一種制備高純度蘿卜硫素的方法
【專利摘要】一種制備高純度蘿卜硫素的方法，具體涉及從蘿卜籽中提取蘿卜硫素的方法。本發(fā)明以風干蘿卜籽為原料，經(jīng)破碎、脫脂、水解、樹脂初分離、反滲透濃縮、制備分離及冷凍干燥，制備出純度高達98％以上的產(chǎn)品。本發(fā)明操作簡便，設備簡單，反應條件溫和，節(jié)約能源，生產(chǎn)成本低，便于推廣應用。對使用后的甲醇廢液進行回收處理，還對使用后的樹脂進行了再生處理，產(chǎn)生的雜質(zhì)還能再利用，因而生產(chǎn)安全、綠色無污染，是節(jié)能減排的生產(chǎn)方法。采用本發(fā)明方法制備出的蘿卜硫素產(chǎn)品，可廣泛應用于醫(yī)藥、保健品等行業(yè)中。
【專利說明】一種制備高純度蘿卜硫素的方法 一、

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蘿卜硫素分離制備的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及從蘿卜籽中提取蘿卜硫素的 方法。 二、

【背景技術(shù)】
[0002] 硫代葡萄糖苷是十字花科蔬菜中的一種芥子苷，在硫代葡萄糖苷酶或酸的催化 下，芥子苷水解，生成蘿卜硫素等異硫氰酸酯和葡萄糖?？茖W研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素的化學名 為1-異硫氰酸-4-甲磺?；⊥榛?-異硫氰酸-4-甲磺?；?(2-烯）丁烷，是迄今為止 蔬菜中發(fā)現(xiàn)的最強抗癌成分之一，它可誘導機體產(chǎn)生II型解毒酶，該酶能防止致癌物質(zhì)破 壞健康細胞內(nèi)的遺傳因子，所以，從十字花科蔬菜中分離純化1-異硫氰酸-4-甲磺?；?烷或1-異硫氰酸-4-甲磺?；?(2-烯）丁烷具有重要的科學價值和廣闊的市場前景。
[0003] 目前，從十字花科蔬菜中提取蘿卜硫素的方法有：①申請?zhí)枮?00910098197. 6、 名稱為"一種蘿卜硫素的提取方法"的發(fā)明專利，該專利公開的方法是：用干燥西蘭花種 子或新鮮西蘭花球為原料，粉碎加入水，調(diào)節(jié)PH4. 1?4. 5,加入粗芥子硫苷酸酶水解后冷 凍干燥成粉末；加入丙酮，浸提，過濾，將濾液真空濃縮成蘿卜硫素粗品；然后將其通過硅 膠柱層析，用乙酸乙酯和乙醇的混合液梯度洗脫，收集餾分，真空濃縮；用甲醇溶解，再經(jīng) 0. 2um微孔濾膜過濾后，用C18硅膠裝柱，采用甲醇水梯度洗脫，收集蘿卜硫素餾分，真空干 燥，得到蘿卜硫素。該方法存在的主要問題是：1.未對種子進行脫脂，由于油脂的阻擋，西 蘭花種子中的芥子苷和芥子硫苷酸酶難以有效接觸，導致蘿卜硫素的生成率低；2.未對提 取的芥子硫苷酸酶進行固定化，游離酶的半衰期短，易失活；3.使用的有機溶劑-丙酮致酶 蛋白變性能力強，導致芥子硫苷酸酶大量變性而失活。因此，該方法導致原料利用率低、蘿 卜硫素生成率低，丙酮回收率低而污染環(huán)境，生產(chǎn)成本高，缺乏競爭力。②《食品工業(yè)科技》 2012年第33卷第4期80?82頁刊登的論文"高效液相色譜法測定西蘭花中蘿卜硫素的 研究"，該論文公開的提取蘿卜硫素的方法是：西蘭花種子在無光照條件下發(fā)芽48h，冷凍干 燥成粉末，加入正己烷脫脂并揮發(fā)脫除溶劑后，在加入去離子水混合均勻，水浴處理2h，再 加入氯化鈉并用等體積乙酸乙酯萃取3次，收集、合并萃取液，用旋蒸器減壓蒸餾，除去乙 酸乙酯，直至殘留液呈黃油狀液體時止。接著用10%的乙腈溶解殘留液，然后用0. 45um的 微孔濾膜過濾，最后用旋蒸器減壓蒸餾，除去濾過液中的乙腈和水，獲得蘿卜硫素。該方法 存在的主要問題是：1.水解時未調(diào)節(jié)到硫代葡萄糖苷酶所需的最佳pH值，導致硫代葡萄糖 苷酶的活力低，蘿卜硫素產(chǎn)率低；2.使用有機溶劑乙酸乙酯和乙腈，兩種溶劑均易揮發(fā)，異 味重，有毒性，空氣污染嚴重；因此，該方法生產(chǎn)的蘿卜硫素成本也高，同樣缺乏競爭力。 三、


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有制備蘿卜硫素的方法的不足之處，提供一種制備高純度 蘿卜硫素的新方法，該方法具有充分利用資源，蘿卜硫素生成率高、操作簡單、溶劑可反復 回收利用、產(chǎn)品純度高達98%以上，綠色無污染等特點。
[0005] 本發(fā)明的原理是：①蘿卜籽油脂含量高達45%，超臨界C02在適當條件下具有與 油脂類似的密度，依據(jù)相似相溶原理，可溶解蘿卜籽中的油脂，因此用超臨界C0 2可提取蘿 卜籽中的油脂，獲得脫脂蘿卜籽；②蘿卜籽中含有硫代葡萄糖苷及硫代葡萄糖苷酶，它們在 細胞中處于分隔狀態(tài)，當細胞被破壞時，硫代葡萄糖苷酶和硫代葡萄糖苷接觸，即催化硫代 葡萄糖苷水解生成蘿卜硫素等異硫氰酸酯和葡萄糖；③酶被底物飽和方能發(fā)揮最大催化效 率，向脫脂蘿卜籽水解體系中加入硫代葡萄糖苷，使游離硫代葡萄糖苷酶被飽和而發(fā)揮最 大催化效率，顯著增加蘿卜硫素的生成量；④1-異硫氰酸-4-甲磺?；?(2-烯）丁烷的烯 鍵既可加氫還原成1-異硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷，也可氧化甚至斷鍵，且前者的生物學活 性比后者強1?2倍，因此獲得前者比后者更具價值。將脫脂蘿卜籽水解體系進行真空脫 氣并充入氮氣，可顯著降低其中的氧氣，將顯著降低1-異硫氰酸-4-甲磺?；?(2-烯）丁 烷的氧化；⑤1-異硫氰酸-4-甲磺?；?(2-烯）丁烷的2-烯基丁烷基為非極性，可與非 極性樹脂形成疏水相互作用，可用非極性吸附樹脂對其進行吸附，將其與極性雜質(zhì)分離；⑦ 除去極性雜質(zhì)的1-異硫氰酸-4-甲磺?；?(2-烯）丁烷經(jīng)反滲透濃縮，除去甲醇后再進 入制備型液相色譜，由于該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其它非極性雜質(zhì)的差異，它們在反相C18硅膠上 的吸附力不同，因此可用適當?shù)南疵撘哼M行洗脫，由于制備型液相色譜的塔板數(shù)極高，分離 效率高，因此可將其它雜質(zhì)一一分離，制備出高純度的蘿卜硫素，即1-異硫氰酸-4-甲磺酰 基-(2-烯）丁烷；⑧將制備出的高純度1-異硫氰酸-4-甲磺?；?(2-烯）丁烷進行反滲 透濃縮，除去其中的甲醇和部分水，即可獲得濃縮液，最后將該濃縮液進行冷凍干燥，除去 水分，就制備出純度高達98%以上的蘿卜硫素，S卩1-異硫氰酸-4-甲磺?；?(2-烯）丁 燒。
[0006] 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：一種制備高純度蘿卜硫素的方法，以風干蘿卜籽為 原料，經(jīng)破碎、脫脂、水解、樹脂初分離、反滲透濃縮、制備分離及冷凍干燥，制備出純度高達 98%以上的蘿卜硫素，S卩1-異硫氰酸-4-甲磺?；?(2-烯）丁烷。其具體的工藝步驟如 下：
[0007] 1.制備脫脂蘿卜籽粉
[0008] 取水分含量低于4%的風干蘿卜籽，先用破碎機破碎，再用20?60目的不銹鋼篩 網(wǎng)進行篩分，分別收集過篩者和未過篩者。對于未過篩的蘿卜籽粉，返回破碎機進行再次破 碎；對于過篩的蘿卜籽粉，置于超臨界二氧化碳的萃取器的萃取釜中，在溫度為30?35°C、 壓力25?30MPa的條件下進行萃取lh?2h，然后將荷載蘿卜籽油脂的超臨界二氧化碳泵 至分離釜中，降低壓力至3?5MPa，使超臨界二氧化碳氣化，與蘿卜籽油脂分離。分別收集 氣化的二氧化碳、脫二氧化碳蘿卜籽油脂粗品和脫脂蘿卜籽粉，對收集的氣化二氧化碳，再 次冷凍至0?5°C并再次加壓至25?30Mpa，可再次用于提取蘿卜籽油脂；對于收集的脫二 氧化碳蘿卜籽油脂粗品，用于制備精制蘿卜籽油；對于收集的脫脂蘿卜籽粉，分成兩部分， 一部分用于制備硫代葡萄糖苷提取液，另一部分用于制備蘿卜硫素粗提液。
[0009] 2.制備硫代葡萄糖苷提取液
[0010] 第1步完成后，將第1步收集的部分脫脂蘿卜籽粉，分散于甲醇中，在70?75°C 的溫度下進行第一次提取40?60min，脫脂蘿卜籽粉質(zhì)量（g)與甲醇體積（mL)之比為 1 : 6?9。第一次提取完成后進行抽濾，分別收集第一次濾過液和濾渣。對于收集的第一 次濾渣，投入到甲醇中進行第二次提取，提取條件與第一次相同。第二次提取完成后進行抽 濾，分別收集第二次濾過液和濾渣。對于收集的第二次濾渣，送入脫溶劑釜中，進行脫甲醇 處理后可用作家畜飼料添加劑；對于收集的第二次提取液，與收集的第一次提取液合并后 進行真空濃縮，直至濃縮液成膏狀時止，所用濃縮真空度為0. 06?0. 09MPa、溫度為40? 45°C。濃縮完成后，分別收集膏狀濃縮物和甲醇，對于收集的甲醇，返回甲醇貯罐，用于再次 提取硫代葡萄糖苷；對于收集的膏狀濃縮物，用蒸餾水溶解，膏狀濃縮物質(zhì)量（g)與蒸餾水 體積（mL)之比為1 : 3?6。溶解完成后，將溶解液置于萃取荃中，加入乙酸乙酯進行萃取 處理10?20min,溶解液與乙酸乙酯體積之比為lmL : 1?6mL。萃取完成后，分別收集萃 取相和萃余相，對收集的萃取相，進行精餾回收乙酸乙酯；對收集的萃余相，即為硫代葡萄 糖苷提取液，用于制備蘿卜硫素提取液。
[0011] 3.制備蘿卜硫素粗提液
[0012] 第2步完成后，先將第1步收集的另一部分脫脂蘿卜籽粉分散于pH5. 0?6. 0的 檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液中，攪拌均勻，脫脂蘿卜籽粉質(zhì)量（g)與PH5. 0?6. 0的檸檬 酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液體積（mL)之比為1 : 6?12,再加入第2步收集的硫代葡萄糖苷 提取液，加入的硫代葡萄糖苷提取液體積（mL)與脫脂蘿卜籽粉質(zhì)量（g)之比為1 : 10? 20,混合均勻后就獲得制備蘿卜硫素粗提液酶水解體系。然后在25?35°C、40?120r/min 的攪拌速度下避光水解5?10h。水解完成后，進行過濾，分別收集濾過液和濾渣。對收集的 濾渣，分散于溫度為25?35°C的蒸餾水中，蒸餾水體積（mL)與濾渣質(zhì)量（g)之比為10? 20 : 1，在40?120r/min的攪拌速度下避光洗滌20?30min，接著進行過濾，分別收集洗 滌濾過液和濾渣。對收集的洗滌濾渣，干燥后用做家畜飼料添加劑；對收集的洗滌液，與收 集的水解濾過液合并，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2?4后離心，離心機轉(zhuǎn)速為10000?16000r/ min。分別收集離心清液和離心沉淀，對收集的離心沉淀，干燥后做飼料添加劑；對收集的離 心清液，泵入脫氣罐中，在真空度為〇. 06?0. 09MPa、溫度為10?35°C的條件下，保持20? 40min，脫去液體中的氧氣。然后充入0. 1?0. 3MPa的高純度氮氣，保持20?40min，即制 備出蘿卜硫素粗提液，用于制備初步純化蘿卜硫素濃縮液。
[0013] 4.制備脫氧充氮甲醇-水洗脫液
[0014] 分別配制甲醇體積濃度為5?15%、60?80%的甲醇-水溶液，再分別移入脫氣 罐中，在真空度為0. 06?0. 09MPa、溫度為10?35°C的條件下，保持20?40min，脫去其 中的氧氣。然后充入〇. 1?〇. 3MPa的高純度氮氣，保持20?40min，即制備出脫氧充氮甲 醇-水洗脫液，用于制備蘿卜硫素初步純化濃縮液。
[0015] 5.制備蘿卜硫素初步純化濃縮液
[0016] 第3步完成之后，將第3步制備出的蘿卜硫素粗提液泵入活化SP850或聚酰胺吸 附樹脂柱，吸附其中的蘿卜硫素，蘿卜硫素粗提液體積（mL)與SP850或聚酰胺吸附樹脂的 體積（mL)比為1 : 15?30,以流速為5?10BV/h通過SP850或聚酰胺吸附樹脂柱。吸附 完成后收集荷載蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱和脫附蘿卜硫素的過柱溶液，對于 收集的脫附蘿卜硫素的過柱溶液，進行生化處理，達標后排放；對于收集的荷載蘿卜硫素的 SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，先用2BV、甲醇體積濃度為5?15%的脫氧充氮甲醇-水洗脫 液、以3?6BV/h的流速洗滌夾雜于樹脂間的雜質(zhì)，分別收集甲醇洗滌液和洗去樹脂間雜質(zhì) 的荷載蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，對收集的甲醇洗滌液，減壓蒸餾回收甲醇 后進行生化處理，達標后排放；回收的甲醇可用于再次配制甲醇積濃度為5?15%或60? 80%的脫氧充氮甲醇-水洗脫液。對收集的洗去樹脂間雜質(zhì)的荷載蘿卜硫素的SP850或聚 酰胺吸附樹脂柱，泵入甲醇積濃度為60?80%的脫氧充氮甲醇-水洗脫液以3?6BV/h的 流速洗脫被吸附的蘿卜硫素，直至甲醇體積濃度為60?80%的脫氧充氮甲醇-水洗脫液的 耗量達到SP850或聚酰胺吸附樹脂柱體積（mL)的5?10BV時止。分別收集荷載蘿卜硫素的 洗脫液和脫附蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，對于收集的脫附蘿卜硫素的SP850 或聚酰胺吸附樹脂柱，進行再生處理；對于收集的荷載蘿卜硫素的甲醇洗脫液，泵入反滲透 器中，在壓力低于0. 4MPa下進行反滲透濃縮，直至濃縮液中蘿卜硫素的質(zhì)量濃度達到20? 30%時為止。分別收集反滲透截留液和濾過液，對于收集的反滲透截留液，泵入真空濃縮機 中，在真空度為0. 06?0. 09MPa、溫度為30?45°C的條件下，進行真空濃縮，直至濃縮液無 甲醇味時為止，就制備出蘿卜硫素初步純化濃縮液，用于制備高純度蘿卜硫素凍干物。對于 收集的反滲透濾過液，進行減壓蒸餾回收甲醇后進行生化處理，達標后排放；對于回收的甲 醇，可用于再次配制甲醇體積濃度為5?15%或60?80%的脫氧充氮甲醇-水洗脫液。
[0017] 6.制備高純度蘿卜硫素凍干物
[0018] 第5步完成后，先將第5步制備的蘿卜硫素初步純化濃縮液通過0. 22um微孔過濾 膜過濾，再泵入以反相C18硅膠為填料的制備型液相色譜柱中，蘿卜硫素初步純化濃縮液 體積（mL)與C18硅膠填料質(zhì)量（g)之比為1 : 50?80。接著控制色譜條件進行制備分 離蘿卜硫素，具體的色譜條件為：檢測波長為245nm，柱溫為25°C，流速為1. OmL · min-1 ;A 組分為甲醇，B組分為超純水；梯度洗脫程序為：在Omin?15min區(qū)間，流動相中的A組分 由5%上升至25%，B組分由95%下降至75%;在15min?75min區(qū)間，流動相中的A組分 由25%上升至65%，B組分由75%下降至35%。收集37?41min區(qū)間的洗脫液，在35? 45°C下進行真空濃縮，直至濃縮液中蘿卜硫素質(zhì)量濃度達到30?50%時，就制備出蘿卜硫 素濃縮液。將該蘿卜硫素濃縮液置于凍干機中，在25?45Pa真空度、-50?-60°C溫度下， 進行冷凍干燥24?36h，就制備出純度為98%以上的蘿卜硫素。經(jīng)核磁共振、液質(zhì)聯(lián)機和 旋光儀分析鑒定，所制備出的蘿卜硫素的化學結(jié)構(gòu)為1-異硫氰酸-4-甲磺?；?(2-烯） 丁烷。
[0019] 7.制備再生樹脂柱
[0020] 向第5步收集的脫附蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱泵入3?4BV的無水 甲醇，以2?5BV/h的流速洗脫樹脂吸附的雜質(zhì)，分別收集洗脫液和脫附雜質(zhì)的SP850或聚 酰胺吸附樹脂柱。對收集的甲醇洗脫液，含有異硫氰酸酯類物質(zhì)，減壓蒸餾回收甲醇后分別 收集甲醇和濃縮液，對于收集的甲醇，進行脫水處理，制備出無水甲醇，可再次用于洗脫脫 附蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，制備再生樹脂；對于收集的濃縮液，用于配制異 硫氰酸酯類生物農(nóng)藥。對于收集的洗脫雜質(zhì)的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，用1?2BV的 蒸餾水以2?5BV/h的流速洗滌，分別收集經(jīng)該蒸餾水洗滌的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱 和洗滌液，對收集的蒸餾水洗滌的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，即為再生樹脂柱，可再次用 于純化蘿卜硫素粗提液；對于收集的洗滌液，可用于配制脫氧充氮甲醇-水洗脫液。
[0021] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案后，主要有以下效果：
[0022] 1.本發(fā)明方法在生產(chǎn)過程中使用破碎、脫脂、水解、樹脂初分離、反滲透濃縮、制備 分離及冷凍干燥等簡單工藝，操作簡便，設備簡單，反應條件溫和，節(jié)約能源，生產(chǎn)成本低， 便于推廣應用。
[0023] 2.本發(fā)明方法在生產(chǎn)過程中，先對蘿卜籽粉進行超臨界二氧化碳脫脂后再水解， 硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷酶可以得到充分而有效的接觸，從而產(chǎn)物的生成率大大提 高，而且在水解時加入了底物硫代葡萄糖苷，采用脫氧充氮甲醇-水作洗脫液，進一步提高 了產(chǎn)物的生成率。
[0024] 3.本發(fā)明方法在生產(chǎn)過程中，通過樹脂進行初分離、反滲透濃縮、液相制備及真空 濃縮的純化步驟，其中由于制備型液相色譜的塔板數(shù)極高，每米的塔板數(shù)在20000以上，分 離效率高，因此制備出的產(chǎn)物純度極高，達98%以上。
[0025] 4.本發(fā)明在生產(chǎn)過程中，使用超臨界二氧化碳對蘿卜籽粉末脫脂，對使用后的甲 醇廢液進行回收處理，還對使用后的樹脂進行了再生處理，這使得生產(chǎn)過程安全、綠色無污 染。
[0026] 本發(fā)明方法是節(jié)能減排、安全生產(chǎn)且成本低，便于推廣應用的理想的方法。采用本 發(fā)明方法制備出的蘿卜硫素，即1-異硫氰酸-4-甲磺?；?(2-烯）丁烷產(chǎn)品，可廣泛應用 于醫(yī)藥、保健品行業(yè)中，有防癌抗癌等功能。 四、【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合【具體實施方式】，進一步說明本發(fā)明。
[0028] 實施例1
[0029] -種制備高純度蘿卜硫素的方法，具體方法步驟如下：
[0030] 1.制備脫脂蘿卜籽粉
[0031] 取水分含量低于4%的風干蘿卜籽，先用破碎機破碎，再用20目的不銹鋼篩網(wǎng) 進行篩分，分別收集過篩者和未過篩者。對于未過篩的蘿卜籽粉，返回破碎機進行再次破 碎；對于過篩的蘿卜籽粉，置于超臨界二氧化碳的萃取器的萃取釜中，在溫度為30°C、壓力 25MPa的條件下進行萃取lh，然后將荷載蘿卜籽油脂的超臨界二氧化碳泵至分離釜中，降 低壓力至3MPa，使超臨界二氧化碳氣化，與蘿卜籽油脂分離。分別收集氣化的二氧化碳、脫 二氧化碳蘿卜籽油脂粗品和脫脂蘿卜籽粉，對收集的氣化二氧化碳，再次冷凍至〇°C并再次 加壓至25Mpa，可再次用于提取蘿卜籽油脂；對于收集的脫二氧化碳蘿卜籽油脂粗品，用于 制備精制蘿卜籽油；對于收集的脫脂蘿卜籽粉，分成兩部分，一部分用于制備硫代葡萄糖苷 提取液，另一部分用于制備蘿卜硫素粗提液。
[0032] 2.制備硫代葡萄糖苷提取液
[0033] 第1步完成后，將第1步收集的部分脫脂蘿卜籽粉，分散于甲醇中，在70°C的溫度 下進行第一次提取40min，脫脂蘿卜籽粉質(zhì)量（g)與甲醇體積（mL)之比為1 : 6。第一次 提取完成后進行抽濾，分別收集第一次濾過液和濾渣。對于收集的第一次濾渣，投入到甲醇 中進行第二次提取，提取條件與第一次相同。第二次提取完成后進行抽濾，分別收集第二次 濾過液和濾渣。對于收集的第二次濾渣，送入脫溶劑釜中，進行脫甲醇處理后可用作家畜飼 料添加劑；對于收集的第二次提取液，與收集的第一次提取液合并后進行真空濃縮，直至濃 縮液成膏狀時止，所用濃縮真空度為〇. 〇6MPa、溫度為40°C。濃縮完成后，分別收集膏狀濃 縮物和甲醇，對于收集的甲醇，返回甲醇貯罐，用于再次提取硫代葡萄糖苷；對于收集的膏 狀濃縮物，用蒸餾水溶解，膏狀濃縮物質(zhì)量（g)與蒸餾水體積（mL)之比為1 : 3。溶解完成 后，將溶解液置于萃取釜中，加入乙酸乙酯進行萃取處理l〇min，溶解液與乙酸乙酯體積之 比為lmL : lmL。萃取完成后，分別收集萃取相和萃余相，對收集的萃取相，進行精餾回收乙 酸乙酯；對收集的萃余相，即為硫代葡萄糖苷提取液，用于制備蘿卜硫素提取液。
[0034] 3.制備蘿卜硫素粗提液
[0035] 第2步完成后，先將第1步收集的另一部分脫脂蘿卜籽粉分散于pH5. 0的檸檬 酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液中，攪拌均勻，脫脂蘿卜籽粉質(zhì)量（g)與PH5.0?6.0的檸檬 酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液體積（mL)之比為1 : 6,再加入第2步收集的硫代葡萄糖苷提取 液，加入的硫代葡萄糖苷提取液體積（mL)與脫脂蘿卜籽粉質(zhì)量（g)之比為1 : 10,混合均 勻后就獲得制備蘿卜硫素粗提液酶水解體系。然后在25°C、40r/min的攪拌速度下避光水 解l〇h。水解完成后，進行過濾，分別收集濾過液和濾渣。對收集的濾渣，分散于溫度為25°C 的蒸餾水中，蒸餾水體積（mL)與濾渣質(zhì)量（g)之比為10 : 1，在40r/min的攪拌速度下避 光洗滌30min，接著進行過濾，分別收集洗滌濾過液和濾渣。對收集的洗滌濾渣，干燥后用 做家畜飼料添加劑；對收集的洗滌液，與收集的水解濾過液合并，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2后離 心，離心機轉(zhuǎn)速為l〇〇〇〇r/min。分別收集離心清液和離心沉淀，對收集的離心沉淀，干燥后 做飼料添加劑；對收集的離心清液，泵入脫氣罐中，在真空度為〇. 〇6MPa、溫度為10°C的條 件下，保持20min，脫去液體中的氧氣。然后充入0. 12MPa的高純度氮氣，保持20min，即制 備出蘿卜硫素粗提液，用于制備初步純化蘿卜硫素濃縮液。
[0036] 4制備脫氧充氮甲醇-水洗脫液
[0037] 分別配制甲醇體積濃度為5 %、60 %的甲醇-水溶液，再分別移入脫氣罐中，在真 空度為〇. 〇6MPa、溫度為10°C的條件下，保持20min，脫去其中的氧氣。然后充入0. 12MPa的 高純度氮氣，保持20min，即制備出脫氧充氮甲醇-水洗脫液，用于制備蘿卜硫素初步純化 濃縮液。
[0038] 5.制備蘿卜硫素初步純化濃縮液
[0039] 第3步完成之后，將第3步制備出的蘿卜硫素粗提液泵入活化SP850吸附樹脂 柱，吸附其中的蘿卜硫素，蘿卜硫素粗提液體積（mL)與SP850吸附樹脂的體積（mL)比為 1 : 15,以流速為5BV/h通過SP850吸附樹脂柱。吸附完成后收集荷載蘿卜硫素的SP850 吸附樹脂柱和脫附蘿卜硫素的過柱溶液，對于收集的脫附蘿卜硫素的過柱溶液，進行生化 處理，達標后排放；對于收集的荷載蘿卜硫素的SP850吸附樹脂柱，先用2BV、甲醇體積濃 度為5%的脫氧充氮甲醇-水洗脫液、以3BV/h的流速洗滌夾雜于樹脂間的雜質(zhì)，分別收 集甲醇洗滌液和洗去樹脂間雜質(zhì)的荷載蘿卜硫素的SP850吸附樹脂柱，對收集的甲醇洗滌 液，減壓蒸餾回收甲醇后進行生化處理，達標后排放；回收的甲醇可用于再次配制甲醇積濃 度為5%或60%的脫氧充氮甲醇-水洗脫液。對收集的洗去樹脂間雜質(zhì)的荷載蘿卜硫素 的SP850吸附樹脂柱，泵入甲醇積濃度為60%的脫氧充氮甲醇-水洗脫液以3BV/h的流速 洗脫被吸附的蘿卜硫素，直至甲醇體積濃度為60%的脫氧充氮甲醇-水洗脫液的耗量達到 SP850吸附樹脂柱體積（mL)的5BV時止。分別收集荷載蘿卜硫素的洗脫液和脫附蘿卜硫 素的SP850吸附樹脂柱，對于收集的脫附蘿卜硫素的SP850吸附樹脂柱，進行再生處理；對 于收集的荷載蘿卜硫素的甲醇洗脫液，泵入反滲透器中，在壓力低于〇. 4MPa下進行反滲透 濃縮，直至濃縮液中蘿卜硫素的質(zhì)量濃度達到20%時為止。分別收集反滲透截留液和濾過 液，對于收集的反滲透截留液，泵入真空濃縮機中，在真空度為〇. 〇6MPa、溫度為30°C的條 件下，進行真空濃縮，直至濃縮液無甲醇味時為止，就制備出蘿卜硫素初步純化濃縮液，用 于制備高純度蘿卜硫素凍干物。對于收集的反滲透濾過液，進行減壓蒸餾回收甲醇后進行 生化處理，達標后排放；對于回收的甲醇，可用于再次配制甲醇體積濃度為5%或60%的脫 氧充氮甲醇-水洗脫液。
[0040] 6.制備高純度蘿卜硫素凍干物
[0041] 第5步完成后，先將第5步制備的蘿卜硫素初步純化濃縮液通過0. 22um微孔過濾 膜過濾，再泵入以反相C18硅膠為填料的制備型液相色譜柱中，蘿卜硫素初步純化濃縮液 體積（mL)與C18硅膠填料質(zhì)量（g)之比為1 : 50。接著控制色譜條件進行制備分離蘿卜 硫素，具體的色譜條件為：檢測波長為245nm，柱溫為25°C，流速為1. OmL · min-1 ;A組分為 甲醇，B組分為超純水；梯度洗脫程序為：在Omin?15min區(qū)間，流動相中的A組分由5%上 升至25%，8組分由95%下降至75%;在1511^11?751^11區(qū)間，流動相中的六組分由25% 上升至65%，B組分由75%下降至35%。收集37?41min區(qū)間的洗脫液，在35°C下進行 真空濃縮，直至濃縮液中蘿卜硫素質(zhì)量濃度達到30%時，就制備出蘿卜硫素濃縮液。將該蘿 卜硫素濃縮液置于凍干機中，在25Pa真空度、-60°C溫度下，進行冷凍干燥24h，就制備出純 度為98%以上的蘿卜硫素。經(jīng)核磁共振、液質(zhì)聯(lián)機和旋光儀分析鑒定，所制備出的蘿卜硫素 的化學結(jié)構(gòu)為1-異硫氰酸-4-甲磺?；?(2-烯）丁烷。
[0042] 7.制備再生樹脂柱
[0043] 向第5步收集的脫附蘿卜硫素的SP850吸附樹脂柱泵入3BV的無水甲醇，以2BV/ h的流速洗脫樹脂吸附的雜質(zhì)，分別收集洗脫液和脫附雜質(zhì)的SP850吸附樹脂柱。對收集的 甲醇洗脫液，含有異硫氰酸酯類物質(zhì)，減壓蒸餾回收甲醇后分別收集甲醇和濃縮液，對于收 集的甲醇，進行脫水處理，制備出無水甲醇，可再次用于洗脫脫附蘿卜硫素的SP850吸附樹 脂柱，制備再生樹脂；對于收集的濃縮液，用于配制異硫氰酸酯類生物農(nóng)藥。對于收集的洗 脫雜質(zhì)的SP850吸附樹脂柱，用1BV的蒸餾水以2BV/h的流速洗滌，分別收集經(jīng)該蒸餾水洗 滌的SP850吸附樹脂柱和洗滌液，對收集的蒸餾水洗滌的SP850吸附樹脂柱，即為再生樹脂 柱，可再次用于純化蘿卜硫素粗提液；對于收集的洗滌液，可用于配制脫氧充氮甲醇-水洗 脫液。
[0044] 實施例2
[0045] -種制備高純度蘿卜硫素的方法，具體方法步驟如下：
[0046] 1.制備脫脂蘿卜籽粉
[0047] 同實施例1，其中：用40目的不銹鋼篩網(wǎng)進行篩分破碎后的蘿卜籽。在溫度為 33°C、壓力28MPa的條件下進行萃取1. 5h。降低壓力至4MPa，使超臨界二氧化碳氣化，與蘿 卜籽油脂分離。對收集的氣化二氧化碳，再次冷凍至3°C并再次加壓至28Mpa。
[0048] 2.制備硫代葡萄糖苷提取液
[0049] 同實施例1，其中：在73°C的溫度下進行第一次提取50min，脫脂蘿卜籽粉質(zhì)量（g) 與甲醇體積（mL)之比為1 : 7。濃縮真空度為0. 08MPa、溫度為43°C。膏狀濃縮物質(zhì)量（g) 與蒸餾水體積（mL)之比為1 : 5。乙酸乙酯進行萃取處理15min，溶解液與乙酸乙酯體積 之比為lmL : 5mL。
[0050] 3.制備蘿卜硫素粗提液
[0051] 同實施例1，其中：脫脂蘿卜籽粉分散于PH5.5的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液 中，脫脂蘿卜籽粉質(zhì)量（g)與PH5. 5的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液體積（mL)之比為 1 : 9。硫代葡萄糖苷提取液體積（mL)與脫脂蘿卜籽粉質(zhì)量（g)之比為1 : 15。在30°C、 80r/min的攪拌速度下避光水解7h。對收集的濾渣，分散于溫度為30°C的蒸餾水中，蒸餾水 體積（mL)與濾漁質(zhì)量（g)之比為15 : 1，在80r/min的攪拌速度下避光洗漆25min。對收集 的洗滌液，與收集的水解濾過液合并，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至3后離心，離心機轉(zhuǎn)速為13000r/ min。對收集的離心清液，泵入脫氣罐中，在真空度為0. 07MPa、溫度為25°C的條件下，保持 30min。然后充入0. 2MPa的高純度氮氣，保持30min。
[0052] 4.制備脫氧充氮甲醇-水洗脫液
[0053] 同實施例1，其中：分別配制甲醇體積濃度為的甲醇-水溶液，再分別移 入脫氣罐中，在真空度為〇. 〇8MPa、溫度為25°C的條件下，保持30min。然后充入0. 2MPa的 高純度氮氣，保持30min。
[0054] 5.制備蘿卜硫素初步純化濃縮液
[0055] 同實施例1，其中：將第3步制備出的蘿卜硫素粗提液泵入活化聚酰胺吸附樹脂 柱，蘿卜硫素粗提液體積（mL)與聚酰胺吸附樹脂的體積（mL)比為1 : 20,以流速為7BV/h 通過聚酰胺吸附樹脂柱。對于收集的荷載蘿卜硫素的聚酰胺吸附樹脂柱，先用2BV、甲醇體 積濃度為10%的脫氧充氮甲醇-水洗脫液、以4BV/h的流速洗滌夾雜于樹脂間的雜質(zhì)，對收 集的洗去樹脂間雜質(zhì)的荷載蘿卜硫素的聚酰胺吸附樹脂柱，泵入甲醇積濃度為70%的脫氧 充氮甲醇-水洗脫液以4BV/h的流速洗脫被吸附的蘿卜硫素，直至甲醇體積濃度為70%的 脫氧充氮甲醇-水洗脫液的耗量達到聚酰胺吸附樹脂柱體積（mL)的7BV時止。對于收集 的荷載蘿卜硫素的甲醇洗脫液，反滲透濃縮至濃縮液中蘿卜硫素的質(zhì)量濃度達到25%時為 止。反滲透截留液，泵入真空濃縮機中，在真空度為〇. 〇7MPa、溫度為40°C的條件下，進行真 空濃縮。
[0056] 6.制備高純度蘿卜硫素凍干物
[0057] 同實施例1，其中：蘿卜硫素初步純化濃縮液體積（mL)與C18硅膠填料質(zhì)量（g)之 比為1 : 65。對收集37?41min區(qū)間的洗脫液，在40°C下進行真空濃縮，直至濃縮液中蘿 卜硫素質(zhì)量濃度達到50%時。將該蘿卜硫素濃縮液置于凍干機中，在真空度35Pa、-55°C溫 度下，進行冷凍干燥30h。
[0058] 7.制備再生樹脂柱
[0059] 同實施例1，向第5步收集的脫附蘿卜硫素的聚酰胺吸附樹脂柱泵入3. 5BV的無水 甲醇，以3BV/h的流速洗脫樹脂吸附的雜質(zhì)，對于收集的洗脫雜質(zhì)的聚酰胺吸附樹脂柱，用 1. 5BV的蒸餾水以3BV/h的流速洗滌。
[0060] 實施例3
[0061] 一種制備高純度蘿卜硫素的方法，具體方法步驟如下：
[0062] 1.制備脫脂蘿卜籽粉
[0063] 同實施例1，其中：用60目的不銹鋼篩網(wǎng)進行篩分破碎后的蘿卜籽。在溫度為 35°C、壓力30MPa的條件下進行萃取2h。降低壓力至5MPa，使超臨界二氧化碳氣化，與蘿卜 籽油脂分離。對收集的氣化二氧化碳，再次冷凍至5°C并再次加壓至30Mpa。
[0064] 2.制備硫代葡萄糖苷提取液
[〇〇65] 同實施例1，其中：在75°C的溫度下進行第一次提取60min，脫脂蘿卜籽粉質(zhì)量（g) 與甲醇體積（mL)之比為1 : 9。濃縮真空度為0.09MPa、溫度為45°C。膏狀濃縮物質(zhì)量（g)
【權(quán)利要求】
1. 一種制備高純度蘿卜硫素的方法，其特征在于具體方法步驟如下： (1) .制備脫脂蘿卜籽粉 取水分含量低于4%的風干蘿卜籽，先用破碎機破碎，再用20?60目的不銹鋼篩網(wǎng)進 行篩分，分別收集過篩者和未過篩者，對于未過篩的蘿卜籽粉，返回破碎機進行再次破碎， 對于過篩的蘿卜籽粉，置于超臨界二氧化碳的萃取器的萃取釜中，在溫度為30?35°C、壓 力25?30MPa的條件下進行萃取lh?2h，然后將荷載蘿卜籽油脂的超臨界二氧化碳泵至 分離釜中，降低壓力至3?5MPa，使超臨界二氧化碳氣化，與蘿卜籽油脂分離，分別收集氣 化的二氧化碳、脫二氧化碳蘿卜籽油脂粗品和脫脂蘿卜籽粉，對收集的氣化二氧化碳，再次 冷凍至0?5°C并再次加壓至25?30Mpa ; (2) .制備硫代葡萄糖苷提取液 第（1)步完成后，將第（1)步收集的部分脫脂蘿卜籽粉，分散于甲醇中，在70?75°C的 溫度下進行第一次提取40?60min，脫脂蘿卜籽粉質(zhì)量與甲醇體積之比為lg : 6?9mL， 第一次提取完成后進行抽濾，分別收集第一次濾過液和濾渣，對于收集的第一次濾渣，投入 到甲醇中進行第二次提取，提取條件與第一次相同，第二次提取完成后進行抽濾，分別收集 第二次濾過液和濾渣，對于收集的第二次濾渣，送入脫溶劑釜中，進行脫甲醇處理，對于收 集的第二次提取液，與收集的第一次提取液合并后進行真空濃縮，直至濃縮液成膏狀時止， 所用濃縮真空度為〇. 06?0. 09MPa、溫度為40?45°C，濃縮完成后，分別收集膏狀濃縮物 和甲醇，對于收集的甲醇，返回甲醇貯罐，用于再次提取硫代葡萄糖苷，對于收集的膏狀濃 縮物，用蒸餾水溶解，膏狀濃縮物質(zhì)量與蒸餾水體積之比為lg : 3?6mL，溶解完成后，將溶 解液置于萃取釜中，加入乙酸乙酯進行萃取處理10?20min，溶解液與乙酸乙酯體積之比 為lmL : 1?6mL，萃取完成后，分別收集萃取相和萃余相，對收集的萃取相，進行精餾回收 乙酸乙酯； (3) .制備蘿卜硫素粗提液 第（2)步完成后，先將第（1)步收集的另一部分脫脂蘿卜籽粉分散于pH5.0?6.0的檸 檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液中，攪拌均勻，脫脂蘿卜籽粉質(zhì)量與PH5. 0?6. 0的檸檬酸-檸 檬酸三鈉緩沖溶液體積之比為lg : 6?12mL，再加入第2步收集的硫代葡萄糖苷提取液， 加入的硫代葡萄糖苷提取液體積與脫脂蘿卜籽粉質(zhì)量之比為lmL : 10?20g，混合均勻 后就獲得制備蘿卜硫素粗提液酶水解體系，然后在25?35°C、40?120r/min的攪拌速度 下避光水解5?10h，水解完成后，進行過濾，分別收集濾過液和濾渣，對收集的濾渣，分散 于溫度為25?35°C的蒸餾水中，蒸餾水體積與濾渣質(zhì)量之比為10?20mL : lg，在40? 120r/min的攪拌速度下避光洗漆20?30min，接著進行過濾，分別收集洗漆濾過液和濾漁， 對收集的洗滌液，與收集的水解濾過液合并，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2?4后離心，離心機轉(zhuǎn) 速為10000?16000r/min，分別收集離心清液和離心沉淀，對收集的離心清液，泵入脫氣罐 中，在真空度為0. 06?0. 09MPa、溫度為10?35°C的條件下，保持20?40min，脫去液體中 的氧氣，然后充入〇. 1?〇. 3MPa的高純度氮氣，保持20?40min，即制備出蘿卜硫素粗提 液； (4) .制備脫氧充氮甲醇-水洗脫液 分別配制甲醇體積濃度為5?15%、60?80%的甲醇-水溶液，再分別移入脫氣罐中， 在真空度為〇. 06?0. 09MPa、溫度為10?35°C的條件下，保持20?40min，脫去其中的氧 氣，然后充入0. 1?0. 3MPa的高純度氮氣，保持20?40min，即制備出脫氧充氮甲醇-水洗 脫液； (5) .制備蘿卜硫素初步純化濃縮液 第（3)步完成之后，將第（3)步制備出的蘿卜硫素粗提液泵入活化SP850或聚酰胺吸 附樹脂柱，吸附其中的蘿卜硫素，蘿卜硫素粗提液體積與SP850或聚酰胺吸附樹脂的體積 比為lmL : 15?30mL，以流速為5?10BV/h通過SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，吸附完成后 收集荷載蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱和脫附蘿卜硫素的過柱溶液，對于收集的 脫附蘿卜硫素的過柱溶液，進行生化處理，達標后排放，對于收集的荷載蘿卜硫素的SP850 或聚酰胺吸附樹脂柱，先用2BV、甲醇體積濃度為5?15 %的脫氧充氮甲醇-水洗脫液、以 3?6BV/h的流速洗滌夾雜于樹脂間的雜質(zhì)，分別收集甲醇洗滌液和洗去樹脂間雜質(zhì)的荷 載蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，對收集的甲醇洗滌液，減壓蒸餾回收甲醇后進 行生化處理，達標后排放，對收集的洗去樹脂間雜質(zhì)的荷載蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸 附樹脂柱，泵入甲醇積濃度為60?80%的脫氧充氮甲醇-水洗脫液以3?6BV/h的流速洗 脫被吸附的蘿卜硫素，直至甲醇體積濃度為60?80%的脫氧充氮甲醇-水洗脫液的耗量達 到SP850或聚酰胺吸附樹脂柱體積的5?10BV時止，分別收集荷載蘿卜硫素的洗脫液和脫 附蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，對于收集的脫附蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸 附樹脂柱，進行再生處理，對于收集的荷載蘿卜硫素的甲醇洗脫液，泵入反滲透器中，在壓 力低于0. 4MPa下進行反滲透濃縮，直至濃縮液中蘿卜硫素的質(zhì)量濃度達到20?30%時為 止，分別收集反滲透截留液和濾過液，對于收集的反滲透截留液，泵入真空濃縮機中，在真 空度為〇. 06?0. 09MPa、溫度為30?45°C的條件下，進行真空濃縮，直至濃縮液無甲醇味 時為止，就制備出蘿卜硫素初步純化濃縮液，對于收集的反滲透濾過液，進行減壓蒸餾回收 甲醇后進行生化處理，達標后排放； (6) .制備高純度蘿卜硫素凍干物 第（5)步完成后，先將第（5)步制備的蘿卜硫素初步純化濃縮液通過0. 22um微孔過濾 膜過濾，再泵入以反相C18硅膠為填料的制備型液相色譜柱中，蘿卜硫素初步純化濃縮液 體積與C18硅膠填料質(zhì)量之比為lmL : 50?80g，接著控制色譜條件進行制備分離蘿卜硫 素，具體的色譜條件為：檢測波長為245nm，柱溫為25°C，流速為1. OmL · min-1 ;A組分為甲 醇，B組分為超純水，梯度洗脫程序為：在Omin?15min區(qū)間，流動相中的A組分由5%上 升至25%，B組分由95%下降至75%，在15min?75min區(qū)間，流動相中的A組分由25% 上升至65%，B組分由75%下降至35%，收集37?4lmin區(qū)間的洗脫液，在35?45°C下 進行真空濃縮，直至濃縮液中蘿卜硫素質(zhì)量濃度達到30?50%時，就制備出蘿卜硫素濃縮 液，將該蘿卜硫素濃縮液置于凍干機中，在25?45Pa真空度、-50?-60°C溫度下，進行冷 凍干燥24?36h，就制備出純度為98%以上的蘿卜硫素，經(jīng)核磁共振、液質(zhì)聯(lián)機和旋光儀分 析鑒定，所制備出的蘿卜硫素的化學結(jié)構(gòu)為1-異硫氰酸-4-甲磺?；?(2-烯）丁烷； (7) 制備再生樹脂柱 向第（5)步收集的脫附了蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱泵入3?4BV的無水 甲醇，以2?5BV/h的流速洗脫樹脂吸附的雜質(zhì)，分別收集洗脫液和脫附雜質(zhì)的SP850或聚 酰胺吸附樹脂柱，對收集的甲醇洗脫液，減壓蒸餾回收甲醇后分別收集甲醇和濃縮液，對于 收集的甲醇進行脫水處理，制備出無水甲醇，對于收集的洗脫雜質(zhì)的SP850或聚酰胺吸附 樹脂柱，用1?2BV的蒸餾水以2?5BV/h的流速洗滌，分別收集經(jīng)該蒸餾水洗滌的SP850 或聚酰胺吸附樹脂柱和洗滌液，對收集的蒸餾水洗滌后的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，即 為再生樹脂柱，可再次用于純化蘿卜硫素粗提液，對于收集的洗滌液，可用于配制脫氧充氮 甲醇-水洗脫液。
【文檔編號】C12P13/00GK104059947SQ201410253792
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月3日
【發(fā)明者】劉慶海, 萬玉萍, 顏李秀, 馮琳, 周小華 申請人:重慶海巨農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司, 重慶大學