一種植物強耐鹽基因SseNHX1及其編碼蛋白和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種植物強耐鹽基因SseNHX1及其編碼蛋白和應(yīng)用，植物強耐鹽基因SseNHX1如SEQ?ID?NO:1所示；植物強耐鹽基因SseNHX1編碼的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白如SEQID?NO:2所示；植物強耐鹽基因SseNHX1在培育抗鹽植物方面的應(yīng)用。本發(fā)明將同一家族中的2個不同來源的Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因(NHX1)通過基因改組后獲得的高度耐鹽的基因(SseNHX1)遺傳轉(zhuǎn)化模式植物煙草，經(jīng)過鹽脅迫處理后能夠進一步提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性，為培育出更具耐鹽性的新遺傳材料提供了依據(jù)。
【專利說明】—種植物強耐鹽基因SseNHXI及其編碼蛋白和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到植物基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一種植物強耐鹽基因SseNHXl及其編碼蛋白和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]土壤鹽堿化問題是目前全球最嚴重的環(huán)境問題之一，包括人口膨脹的各方面因素不斷使人類開發(fā)和利用大面積的土地，逐漸生成新的次生鹽潰化，加速了土壤鹽堿化的進程。目前全世界大約20%的耕種土地和50%的灌溉土地都不同程度的受到了鹽潰化的危害，并且每年平均約12萬hm2 土地發(fā)生次生鹽潰化(Zhu J K, Plant salt tolerance.Trendsin plant science.2001,6(2):66-71)。因此，土壤資源的開發(fā)和高效利用是保護人類糧食安全的重中之重。長期以來，為解決土壤的鹽潰化問題，國內(nèi)外展開了廣泛的研究。傳統(tǒng)的解決方法有挖溝排堿、淡水壓堿、平地深翻等。這些方法不但投資大，而且收效甚微。因此，從生物學的角度解決植物本身的耐鹽問題是鹽潰化土地改良和利用的根本出路。在當今提倡生態(tài)效益為重的前提下，普遍認為生物改良措施是最具有生態(tài)效益、經(jīng)濟效益的措施。因而，若能夠發(fā)現(xiàn)并創(chuàng)制耐高鹽的新型基因，進而將這些基因轉(zhuǎn)化到植物中以培育植物耐鹽新遺傳材料用于鹽潰化土地的生物改良，應(yīng)對未來農(nóng)業(yè)發(fā)展人口增多、可用耕地減少的挑戰(zhàn)，均具有重大的科學意義和經(jīng)濟價值。
[0003]鹽分對植物脅迫分為滲透脅迫、離子傷害、離子不平衡或營養(yǎng)缺乏三類，滲透脅迫和離子傷害目前被認為是對植物危害的兩個主要過程(Blumwald E, Aharon G S，Apse MP.Sodium transport in plant cells.Biochem Biophy Acta.2000, 1465:140-151)。在鹽脅迫下，一方面植物被迫吸收鹽離子，由于鹽離子的毒害作用，造成活性氧等自由基產(chǎn)生和修復(fù)系統(tǒng)的動態(tài)平衡被破壞，啟動了膜脂過氧化或膜蛋白過氧化作用，造成膜脂或膜蛋白損傷，從而破壞膜結(jié)構(gòu)，使質(zhì)膜的透性增加，胞內(nèi)水溶性物質(zhì)外滲，植物表現(xiàn)出鹽害特征。另一方面，土壤中的鹽分使土壤溶液的水勢降低，植物吸水困難造成“生理干旱”，從而表現(xiàn)出旱害特征。
[0004]為了抵御鹽離子的脅迫，植物體形成了一系列的調(diào)節(jié)適應(yīng)機制。植物耐鹽的機制在細胞水平上主要有滲透調(diào)節(jié)和離子均衡兩個方面。滲透調(diào)節(jié)主要是植物通過在細胞質(zhì)中積累脯氨酸、甘露糖、甜菜堿等滲透保護劑和其他無機鹽來降低滲透勢，避免失水。植物離子均衡的策略涉及消除Na+毒害，其核心就是降低細胞內(nèi)Na+濃度，促進細胞對K+的吸收(Viswanathan C，Andre J, Zhu J K.Understanding and improving salt tolerancein plants.Crop Sci, 2005,45(2):437-448)。而降低細胞內(nèi)Na+含量主要通過Na+的外排和Na+的液泡區(qū)隔化來實現(xiàn)，一般是由位于細胞質(zhì)膜或液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白來承擔。液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白(Vacuolar Na+/H+Antiporter, NHX)位于植物液泡膜上，可以使Na+在液泡內(nèi)區(qū)域化，不僅可以減少鹽分對植物細胞的傷害，還可以促進細胞從外界環(huán)境中吸水維持滲透平衡，對改善植物耐鹽性起著非常重要的作用(Mansour MMF，Salama K H A, Al-Mutawa M M.Transport proteins and salt tolerance in plants.PlantScience, 2003, 164:891-900.)。
[0005]近幾年，通過轉(zhuǎn)化NHX基因以提高植物耐鹽性的基因工程已經(jīng)展開，并在高等植物擬南芥等材料中取得了一定進展。到目前已經(jīng)從擬南芥、水稻、北濱藜、冰葉午時花、堿蓬、鹽角草等植物中分離出了 NHX基因，并都已證明該基因的表達產(chǎn)物具有Na+/H+交換的功能。這些結(jié)果表明，NHX基因是一種非常有效的耐鹽基因，利用基因工程手段將其轉(zhuǎn)入非抗鹽性農(nóng)作物中，可以培育出抗鹽的轉(zhuǎn)基因作物新品種，使其正常生長在鹽潰土壤上。在實際生產(chǎn)應(yīng)用上，植物耐鹽基因工程大多集中在針對單個耐鹽基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化，單個耐鹽基因盡管能夠在一定程度上提高植物的耐鹽性，然而，由于已克隆的單個基因活性不高、耐鹽性不強的缺陷，很大程度上限制了該基因的生產(chǎn)應(yīng)用和推廣。因此，利用分子生物學技術(shù)提高單個耐鹽基因的耐鹽能力逐漸成為了擴展耐鹽基因應(yīng)用進而培育更強轉(zhuǎn)基因耐鹽植物的新方向。
[0006]1994 年美國 Stemmer (Stemmer W.P.C.Rapid evolution of a protein in vitro byDNA shuffling.Nature, 1994，370(4):389-391)首次提出 DNA shuffling 的策略。DNA 改組(DNA shuffling)又稱有性PCR(sexual PCR)，其基本操作過程是:將一群密切相關(guān)的序列，如多種同源而有差異的基因(或一組突變的基因文庫)，在DNase I的作用下隨機切割，得到的隨機片段經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)。在PCR循環(huán)過程中，隨機片段之間互為模板和引物進行擴增直到獲得全長的基因。這些重排產(chǎn)物的集合又稱嵌合文庫(突變文庫)。由于片段之間可借助互補序列而自由匹配，一個親本的突變可與另一親本的突變相結(jié)合，從而可以產(chǎn)生新的突變組合。進一步，再對嵌合文庫篩選，以期望最終獲得性能滿意的突變體。當DNA shuffling用于一組同源基因時，這種技術(shù)稱為“DNA家族改組”(DNA familyshuffling)。DNA家族改組是一項高效的體外進化技術(shù),該技術(shù)利用自然界中具有同源序列的基因家族如來自不同種屬的相同基因以及同一種屬的相關(guān)基因等進行改組，為蛋白質(zhì)定向進化和結(jié)構(gòu)一功能關(guān)系分析等研究提供了有效獲得突變文庫的方法。與單個基因的改組相比，DNA家族改組技術(shù)不僅可以顯著加速有益突變的累積，還易于實現(xiàn)目的蛋白多種特性的共進化。
[0007]DNA shuffling技術(shù)自誕生以來，已在基礎(chǔ)研究、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等各方面得到廣泛應(yīng)用，尤其是在酶的改良、藥物蛋白的優(yōu)化方面應(yīng)用成果顯著。大腸桿菌葡糖酸普酶基因改組后，篩選到的新基因表達的蛋白催化降解能力提高500倍；Chang等以多種人a -1NF基因為底物進行DNA shuffling,經(jīng)兩輪改組篩選后得到的大多數(shù)活性克隆的活性較野生型提高了 285000倍；因此，相信利用DNA family shuffling技術(shù)對鹽生植物來源的液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因進行改組定能顯示其強大的優(yōu)勢，創(chuàng)制出更強的新型耐鹽基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的在于獲得一種能編碼具有離子轉(zhuǎn)運活性的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的植物強耐鹽基因SseNHXl。
[0009]本發(fā)明的另一個目的在于提供上述基因編碼的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白SseNHXl，其離子轉(zhuǎn)運活性比野生型的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白更強。
[0010]本發(fā)明還提供了含有上述基因的重組載體。[0011]本發(fā)明的另一方面，還提供了含有上述重組載體的宿主細胞。
[0012]本發(fā)明的另一方面，還提供了重組載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因植物等方法，以應(yīng)用上訴基因和編碼蛋白培育耐鹽性更強的轉(zhuǎn)基因植物新品種。
[0013]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0014]一種植物強耐鹽基因SseNHXl，所述基因序列如SEQ ID NO:1所示。
[0015]上述植物強耐鹽基因SseNHXl編碼的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0016]含有上述基因的重組載體。
[0017]含有上述重組載體的宿主細胞。
[0018]上述植物強耐鹽基因SseNHXl在培育抗鹽植物方面的應(yīng)用，所述植物強耐鹽基因SseNHXl轉(zhuǎn)入植物中，培育出耐鹽性及生物學性狀得到改善的植物新品種。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0020](I)用于改組的模板基因SsNHXl和SeNHXl分別來源于堿蓬和鹽角草，耐鹽基因的耐鹽度起點高。通過2個不同來源的Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因進行DNA改組定向進化，大大增加了篩選到高度耐鹽基因(即正義突變子)的幾率。
[0021](2)采用鹽敏感型酵母突變體 AXT3(Aenal_4::HIS3Anhal::LEU2Anhxl::TRPD來進行改組后突變基因的高通量篩選，大大提高了篩選效率。
[0022](3)本發(fā)明將同一家族中的2個不同來源的Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因(NHXl)通過基因改組后獲得的高度耐鹽的基因(SseNHXl)遺傳轉(zhuǎn)化模式植物煙草，經(jīng)過鹽脅迫處理后能夠進一步提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性，為培育出更具耐鹽性的新遺傳材料提供了理論依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為SsNHXl和SeNHXl的DNA改組過程。
[0024]圖2為部分改組文庫的耐鹽篩選。其中箭頭所指的是含有強耐鹽改組基因SseNHXl的酵母菌落。
[0025]圖3為SseNHXl與SsNHXUSeNHXl的氨基酸序列比對。其中白色框標記為隨機突變的氨基酸；灰色陰影框標記為氨基酸替換情況。
[0026]圖4為改組獲得的SseNHXl基因與未改組SsNHXl、SeNHXl基因在酵母突變菌株AXT3中功能互補實驗比較，即在含有O、50、75、100和150mM NaCl的APGal平板上生長情況:其中I為含有PYES2質(zhì)粒的野生型W303，II為含有pYES2質(zhì)粒的缺陷型菌株AXT3，III為含有pYES2-SsNHXl重組質(zhì)粒的AXT3菌株，IV為含有pYES2_SeNHXl重組質(zhì)粒的AXT3菌株，V為含有pYES2-SseNHXl重組質(zhì)粒的AXT3菌株。
[0027]圖5為鹽脅迫I個月后野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草(分別轉(zhuǎn)SsNHXl、SeNHXl和SseNHXl基因)植株表型。
【具體實施方式】
[0028]下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0029]實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件以及手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。[0030]實施例1.堿蓬和鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆
[0031]用Trizol試劑從堿蓬和鹽角草植物葉片中抽提總RNA，以總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA為模板，參照對編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的野生型耐鹽基因SsNHXl (來源于堿蓬，其GenBank序列號:AY261806)和SeNHXl (來源于鹽角草，其GenBank序列號::AY131235)的cDNA序列設(shè)計以下引物(5’端分別包含BamHI和SalI酶切位點):
[0032]ssF (5，-CGCGGATCCATGTGGTCACAGTTAAGCTC-3，) SEQ ID NO: 3
[0033]ssR(5，-ACGCGTCGACTTATGTTCTCTGTGACAAATTAGTGG-3’ ) SEQ ID NO: 4
[0034]seF (5，~CGCGGATCCATGTTGTCACAATTGAGCTC~3，) SEQ ID NO: 5
[0035]seR(5，~ACGCGTCGACTGTTCTGTCTAGCAAATTGTC~3，) SEQ ID NO: 6
[0036]通過PCR擴增獲得堿蓬Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因SsNHXl和鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基 因SeNHXl，分別將其連接到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10，克隆得到SsNHXl和SeNHXl的序列，并通過測序來確定。
[0037]實施例2.SsNHXl、SeNHXl基因的DNA改組
[0038]I)改組模板的制備分別以pMD-18T_SsNHXl和pMD-18T_SeNHXl質(zhì)粒為模板，用TaqPlus DNA聚合酶分別對兩個基因進行PCR擴增，純化后作為DNA家族改組的模板。
[0039]2) DNaseI隨機酶切紫外吸收法測定純化后的DNA濃度，分別取含量為1.5 μ g的模板混合。取混合后的模板加入到50 μ L酶切反應(yīng)體系中。
[0040]首先用0.15Μ NaCl (Sigma)稀釋 DNaseI (N0.EN0525Fermentas, IOU/ μ I) 100 倍至濃度為0.1U/ μ Lo
[0041]DNaseI消化反應(yīng)體系:
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種植物強耐鹽基因SseNHXl，其特征是所述基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.權(quán)利要求1的植物強耐鹽基因SseNHXl編碼的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.含有權(quán)利要求1所述基因的重組載體。
4.含有權(quán)利要求3所述重組載體的宿主細胞。
5.權(quán)利要求1所述的植物強耐鹽基因SseNHXl在培育抗鹽植物方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/21GK103993020SQ201410252475
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月9日
【發(fā)明者】王罡, 季靜, 吳廣霞, 高海伶, 王昱蓉 申請人:天津大學