植物寄生線蟲核糖體its區(qū)通用擴(kuò)增引物新組合及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了2對(duì)植物寄生線蟲核糖體ITS區(qū)通用擴(kuò)增引物新組合及其用于PCR擴(kuò)增的使用方法，所述方法的關(guān)鍵創(chuàng)新點(diǎn)為新的引物組合用于植物寄生線蟲ITS區(qū)PCR擴(kuò)增后，新建立的PCR擴(kuò)增體系能夠擴(kuò)增的植物線蟲種類更加廣譜，擴(kuò)增效率和成功率顯著提高，有效地解決了以前植物線蟲鑒定中ITS區(qū)擴(kuò)增存在的諸多問題。利用本發(fā)明中的方法擴(kuò)增獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足線蟲DNA條碼鑒定、RFLP酶切鑒定等分子檢測(cè)技術(shù)的需求，可在我國(guó)口岸及農(nóng)林部門檢疫鑒定中推廣應(yīng)用。
【專利說明】植物寄生線蟲核糖體ITS區(qū)通用擴(kuò)增引物新組合及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物線蟲檢疫鑒定領(lǐng)域，提供了 2對(duì)植物寄生線蟲核糖體ITS區(qū)通用擴(kuò)增引物新組合及其使用方法，具體而言，所述方法通過使用新的ITS區(qū)PCR擴(kuò)增通用引物組合，顯著提高了所建立的PCR體系的擴(kuò)增效率和成功率，能夠擴(kuò)增的植物寄生線蟲種類也更加廣譜，有效地解決了以前植物寄生線蟲ITS區(qū)擴(kuò)增中存在的諸多問題，適用于口岸及農(nóng)林業(yè)相關(guān)檢疫鑒定實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]對(duì)植物線蟲進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定是研究線蟲生物學(xué)習(xí)性及其發(fā)病規(guī)律的重要基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步制定有效的防治措施具有重要意義。傳統(tǒng)的植物線蟲鑒定方法主要依賴于形態(tài)特征和形態(tài)測(cè)量值，要求鑒定者要有極為豐富的經(jīng)驗(yàn)和技巧。基于DNA的分子鑒定方法對(duì)鑒定者的要求相對(duì)較低，是形態(tài)鑒定的重要輔助手段，目前在線蟲的分類鑒定中應(yīng)用廣泛。
[0003]在植物寄生線蟲分子鑒定中，核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)是重要的分子標(biāo)記之一。自上世紀(jì)90年代初以來，以核糖體ITS區(qū)核酸序列為分子標(biāo)記對(duì)植物寄生線蟲進(jìn)行分類鑒定的研究有大量的文獻(xiàn)報(bào)道(Vrain等，1992 ；Ferris等，1993 ；Hoyer等，1998 ；Waeyenberge 等，2000 ;Subbotin等，2005 ;Burgermeister 等，2009 ；De Luca等，2010)。分析發(fā)現(xiàn)，所有這些研究所使用的引物主要有3對(duì)，分別為pxb 101和pxb481 (Vrain等，1992)、F194 和 F195 (Ferris 等，1993)、Tw81 和 AB28 (Subbotin 等，2005)，而引物 PRATTW81 則是Tff81略微修改獲得(De Luca等，2010)。
[0004]雖然上述引物通過輪換使用在很大程度上能夠解決大部分植物寄生線蟲的ITS區(qū)擴(kuò)增問題，但擴(kuò)增效率和成功率不高是很多線蟲學(xué)者面臨的問題，尤其是對(duì)單條線蟲進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)更是如此。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)有的引物對(duì)擴(kuò)增的線蟲種類具有一定的偏好性，比如TW81和AB28在擴(kuò)增短體線蟲時(shí)效果較好，但在擴(kuò)增傘滑刃線蟲和滑刃線蟲時(shí)則完全失敗，
坐坐寸寸ο
[0005]本研究在以前學(xué)者研究的基礎(chǔ)上，對(duì)上述所報(bào)道的3對(duì)加I條引物進(jìn)行重組，獲得了 12對(duì)引物組合，然后使用這12對(duì)引物分別對(duì)多種植物寄生線蟲的ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，以篩選出高效、穩(wěn)定、廣譜的植物寄生線蟲ITS區(qū)通用擴(kuò)增引物，為植物寄生線蟲的檢疫鑒定提供部分的技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中植物寄生線蟲核糖體ITS區(qū)擴(kuò)增存在的效率低、成功率低、廣譜性低等缺陷，提供2對(duì)植物寄生線蟲核糖體ITS區(qū)PCR擴(kuò)增通用的引物組合及其使用方法，所述引物組合和使用方法的步驟如下:
[0007]所述2對(duì)引物組合序列為:
[0008]引物組合1:[0009]上游引物PXBlOl:5' -TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3'
[0010]下游引物AB28: 5' -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3'
[0011]弓丨物組合2:
[0012]上游引物F194:5' -CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3'
[0013]下游引物AB28: 5' -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3'
[0014]所述2對(duì)引物組合使用方法包括如下步驟:
[0015]步驟一、線蟲DNA的提取:
[0016]首先用雙蒸水將線蟲清洗干凈，然后挑取單條線蟲放入含8 μ LddH2O的PCR管中，再反復(fù)凍融2次 后，加入2μ L裂解液，最后56°C保溫lh，95°C加熱1min即可。經(jīng)所述步驟提取獲得的上清液可用于后續(xù)的分子實(shí)驗(yàn)；所述凍融為液氮處理lmin，65°C水浴2min ；所述裂解液為lOXPCRBuffer、雙蒸水與20mg/mL蛋白酶K的混合液，三者的體積比為10: 9: I ；
[0017]步驟二、核糖體ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增:
[0018]PCR擴(kuò)增體系(25 μ L): 10 XPCR Buffer (Mg2+) 2.5 μ L，dNTP (2.5mmol/L) I μ L，上游引物(10ymol/L)0.5μ L，下游引物(10 μ mol/L) 0.5 μ L,rTaq DNA聚合酶(5U/μ L) 0.2 μ L,模板DNA5 μ L，雙蒸水15.3 μ L ；PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性3min ；40個(gè)循環(huán)反應(yīng):94°C變性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸1.5min ;最后72°C保溫5min，使反應(yīng)物充分延伸；
[0019]步驟三、PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè):
[0020]每個(gè)樣品取3 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，設(shè)置電壓160V，電泳30min后將凝膠放入EB染液中染色15min，隨后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。
[0021]優(yōu)選地，本申請(qǐng)的2對(duì)引物新組合的使用方法中，步驟二中PCR反應(yīng)條件要求退火溫度為55°C。
[0022]所述雙蒸水即為經(jīng)過兩次蒸餾的無菌水，其通常用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0023]所述裂解液中的10 XPCR Buffer和20mg/mL的蛋白酶K均為TAKARA公司生產(chǎn)，商品編號(hào)分別為R001B和9033。
[0024]本申請(qǐng)的方法適用于多種植物線蟲的核糖體ITS區(qū)擴(kuò)增，特別地，適用于穿刺短體線蟲(Pratylenchus penetrans)、玻利維亞短體線蟲(Pratylenchus bolivianus)、斯氏短體線蟲(Pratylenchus scribneri)、朱頂紅短體線蟲(Pratylenchus hippeastri) >松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)、擬松材線蟲(B.mucronatus)、豆傘滑刃線蟲(Bursaphelenchus doui)、阿蘇里傘滑刃線蟲(Bursaphelenchus arthui)、水稻干尖線蟲(Aphelenchoides besseyi)。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的進(jìn)步在于:新的引物組合使用后，植物寄生線蟲ITS區(qū)PCR擴(kuò)增體系能夠擴(kuò)增的植物線蟲種類更加廣譜，擴(kuò)增效率和成功率顯著提高，有效地解決了以前植物線蟲鑒定中存在的ITS區(qū)擴(kuò)增諸多問題。利用本發(fā)明中的方法擴(kuò)增獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足線蟲物種DNA條碼鑒定、RFLP酶切鑒定等分子檢測(cè)技術(shù)的需求，可在我國(guó)口岸及農(nóng)林部門檢疫鑒定中推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1使用12對(duì)引物組合對(duì)穿刺短體線蟲(Ppl301)ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；[0027]圖2使用12對(duì)引物組合對(duì)玻利維亞短體線蟲(Pbl301) ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)
結(jié)果;
[0028]圖3使用12對(duì)引物組合對(duì)斯氏短體線蟲(Psl301)ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；
[0029]圖4使用12對(duì)引物組合對(duì)朱頂紅短體線蟲(Ph1201) ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果;
[0030]圖5使用12對(duì)引物組合對(duì)松材線蟲(Bxl308) ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；
[0031]圖6使用12對(duì)引物組合對(duì)擬松材線蟲(Bml303) ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；
[0032]圖7使用12對(duì)引物組合對(duì)豆傘滑線蟲(Bdl303) ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果；
[0033]圖8使用12對(duì)引物組合對(duì)阿蘇里傘滑刃線蟲(Bal301) ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)
結(jié)果;
[0034]圖9使用12對(duì)引物組合對(duì)阿聯(lián)酋傘滑線蟲(Bsl201) ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果;
[0035]圖10使用12對(duì)引物組合美國(guó)傘滑刃線蟲(Bsl301)ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果;
[0036]圖11使用12對(duì)引物組合對(duì)水稻干尖線蟲(NJAbl20231) ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)
結(jié)果;
[0037]圖中各字母含義如下:泳道1、2:引物組合PXBlOl和PXB481 ;泳道3、4:引物組合PRATTW81和PXB481 ;泳道5、6:引物組合TW81和PXB481 ;泳道7、8:引物組合F194和F195 ；泳道9、10:引物組合Tff81和AB28 ;泳道11,12:引物組合PXBlOl和AB28 ;泳道13,14:引物組合F194和AB28 ;泳道15、16:引物組合Tff81和F195 ;泳道17、18:引物組合PRATTW81和AB28 ;泳道19,20:引物組合PXBlOl和F195 ;泳道21,22:引物組合PRATTW811和F195 ；泳道23、24:引物組合F194和PXB481。
【具體實(shí)施方式】
[0038]為能進(jìn)一步了解本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
、特點(diǎn)及功效，茲舉以下實(shí)施例，并配合附圖詳細(xì)說明如下:
[0039]標(biāo)本來源
[0040]本實(shí)驗(yàn)測(cè)試了 11個(gè)線蟲群體,其中包括I個(gè)穿刺短體線蟲群體，I個(gè)玻利維亞短體線蟲群體，I個(gè)斯氏短體線蟲群體,I個(gè)朱頂紅短體線蟲群體,I個(gè)松材線蟲群體，I個(gè)擬松材線蟲群體,I個(gè)豆傘滑刃線蟲群體、I個(gè)阿蘇里傘滑刃線蟲群體,I個(gè)阿聯(lián)酋傘滑刃線蟲群體，I個(gè)美國(guó)傘滑刃線蟲群體，I個(gè)水稻干尖線蟲群體。詳情見下表:
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種植物寄生線蟲核糖體ITS區(qū)通用擴(kuò)增的引物組合，所述引物組合包括2對(duì)引物，其序列為: 引物組合1: 上游引物 PXBlOl:5/ -TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3' 下游引物 AB28:5' -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3' 引物組合2: 上游引物 F194:5' -CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3' 下游引物 AB28:5' -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合 的使用方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一、線蟲DNA的提取: 首先用雙蒸水將線蟲清洗干凈，然后挑取單條線蟲放入含8 μ L ddH20的PCR管中，再反復(fù)凍融2次后，加入2 μ L裂解液，最后56°C保溫lh，95°C加熱1min即可。經(jīng)所述步驟提取獲得的上清液可用于后續(xù)的分子實(shí)驗(yàn)；所述凍融為液氮處理lmin，65°C水浴2min ;所述裂解液為lOXPCRBuffer、雙蒸水與20mg/mL蛋白酶K的混合液，三者的體積比為10:9:1; 步驟二、核糖體ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增:
PCR 擴(kuò)增體系(25 μ L): 10 X PCR Buffer (Mg2+) 2.5 μ L, dNTP (2.5mmol/L) I μ L，上游弓 I物(10ymol/L)0.5μ L，下游引物(10 μ mol/L) 0.5 μ L, rTaq DNA 聚合酶(5U/μ L) 0.2 μ L,模板DNA5 μ L，雙蒸水15.3 μ L ；PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性3min ；40個(gè)循環(huán)反應(yīng):94°C變性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸1.5min ;最后72°C保溫5min，使反應(yīng)物充分延伸； 步驟三、PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè): 每個(gè)樣品取3μ L擴(kuò)增產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，設(shè)置電壓160V，電泳30min后將凝膠放入EB染液中染色15min，隨后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的使用方法，其特征在于:步驟二中PCR反應(yīng)條件要求退火溫度為55°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的使用方法，其特征在于:所述線蟲為穿刺短體線蟲(Pratylenchus penetrans)、玻利維亞短體線蟲(Pratylenchus bolivianus)、斯氏短體線蟲(Pratylenchus scribneri)、朱頂紅短體線蟲(Pratylenchus hippeastri)、松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)、擬松材線蟲(B.mucronatus)、豆傘滑刃線蟲(Bursaphelenchus doui)、阿蘇里傘滑刃線蟲(Bursaphelenchus arthui)或水稻干尖線蟲(Aphelenchoides besseyi)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104032002SQ201410257542
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】王金成, 顧建鋒, 林宇, 郭京澤, 牛春敬, 陳先鋒, 黃國(guó)明 申請(qǐng)人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心