子標記帶型檢測，將所得的帶型記作帶型X ;以冀豆12 (母本)的DNA為模板，以相應的SSR引物為引物進行PCR擴增，進行相應分子標記帶型檢測，將所得的帶型記作帶型A ;以黑豆(父本)的DNA為模板，以相應的SSR引物為引物進行PCR擴增，進行相應分子標記帶型檢測，將所得的帶型記作帶型B ；X有三種情形，第一種為X與A —致，第二種為X與B —致，第三種為X為既含有A，又含有B的雜合帶型，將此雜合帶型記作帶型H。
[0045]其中5個標記的引物如表1所示。
[0046]其中Barcsoyssr_14_1033的上游引物如SEQ ID N0.3所示，下游引物如SEQ IDN0.4所示。
[0047]當所用的SSR引物為Barcsoyssr_14_1033標記的引物時，A帶型的大小在140-155bp之間，B帶型的大小在160-170bp之間，H帶型的大小分別在140_155bp和160-170bp 之間。
[0048]表1引物序列表
[0049]
【權利要求】
1.一對引物，該對引物由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的DNA分子組成。
2.一種分子標記，該分子標記是以植物組織的基因組DNA為模板，以權利要求1所述的引物對為引物進行PCR擴增得到的DNA片段。
3.根據(jù)權利要求2所述的分子標記，其特征在于:所述植物為大豆； 所述組織具體為葉片； 所述大豆具體為冀豆12號和/或黑豆。
4.一種評價待測大豆的籽粒硬脂酸含量高低的方法，包括如下步驟:以待測大豆組織的基因組DNA為模板，以權利要求1所述的引物對為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；PCR擴增產(chǎn)物大小在140-155bp之間的大豆的籽粒硬脂酸含量高于PCR擴增產(chǎn)物含有大小分別在140-155bp之間的片段和在160-170bp之間的片段的大豆的籽粒硬脂酸含量，PCR擴增產(chǎn)物含有大小分別在140-155bp 之間的片段和在160-170bp之間的片段的大豆的籽粒硬脂酸含量高于PCR擴增產(chǎn)物大小在160-170bp之間的大豆的籽粒硬脂酸含量。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于:所述PCR擴增產(chǎn)物大小在140-155bp之間的片段，與以冀豆12號組織的基因組DNA為模板，以權利要求1所述的引物對為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物的片段一致； 所述PCR擴增產(chǎn)物大小在160-170bp之間的片段，與以黑豆ZDD03651組織的基因組DNA為模板，以權利要求1所述的引物對為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物的片段一致。
6.根據(jù)權利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述組織為葉片。
7.根據(jù)權利要求4-6任一所述的方法，其特征在于:所述待測大豆為冀豆12號和黑豆ZDD03651的雜交后代。
8.根據(jù)權利要求4-7任一所述的方法，其特征在于:所述冀豆12號為母本； 所述黑豆ZDD03651為父本。
9.權利要求1所述的引物對、權利要求2或3所述的分子標記在評價大豆籽粒的硬脂酸含量高低中的應用。
10.權利要求1所述的引物對、權利要求2或3所述的分子標記在大豆選育中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104004757SQ201410251971
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月9日 優(yōu)先權日:2014年6月9日
【發(fā)明者】張孟臣, 鄧瑩瑩, 張梅申, 雷雅坤, 楊春燕, 閆龍, 東方陽, 喬亞科 申請人:河北省農(nóng)林科學院糧油作物研究所, 河北科技師范學院