H7n9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒鈘t-pcr引物、探針及其檢測試劑盒和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR引物及其檢測試劑盒和檢測方法。本發(fā)明檢測試劑盒含有特異性引物和探針，通過反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化，一次試驗可同時特異性地檢測H7N9HA基因和NA基因，具有很好的特異性、敏感性和重復(fù)性；可特異性地檢測H7N9，與AIVH1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H6N2、H9N2亞型及NDVLasota等病毒的不發(fā)生交叉反應(yīng)；檢測限達(dá)1.22pg/μL；重復(fù)性較好，批間CV值小于5%；與常規(guī)的熒光RT-PCR相比，本發(fā)明檢測僅耗時3h，且費用低廉；本發(fā)明的檢測方法是H7N9亞型禽流感病毒快速初篩及初步確認(rèn)定型的良好方法。
【專利說明】H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR引物、探針及其檢測試劑盒和檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于病毒檢測領(lǐng)域，涉及一種H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR引物、探針及其檢測試劑盒和檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002]禽流感是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)引起的禽類急性傳染病，其發(fā)病率和死亡率極高，是危害禽類的主要烈性傳染病之一，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將所有高致病性禽流感列為法定通報性疾病，部分低致病性禽流感也屬于法定通報性疾病，OIE成員一旦發(fā)現(xiàn)或懷疑發(fā)生通報性疾病時應(yīng)立即向OIE中央局報告，并由OIE中央局向所有成員通報。禽流感病毒屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，為單股負(fù)鏈RNA，多形態(tài)的有囊膜病毒，根據(jù)A型流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)表面抗原的不同，可進(jìn)行亞型分類。目前已知A型流感病毒有16種HA亞型(Hl~H16)和9種NA亞型(NI~N9)。
[0003]2013年，中國在全世界范圍內(nèi)首次爆發(fā)H7N9亞型禽流感病毒感染人類疫情，這表明禽流感病毒已突破種間屏障，感染人類致病，甚至死亡。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，雖然人感染H7N9亞型禽流感病毒后死率較高，H7N9亞型禽流感病毒引起急性呼吸道傳染病，并已致多人死亡，但目前還沒有相應(yīng)的保護(hù)性疫苗可供使用。為了應(yīng)對H7N9亞型禽流感疫情，提高對H7N9亞型禽流感疫情的防控能力，疾病防控機(jī)構(gòu)迫切需要快速、有效的H7N9亞型禽流感病毒檢測方法，因此建立快速、敏感、準(zhǔn)確的H7N9亞型禽流感病毒檢測方法具有十分重要和緊迫的意義。
[0004]近年來，實時熒光定量RT-PCR (Real-Time RT-PCR)技術(shù)在病毒檢測領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，它將普通RT-PCR技術(shù)與熒光定量檢測技術(shù)相結(jié)合，不僅具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點，而且通過分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，結(jié)果更為準(zhǔn)確直觀，整個檢測過程不需要打開試管，有效地減少了假陽性發(fā)生的機(jī)會，已成為病原體檢測的重要方法。
[0005]文獻(xiàn)檢索表明，目前國內(nèi)外診斷H7N9亞型禽流感病毒的方法仍然是病毒分離、血清學(xué)試驗和普通RT-PCR、單重?zé)晒釸T-PCR等，一次試驗完成禽流感病毒H7亞型和N9亞型初步確認(rèn)的雙重?zé)晒釸T-PCR檢測技術(shù)尚屬空白。經(jīng)典的病毒分離、血清學(xué)診斷方法費時費力，不適于臨床檢測，不符合生物安全條例的要求，無法滿足快速檢測的要求。普通PCR不僅無法對病料樣本中的病毒進(jìn)行定量檢測，且擴(kuò)增反應(yīng)后需要電泳檢測，不僅不適于大批量樣本的篩選，而且容易因操作污染造成假陽性。單重?zé)晒釸T-PCR，僅能對禽流感H7亞型或N9亞型進(jìn)行檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述技術(shù)難題，本發(fā)明通過大量實驗研究篩選出高靈敏和高特異性的引物序列和檢測探針，及特定的雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)程序和條件，針對2013年我國爆發(fā)H7N9亞型禽流感病毒變異株，構(gòu)建了高敏感、高特異性的H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測試劑盒及檢測方法，發(fā)明H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法及試劑盒，一次實驗即可檢測H7亞型和N9亞型禽流感病毒，具有快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測試劑盒。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供一種H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法。
[0009]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
[0010]H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR引物，其序列為:
[0011]HA-F:5’ -TGATGACTGTATGGCCAGTATTAGAAA-3’ (SEQ ID NO:1)，
[0012]HA-R:5’ -TTGCATTGCCTCTTCCCTGTA-3’ (SEQ ID NO:2)，
[0013]NA-F:5’ -AATCAGAGGGAAACACTCAAACG-3’ (SEQ ID NO:3)，
[0014]NA-R:5’ -GCTTATCAGGGCGCGATACT-3’ (SEQ ID NO:4)；
[0015]或者為該些序列的核苷酸互補(bǔ)序列。
[0016]一種H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測試劑盒，該試劑盒含有上述所述的引物。
[0017]進(jìn)一步的，上述試劑盒還含有RT-PCR檢測探針，其序列如下所示:
[0018]HA-P:5’ -AACACCTATGATCACAGCAA-3’ (SEQ ID NO:5)，
[0019]NA-P:5’ -AACAATACACGATAGGTCC-3’ (SEQ ID NO:6)；
[0020]或者為該些序列的核苷酸互補(bǔ)序列。
[0021]進(jìn)一步的，上述試劑盒還含有RT-PCR反應(yīng)液、酶液、ROX染料、陽性對照品和陰性對照品。
[0022]H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法，包括以下步驟:
[0023]1)提取病毒RNA ；
[0024]2) RT-PCR 反應(yīng)體系:
[0025]

【權(quán)利要求】
1.H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR引物，其序列為:
HA-F:5’ -TGATGACTGTATGGCCAGTATTAGAAA-3’ ( SEQ ID NO:1),
HA-R:5’ -TTGCATTGCCTCTTCCCTGTA-3’ (SEQ ID NO:2)，
NA-F:5’ -AATCAGAGGGAAACACTCAAACG-3’ (SEQ ID NO:3)，
NA-R: 5’-GCTTATCAGGGCGCGATACT-3’ (SEQ ID N0:4)； 或者為該些序列的核苷酸互補(bǔ)序列。
2.—種H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒含有權(quán)利要求1所述的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒還含有RT-PCR檢測探針，其序列如下所示:
HA-P:5’ - AACACCTATGATCACAGCAA-3’ (SEQ ID NO:5)，
NA-P:5’ -AACAATACACGATAGGTCC-3’ (SEQ ID N0:6)； 或者為該些序列的核苷酸互補(bǔ)序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒還含有RT-PCR反應(yīng)液、酶液、ROX染料、陽性對照品和陰性對照品。
5.H7N9亞型禽流感病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)提取病毒RNA； 2)RT-PCR反應(yīng)體系: RT-PCR 反應(yīng)液 12.5 μL ROX 染料0.5μL 酶(λ 25μL . 20 pmol/μ L HA-F I μ L . 20 pmol / μ L HA-R IyL .10 pmol/μ L HA-P 0.5 μ L .20 pmol / μ L NA-F IuL . 20 pmol / μ L NA- R IyL . 10 pmol/μ L NA- P 0.5 μ L 病毒 RNA6.75 μL 總體積25 μL ; 3)RT-PCR反應(yīng)程序:
4)結(jié)果分析:根據(jù)信噪情況設(shè)定和調(diào)整基線和閾值，通過收集的熒光曲線和CT值判定結(jié)果，當(dāng)陰性對照的檢測結(jié)果無數(shù)值或Ct值>30，陽性對照的Ct值< 28.0時，Ct值< 30.0的樣本判為陽性，Ct值無數(shù)值或Ct值>30的樣本判為陰性。
【文檔編號】C12Q1/68GK104073571SQ201410255750
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】楊素, 廖明, 黃海超, 陳軒, 陶旻, 焦培榮, 徐海聶, 沙才華, 廖秀云 申請人:中華人民共和國珠海出入境檢驗檢疫局