一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明采用復(fù)合誘變技術(shù)篩選出透明質(zhì)酸產(chǎn)率高的菌種，結(jié)合發(fā)酵技術(shù)，透明質(zhì)酸產(chǎn)品產(chǎn)出率高，可達(dá)7-9g/L。發(fā)酵得到的透明質(zhì)酸易于分離純化，生產(chǎn)周期短。生產(chǎn)易于控制，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，收率高，并且大大降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物多糖提取【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種獸疫鏈球菌及用其制備透明 質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝。

【背景技術(shù)】
[0002] 國內(nèi)目前有十幾家透明質(zhì)酸的生產(chǎn)廠家，且這些企業(yè)大多數(shù)是用動(dòng)物組織提取 法。從動(dòng)物組織中提取Η A常用的原料有雞冠、臍帶和豬皮等，主要工藝過程包括脫水、磨 碎、浸泡、提取、除雜、沉淀和分離。這種方法的特點(diǎn)是工藝流程簡單，適用于原料來源分散 的小規(guī)模生產(chǎn)。但由于原料有限，且原料中Η A的含量低，同時(shí)Η A又還與硫酸軟骨素等粘 多糖共存于生物組織中，致使其收率低、提純難、成本過高、產(chǎn)品質(zhì)量差，且難以應(yīng)用于大規(guī) 模生產(chǎn)。隨著Η A需求量的不斷增大，迫切要求生產(chǎn)大量的高質(zhì)量Η A，動(dòng)物組織提取法己 不能適應(yīng)這種要求。國外從上世紀(jì)70年代開始研究利用發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸，采用發(fā)酵法 生產(chǎn)的透明質(zhì)酸質(zhì)量穩(wěn)定、原料易得，成本低。
[0003] 目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸采用的工藝發(fā)酵周期長、產(chǎn)物相對(duì)分子量低、產(chǎn) 品透光率差、蛋白質(zhì)含量高、葡萄糖醛酸含量低。有的透明質(zhì)酸的形態(tài)為纖維狀，不易溶解。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述存在的缺陷而提供一種獸疫鏈球菌及用其制備透明 質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明采用復(fù)合誘變技術(shù)篩選出透明質(zhì)酸產(chǎn)率高的菌種，結(jié)合發(fā)酵技術(shù)， 透明質(zhì)酸產(chǎn)品產(chǎn)出率高，可達(dá)7-9g/L。發(fā)酵得到的透明質(zhì)酸易于分離純化，生產(chǎn)周期短。生 產(chǎn)易于控制，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，收率高，并且大大降低了生產(chǎn)成本。
[0005] 本發(fā)明的一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝技術(shù)方案為，一種獸疫 鏈球菌(SirepiococciAs zooepiofeffiiciAs) AWA008,其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心保藏，其保藏編號(hào)是：CGMCCNo. 9111，保藏日期是2014年04月29日。
[0006] 目前該獸疫鏈球菌在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，地 址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101，其保藏編號(hào)是：CGMCCNo. 9111，菌種 的拉丁文名稱是SirepiococciAs 參據(jù)的微生物(株）：AWA008,保藏日期是 2014年04月29日。
[0007] 本發(fā)明所述的獸疫鏈球菌菌株特征：呈球形或卵圓形，呈鏈狀排列，有莢膜，無芽 孢，無鞭毛，革蘭氏染色陽性。
[0008] 所述的獸疫鏈球菌制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟： (1) 搖瓶種子液培養(yǎng)：將斜面菌種接種于裝有滅菌培養(yǎng)液的1L錐形瓶中，培養(yǎng)，鏡檢觀 察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中； (2) 菌種擴(kuò)配：將培養(yǎng)液加入到種子罐中，進(jìn)行蒸汽滅菌后，按無菌要求在種子罐里加 入菌種培養(yǎng)，鏡檢觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于發(fā)酵罐中； (3) 發(fā)酵； (4)提純。
[0009] 所述的獸疫鏈球菌制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝，具體為： (1) 搖瓶種子液培養(yǎng)：將斜面菌種接種于裝有滅菌培養(yǎng)液的1L錐形瓶中，37°C培養(yǎng) 12-16小時(shí)，鏡檢觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中； (2) 菌種擴(kuò)配：將培養(yǎng)液加入到種子罐中，進(jìn)行蒸汽滅菌后，設(shè)定溫度36. 3°C、pH6. 86， 按無菌要求在種子罐里加入菌種，維持罐壓〇. 〇5MPa，培養(yǎng)12-16小時(shí)，鏡檢觀察菌體生長 良好，無雜菌污染，即可接種于發(fā)酵罐中； (3) 發(fā)酵：將一半發(fā)酵培養(yǎng)液加入到發(fā)酵罐中，進(jìn)行蒸汽滅菌后，設(shè)定溫度36. 3°C、 pH6. 86,維持罐壓0.05MP，將種子罐的培養(yǎng)基全部壓入到發(fā)酵罐中，記錄pH值，在pH下降時(shí) 加入另一半發(fā)酵培養(yǎng)液，保持各項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)酵液pH每分鐘下降幅度小于0. 01時(shí)結(jié)束發(fā)酵， 檢測發(fā)酵液粘度，將發(fā)酵液壓入沉淀罐中； (4) 提純，包括以下工藝： ① 前沉淀：向沉淀罐里在攪拌情況下緩緩地加入95%的酒精，至產(chǎn)生雪花狀沉淀，控制 在47-50度(折至20°C時(shí)的酒精度)，收集沉淀物； ② 溶解：用氯化鈉溶液將沉淀物溶解，調(diào)節(jié)pH至9. 3-9. 5,加入EDTA、活性炭、珍珠巖， 攪拌均勻； ③ 過濾：將溶解后的料液壓入1#大板框過濾一遍后，過濾液調(diào)PH9. 3-9. 5。再加入白 硅藻土和珍珠巖后，攪拌均勻后，壓入2#大板框過濾第二遍。二遍過濾液中加入硅藻土，攪 拌均勻后，料液通過不銹鋼板打循環(huán)澄清后，過濾第三遍，澄清度在99. 5%以上，然后過濾 液通過聚丙烯濾芯過濾至潔凈間沉淀罐； ④ 后沉淀：料液調(diào)pH至7. 0-7. 3,攪拌下緩緩地加入95%酒精至沉淀產(chǎn)生，控制酒精度 數(shù)47-50度即可。靜止20-40分鐘后將上清液打入廢酒精罐； ⑤ 脫水離心：用75%-80%的pH值在7. 0-7. 3之間的酒精脫水6-7次，然后再用90%的 酒精脫水2-3次，脫水后酒精度數(shù)到90%以上，靜止1小時(shí)左右，打走上清液，取樣測pH值， 并控制在7. 0-7. 3之間。攪拌15-20分鐘后離心； ⑥ 干燥：將離心好的物料放入干燥罐，設(shè)定溫度30°C，抽真空干燥3小時(shí)后，每小時(shí)升 溫5°C，設(shè)溫60°C時(shí)停止，檢測水分，水分小于7%后出罐。
[0010] 步驟（1)、（2)、（3)中的培養(yǎng)液包括按重量百分比的葡萄糖3-5%、酵母粉1. 5-2%、 七水硫酸鎂1-2%、四水硫酸錳0. 01-0. 1%、磷酸二氫鉀0. 1-0. 5%、磷酸氫二鈉0. 5-0. 8%、碳 酸鈣0. 1-1%、氯化鋅0. 05-0. 1%，余量為水。
[0011] 步驟②氯化鈉溶液濃度為1-5%。
[0012] 步驟②中，加入EDTA、活性炭、珍珠巖質(zhì)量比為，1: 10-15: 20-30。
[0013] 優(yōu)選的，加入EDTA、活性炭、珍珠巖質(zhì)量比為，1:11: 25。
[0014] 步驟③中，白硅藻土和珍珠巖的質(zhì)量比為1:1-10。
[0015] 優(yōu)選的，白硅藻土和珍珠巖的質(zhì)量比為1:1. 5。
[0016] 步驟③中過濾液通過0. 22微米聚丙烯濾芯過濾至潔凈間沉淀罐。
[0017] 本發(fā)明的有益效果為： 1.本發(fā)明采用復(fù)合誘變技術(shù)篩選出透明質(zhì)酸產(chǎn)率高的菌種，結(jié)合發(fā)酵技術(shù)，透明質(zhì)酸 產(chǎn)品產(chǎn)出率高，可達(dá)7-9g/L。發(fā)酵得到的透明質(zhì)酸易于分離純化，生產(chǎn)周期短。
[0018] 2.本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡單，原輔料常見易得，生產(chǎn)易于控制，雜質(zhì)含量更低，適合工 業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，收率高，并且大大降低了生產(chǎn)成本。
[0019]

【具體實(shí)施方式】： 為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實(shí)例來詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明 并不局限于此。
[0020] 實(shí)施例1 本發(fā)明的一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝技術(shù)方案為，一種獸疫鏈球 菌(SirepiococciAs AWA008,其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心保藏，其保藏編號(hào)是：CGMCCNo. 9111，保藏日期是2014年04月29日。
[0021] 目前該獸疫鏈球菌在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，地 址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101，其保藏編號(hào)是：CGMCCNo. 9111，菌種 的拉丁文名稱是SirepiococciAs 參據(jù)的微生物(株）：AWA008,保藏日期是 2014年04月29日。
[0022] 本發(fā)明所述的獸疫鏈球菌菌株特征：呈球形或卵圓形，呈鏈狀排列，有莢膜，無芽 孢，無鞭毛，革蘭氏染色陽性。
[0023] 所述的獸疫鏈球菌制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟： (1) 搖瓶種子液培養(yǎng)：將斜面菌種接種于裝有滅菌培養(yǎng)液的1L錐形瓶中，37°C培養(yǎng) 12-16小時(shí)，鏡檢觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中； (2) 菌種擴(kuò)配：將培養(yǎng)液加入到種子罐中，進(jìn)行蒸汽滅菌后，設(shè)定溫度36. 3°C、pH6. 86， 按無菌要求在種子罐里加入菌種，維持罐壓〇. 〇5MPa，培養(yǎng)12-16小時(shí)，鏡檢觀察菌體生長 良好，無雜菌污染，即可接種于發(fā)酵罐中； (3) 發(fā)酵：將一半發(fā)酵培養(yǎng)液加入到發(fā)酵罐中，進(jìn)行蒸汽滅菌后，設(shè)定溫度36. 3°C、 pH6. 86,維持罐壓0.05MP，將種子罐的培養(yǎng)基全部壓入到發(fā)酵罐中，記錄pH值，在pH下降時(shí) 加入另一半發(fā)酵培養(yǎng)液，保持各項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)酵液pH每分鐘下降幅度小于0. 01時(shí)結(jié)束發(fā)酵， 檢測發(fā)酵液粘度，將發(fā)酵液壓入沉淀罐中； (4) 前沉淀：向沉淀罐里在攪拌情況下緩緩地加入95%的酒精，至產(chǎn)生雪花狀沉淀，控 制在47-50度(折至20°C時(shí)的酒精度)，收集沉淀物； (5) 溶解：用氯化鈉溶液將沉淀物溶解，調(diào)節(jié)pH至9. 3-9. 5,加入EDTA、活性炭、珍珠巖， 攪拌均勻； (6) 過濾：將溶解后的料液壓入1#大板框過濾一遍后，過濾液調(diào)pH9. 3-9. 5。再加入白 硅藻土和珍珠巖后，攪拌均勻后，壓入2#大板框過濾第二遍。二遍過濾液中加入硅藻土，攪 拌均勻后，料液通過不銹鋼板打循環(huán)澄清后，過濾第三遍，澄清度在99. 5%以上，然后過濾 液通過聚丙烯濾芯過濾至潔凈間沉淀罐； (7) 后沉淀：料液調(diào)pH至7. 0-7. 3,攪拌下緩緩地加入95%酒精至沉淀產(chǎn)生，控制酒精 度數(shù)47-50度即可。靜止20-40分鐘后將上清液打入廢酒精罐； (8) 脫水離心：用75%-80%的pH值在7. 0-7. 3之間的酒精脫水6-7次，然后再用90% 的酒精脫水2-3次，脫水后酒精度數(shù)到90%以上，靜止1小時(shí)左右，打走上清液，取樣測pH 值，并控制在7. 0-7. 3之間。攪拌15-20分鐘后離心； (9) 干燥：將離心好的物料放入干燥罐，設(shè)定溫度30°C，抽真空干燥3小時(shí)后，每小時(shí)升
【權(quán)利要求】
1. 一種獸疫鏈球菌(SirepiococciAs zooepiofeffiiciAs) AWA008,其在中國微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏編號(hào)是：CGMCCNo. 9111，保藏日期是2014年04 月29日。
2. 用權(quán)利要求1所述的獸疫鏈球菌制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 搖瓶種子液培養(yǎng)：將斜面菌種接種于裝有滅菌培養(yǎng)液的1L錐形瓶中，培養(yǎng)，鏡檢觀 察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中； (2) 菌種擴(kuò)配：將培養(yǎng)液加入到種子罐中，進(jìn)行蒸汽滅菌后，按無菌要求在種子罐里加 入菌種培養(yǎng)，鏡檢觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于發(fā)酵罐中； (3) 發(fā)酵； (4) 提純。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟 (1 )、（ 2)、（ 3)中的培養(yǎng)液包括按重量百分比的葡萄糖3-5%、酵母粉1. 5-2%、七水硫酸鎂 1-2%、四水硫酸錳0. 01-0. 1%、磷酸二氫鉀0. 1-0. 5%、磷酸氫二鈉0. 5-0. 8%、碳酸鈣0. 1-1%、 氯化鋅0. 05-0. 1%，余量為水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟（1) 中，培養(yǎng)條件為：37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟（2) 中，種子罐培養(yǎng)條件為溫度36. 3°C、pH6. 86,培養(yǎng)時(shí)間為12-16小時(shí)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟（2) 中，種子罐罐壓0. 〇5MPa。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟（3) 中，發(fā)酵罐培養(yǎng)條件為溫度36. 3°C、pH6. 86。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟（3) 中，發(fā)酵罐罐壓0. 05MP。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的獸疫鏈球菌制備透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟（3) 中發(fā)酵罐培養(yǎng)過程具體為將一半發(fā)酵培養(yǎng)液加入到發(fā)酵罐中，進(jìn)行蒸汽滅菌后，將種子罐 的培養(yǎng)基全部壓入到發(fā)酵罐中，記錄pH值，在pH下降時(shí)加入另一半發(fā)酵培養(yǎng)液，保持各項(xiàng) 指標(biāo)，發(fā)酵液pH每分鐘下降幅度小于0. 01時(shí)結(jié)束發(fā)酵，檢測發(fā)酵液粘度，將發(fā)酵液壓入沉 淀罐中。
【文檔編號(hào)】C12R1/46GK104059865SQ201410257052
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】韓秀云, 李松田 申請(qǐng)人:濱州安華生物工程有限公司