一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠及其制備方法,是兩種酶催化交聯(lián)形成的互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,一個是引入酚羥基的多糖大分子通過氧化酶和過氧化氫催化酚羥基氧化交聯(lián)形成多糖大分子網(wǎng)絡(luò),另一個是蛋白質(zhì)或含有氨基酸殘基的多肽通過轉(zhuǎn)移酶催化肽鍵交聯(lián)形成蛋白質(zhì)或多肽大分子網(wǎng)絡(luò)。上述兩個網(wǎng)絡(luò)互相貫穿,沒有化學(xué)鍵結(jié)合,形成一種新型的互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。該水凝膠未使用化學(xué)交聯(lián)劑,具有優(yōu)異的生物相容性和力學(xué)性能,可以是干態(tài)或濕態(tài)膜狀、多孔海綿狀、纖維狀,可以用作接觸鏡、藥物釋放載體、組織工程支架或組織修復(fù)材料。
【專利說明】一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是由兩種不同的酶催化生物大分子交聯(lián)形成的互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠及其制備方法,屬于生物醫(yī)用高分子材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]水凝膠是一種能夠在水中溶脹、保持大量水分而又不溶解于水的三維網(wǎng)狀聚合物,在與血液、體液及人體組織相接觸時表現(xiàn)出良好的生物相容性。水凝膠比其它任何合成生物材料都接近活體組織,在性質(zhì)上類似于細(xì)胞外基質(zhì)部分,吸水后可減少對周圍組織的摩擦和機(jī)械作用,顯著改善材料的生物學(xué)性能。故水凝膠在組織工程和再生醫(yī)學(xué)方面具有極大的應(yīng)用潛力。
[0003]互穿網(wǎng)絡(luò)(IPN)水凝膠是由兩種或兩種以上聚合物通過網(wǎng)絡(luò)互穿而形成的具有獨(dú)特性能的聚合物。在互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠中,兩個組分網(wǎng)絡(luò)之間沒有化學(xué)鍵合相,各個聚合物都保持各自的特性;同時,兩種網(wǎng)絡(luò)互穿相互影響,有協(xié)同增強(qiáng)力學(xué)性能的作用。因此制備互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠是一種提高水凝膠強(qiáng)度的有效方法。國內(nèi)外對IPN生物醫(yī)用材料的研究已有多年探索,通常采用化學(xué)交聯(lián)方法得到IPN水凝膠。由于化學(xué)交聯(lián)劑或引發(fā)劑對細(xì)胞有毒,制備的IPN水凝膠用于人體有潛在的毒性,限制了互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠在生物醫(yī)用方面的應(yīng)用。
[0004]互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠還可以采用物理交聯(lián)方式,如疏水作用、氫鍵作用、離子交聯(lián)等,雖不引入新的化學(xué)物質(zhì)但難以獲得均勻一致的、理想的交聯(lián)度,或者交聯(lián)點(diǎn)可能在生理體液中易于解體。
[0005]谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(mTG)能催化蛋白或多肽或含有氨基酸殘基的分子上的谷氨酰胺殘基與和賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε-胺基反應(yīng),相互間交聯(lián)形成大分子水凝膠網(wǎng)絡(luò)。辣根過氧化物酶(HRP)是以鐵卟啉為輔基的酶,在有H2O2存在時能催化酚類、胺類及其取代物聚合,多糖大分子鏈上存在著大量的氨基或羧基,可通過碳二亞胺介導(dǎo)的偶聯(lián)反應(yīng)引入酚羥基的結(jié)構(gòu),引入酚羥基的多糖大分子通過辣根過氧化物酶催化酚羥基氧化交聯(lián)形成大分子水凝膠。
[0006]單個酶催化交聯(lián)制備的水凝膠已有報(bào)道,但是水凝膠強(qiáng)度通常比較低,用作生物醫(yī)用材料有一定難度。
[0007]因此,有必要開發(fā)強(qiáng)度高、生物相容性好的互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠材料。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]技術(shù)問題:為了克服水凝膠力學(xué)強(qiáng)度差以及常用化學(xué)交聯(lián)劑或引發(fā)劑殘留于體系中引起的細(xì)胞毒性、生物相容性降低的缺點(diǎn),本發(fā)明提供了一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠及其應(yīng)用,該互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠具有優(yōu)異的力學(xué)性能,良好的生物相容性,克服了化學(xué)交聯(lián)劑帶來的毒性缺點(diǎn),又可解決物理交聯(lián)效果不佳的問題。
[0009]技術(shù)方案:一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,包括:[0010]I)鍵合引入酚羥基的多糖大分子通過酚羥基在氧化酶催化作用下氧化交聯(lián)形成的多糖大分子網(wǎng)絡(luò);
[0011]2)蛋白質(zhì)或含有氨基酸殘基的多肽通過轉(zhuǎn)移酶催化形成肽鍵交聯(lián)的蛋白質(zhì)或多肽網(wǎng)絡(luò);
[0012]上述兩個網(wǎng)絡(luò)之間互相貫穿,沒有化學(xué)鍵結(jié)合,其中蛋白或多肽網(wǎng)絡(luò)的含量為水凝膠干重總質(zhì)量的0.5 % -99.5 %,多糖大分子網(wǎng)絡(luò)的含量為水凝膠干重總質(zhì)量的
0.5% -99.5%。
[0013]所述多糖大分子是透明質(zhì)酸、葡聚糖、殼聚糖、硫酸軟骨素、肝素、阿拉伯膠、瓊脂多糖、多聚果糖、甘露聚糖、半乳聚糖、結(jié)冷膠、瓜爾膠、海藻酸、硫酸乙酰肝素、淀粉及其衍生物中的任意一種或多種。
[0014]所述鍵合引入酚羥基具體是指多糖大分子通過酯鍵或酰胺鍵結(jié)合酪胺、酪氨酸、多巴胺、高香草酸、沒食子酸、對羥基苯乙酸、對羥基苯丙酸中的任一種得到。
[0015]所述蛋白質(zhì)是明膠、膠原、絲素蛋白、玉米蛋白、纖維蛋白、彈性蛋白、粘蛋白、糖蛋白中的一種或多種。
[0016]所述氨基酸殘基是賴氨酸或谷氨酰胺殘基。
[0017]所述氧化酶是過氧化物酶、辣根過氧化物酶、酪氨酸酶、漆酶、嗜熱菌蛋白酶、磷酸酯酶中的任一種。
[0018]所述轉(zhuǎn)移酶是谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶、凝血酶中任一種。
[0019]所述的水凝膠中還含有添加劑,該添加劑是細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白、維生素、胰島素、留體激素、地塞米松、藥物或無機(jī)鹽中的一種或多種的混合物,添加劑的含量為水凝膠總質(zhì)量的0.01 % -3%。
[0020]一種制備所述的生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的方法,步驟為:
[0021]I)制備含有酚羥基的多糖大分子;具體制法見實(shí)施例1~4 ;
[0022]2)以含有酚羥基的多糖大分子和蛋白質(zhì)或含有氨基酸殘基的多肽為反應(yīng)原料在氧化酶、轉(zhuǎn)移酶和過氧化氫的催化下制備生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。其中,鍵合引入酚羥基的多糖大分子通過酚羥基在氧化酶催化作用下氧化交聯(lián)形成多糖大分子網(wǎng)絡(luò);蛋白質(zhì)或含有氨基酸殘基的多肽通過轉(zhuǎn)移酶催化形成肽鍵交聯(lián)的蛋白質(zhì)或多肽網(wǎng)絡(luò)。
[0023]有益效果:
[0024]1、本發(fā)明在多糖大分子鏈上引入酚羥基通過氧化酶催化酚羥基氧化交聯(lián)和蛋白或含有賴氨酸和谷氨酰胺殘基的多肽通過轉(zhuǎn)移酶催化肽鍵交聯(lián)構(gòu)成互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,兩個網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用提高了水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度。
[0025]3、本發(fā)明所用的原材料是來自于天然界的生物大分子或多肽,得到的互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠具有優(yōu)異的生物相容性。
[0026]4、本發(fā)明采用兩種酶催化交聯(lián)制備互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的方法既克服了化學(xué)交聯(lián)劑帶來的毒性,又解決了物理交聯(lián)劑效果不佳的缺點(diǎn)。
[0027]5、本發(fā)明的互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠可以加工成干態(tài)或濕態(tài)膜狀、多孔海綿狀、纖維狀,可以用作組織工程支架或組織修復(fù)材料。
[0028]6、本發(fā)明的互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠可以含有細(xì)胞生長因子、維生素、留體激素、藥物或無機(jī)鹽的一種或多種作為添加劑,賦予該水凝膠各種生物醫(yī)學(xué)功能。[0029]7、本發(fā)明的生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠用作接觸鏡,具有優(yōu)異的抗脫水性能和佩戴舒適性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1是多糖大分子引入酚羥基后的結(jié)構(gòu)簡圖。
[0031]圖2是引入酚羥基的多糖大分子的酶催化交聯(lián)機(jī)理簡圖。
[0032]圖3是蛋白質(zhì)或多肽大分子的酶催化交聯(lián)機(jī)理簡圖。
[0033]圖4是引入酚羥基的多糖大分子和蛋白或多肽大分子形成互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的簡圖。
[0034]圖5是實(shí)施例1制備的殼聚糖-對羥基苯丙酸1H NMR圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做更進(jìn)一步地解釋。下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明,但并不用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。
[0036]本發(fā)明生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠是采用兩種不同的酶催化交聯(lián)形成的生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,該互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠具有優(yōu)良的生物相容性和力學(xué)強(qiáng)度,可用于細(xì)胞、組織培養(yǎng),作為組織工程支架或組織修復(fù)材料,可以制成膜狀、三維多孔狀,或纖維狀等,可用作接觸鏡。
[0037]本發(fā)明的一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,該互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠包括:1)鍵合引入酚羥基的多糖大分子通過酚羥基在氧化酶催化作用下交聯(lián)形成的多糖大分子網(wǎng)絡(luò);2)蛋白質(zhì)或含有賴氨酸和谷氨酰胺殘基的多肽通過轉(zhuǎn)移酶催化交聯(lián)形成的蛋白質(zhì)或多肽大分子網(wǎng)絡(luò);上述兩個網(wǎng)絡(luò)之間互相貫穿,沒有化學(xué)鍵結(jié)合,其中蛋白或多肽或合成大分子網(wǎng)絡(luò)的含量為水凝膠干重總質(zhì)量的0.5% -99.5%,多糖大分子網(wǎng)絡(luò)的含量為水凝膠干重總質(zhì)量的 0.5% -99.5%。
[0038]所述多糖是透明質(zhì)酸、葡聚糖、殼聚糖、硫酸軟骨素、肝素、阿拉伯膠、瓊脂多糖、多聚果糖、甘露聚糖、半乳聚糖、結(jié)冷膠、瓜爾膠、海藻酸、硫酸乙酰肝素、淀粉、及其衍生物中的一種或多種。
[0039]多糖大分子鏈上引入的酚羥基結(jié)構(gòu)可以是通過酯鍵或酰胺鍵結(jié)合的酪胺、酪氨酸、多巴胺、高香草酸、沒食子酸、對羥基苯乙酸、對羥基苯丙酸的一種。
[0040]所述蛋白是明膠、膠原、絲素蛋白、玉米蛋白、纖維蛋白、彈性蛋白、粘蛋白、糖蛋白中的一種或多種。
[0041]所述氧化酶是過氧化物酶、辣根過氧化物酶、酪氨酸酶、漆酶、嗜熱菌蛋白酶、磷酸酯酶。所述轉(zhuǎn)移酶是谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨同工酶、凝血酶。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可以是來自于組織的,也可以是微生物發(fā)酵制備,記為mTG。
[0042]本發(fā)明的一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠還含有添加劑,該添加劑是細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白、維生素、胰島素、留體激素、地塞米松、藥物或無機(jī)鹽的一種或多種的混合物,添加劑的含量為水凝膠總質(zhì)量的0.01% -3%。
[0043]本發(fā)明的一種生 物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠可以是濕態(tài)或干態(tài)的膜狀、纖維狀、多孔海綿狀,用作角膜接觸鏡、藥物釋放載體、組織工程支架或組織修復(fù)材料。[0044]一種制備所述的生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的方法,步驟為:
[0045]I)制備含有酚羥基的多糖大分子;具體制法見實(shí)施例1~4 ;
[0046]2)以含有酚羥基的多糖大分子和蛋白質(zhì)或含有氨基酸殘基的多肽為反應(yīng)原料在氧化酶、轉(zhuǎn)移酶和過氧化氫的催化下制備生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠;鍵合引入酚羥基的多糖大分子通過酚羥基在氧化酶催化作用下氧化交聯(lián)形成多糖大分子網(wǎng)絡(luò);蛋白質(zhì)或含有氨基酸殘基的多肽通過轉(zhuǎn)移酶催化形成肽鍵交聯(lián)的蛋白質(zhì)或多肽網(wǎng)絡(luò)。
[0047]實(shí)施例1
[0048]殼聚糖-對羥基苯丙酸(CHPA)的制備
[0049]稱取水溶性殼聚糖(0.88g,5mmol)溶于150ml去離子水中,用磁力攪拌器恒溫?cái)嚢柚镣耆芙?。稱取對羥基苯丙酸(1.66g, IOmmol), 1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl) (2.73g,15mmol),N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (1.72g,15mmol)溶于100mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)水溶液中,其中DMF:水(3:2,V:V),室溫活化Ih(pH=4.7),將活化液加入到殼聚糖溶液中,室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液移入透析袋中蒸餾水透析3天,透析液調(diào)pH析出產(chǎn)物,真空干燥得到產(chǎn)物鍵合對羥基苯丙酸的殼聚糖,以下標(biāo)為殼聚糖-對羥基苯丙酸0.7g,產(chǎn)率80 %。經(jīng)1H NMR測定產(chǎn)物中對羥基苯丙酸的取代度為15%,如圖5所示。
[0050]實(shí)施例2
[0051]透明質(zhì)酸-酪胺(HA-Tyr)的制備
[0052]稱取透明質(zhì)酸(2g,5mmol)溶于100mL去離子水中,用磁力攪拌器恒溫?cái)嚢柚镣耆芙狻7Q取酪胺(1.68g, IOmmol),EDC.HCl (2.73g, 15mmol),NHS (1.72g, 15mmol)溶于100ml的蒸餾水中,室溫活化Ih (pH = 4.7),將活化液加入到透明質(zhì)酸溶液中,室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液移入透析袋中蒸餾水透析3天,透析液調(diào)pH析出產(chǎn)物,真空干燥得到產(chǎn)物鍵合酪胺的透明質(zhì)酸,以下標(biāo)為透明質(zhì)酸-酪胺。
[0053]實(shí)施例3
[0054]肝素-酪胺Ofep-Tyr)的制備
[0055]稱取肝素(0.5g)溶于100mL去離子水中,用磁力攪拌器恒溫?cái)嚢柚镣耆芙狻7Q取酪胺(1.68g, I Ommol),EDC.HCl (2.73g, 15mmol),NHS (1.72g, 15mmol)溶于 100ml 的蒸餾水中,室溫活化Ih (pH = 4.7),將活化液加入到肝素溶液中,室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液移入透析袋中蒸餾水透析3天,透析液調(diào)pH析出產(chǎn)物,真空干燥得到產(chǎn)物鍵合酪胺的肝素,以下標(biāo)為肝素-酪胺。
[0056]實(shí)施例4
[0057]海藻酸-多巴胺(Alg-Dopa)的制備
[0058]稱取海藻酸(2g,5mmol)溶于200ml去離子水中,用磁力攪拌器恒溫?cái)嚢柚镣耆芙狻7Q多巴胺(2g, I Ommol),EDC.HCl (2.73g, 15mmol),NHS (1.72g, 15mmol)溶于 100ml 的蒸餾水中,室溫活化Ih (pH = 4.7),將活化液加入到海藻酸溶液中,室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液移入透析袋中蒸餾水透析3天,透析液調(diào)pH析出產(chǎn)物,真空干燥得到產(chǎn)物鍵合多巴胺的海藻酸,以下標(biāo)為海藻酸-多巴胺。
[0059]實(shí)施例5
[0060]稱取0.1g殼聚糖-對羥基苯丙酸(CHPA)溶解在IOml的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.4)中得到I %的CHPA水溶液,稱取Ig明膠加入到上述CHPA水溶液中,40°C水浴加熱溶解,靜置消泡,得到均勻混合的CHPA和明膠水溶液。
[0061]加入0.5ml濃度為100U/ml的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,0.1ml濃度為500U/ml的辣根過氧化物酶,加入0.06ml濃度為25mM的過氧化氫(H2O2),快速均勻混合,置于柱狀模具中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,得到膜狀生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。
[0062]反復(fù)水洗該水凝膠,去除殘留的H2O2、醋酸、醋酸鈉后,將其保存在蒸餾水中,即得兩種不同酶催化交聯(lián)的明膠/CHPA互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。明膠通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián)得到蛋白大分子網(wǎng)絡(luò),CHPA通過辣根過氧化物酶氧化酚羥基交聯(lián)得到多糖大分子網(wǎng)絡(luò)。
[0063]實(shí)施例6
[0064]稱取0.1g海藻酸-多巴胺(Alg-Dopa)溶解在IOml的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.4)中得到1%的Alg-Dopa水溶液,稱取Ig明膠加入到上述Alg-Dopa水溶液中,40°C水浴加熱溶解,靜置消泡,得到均勻混合的Alg-Dopa和明膠水溶液。
[0065]加入0.5ml濃度為100U/ml的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,0.1ml濃度為500U/ml的辣根過氧化物酶,加入0.06ml濃度為25mM的H2O2,快速均勻混合,至于柱狀模具中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,得到膜狀生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。
[0066]反復(fù)水洗該水凝膠,去除殘留的H2O2、醋酸、醋酸鈉后,將其保存在蒸餾水中,即得兩種不同酶催化交聯(lián)的明膠/Alg-Dopa互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。明膠通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián)得到蛋白大分子網(wǎng)絡(luò),Alg-Dopa通過辣根過氧化物酶交聯(lián)得到多糖大分子網(wǎng)絡(luò)。
[0067]實(shí)施例7
[0068]稱取0.1g透明質(zhì)酸-酪胺(HA-Tyr)溶解在IOml的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH =
5.4)中得到1%的HA-Tyr水溶液,稱取Ig明膠加入到上述HA-Tyr水溶液中,40°C水浴加熱溶解,靜置消泡,得到均勻混合的HA-Tyr和明膠水溶液。
[0069]加入0.5ml濃度為100U/ml的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,0.1ml濃度為500U/ml的辣根過氧化物酶,加入0.06ml濃度為25mM的H2O2,快速均勻混合,至于柱狀模具中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,得到膜狀生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。
[0070]反復(fù)水洗該水凝膠,去除殘留的H2O2、醋酸、醋酸鈉后,將其保存在蒸餾水中,即得兩種不同酶催化交聯(lián)的明膠/HA-Tyr互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。明膠通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián)得到蛋白大分子網(wǎng)絡(luò),HA-Tyr通過辣根過氧化物酶氧化酚羥基交聯(lián)得到多糖大分子網(wǎng)絡(luò)。
[0071]實(shí)施例8
[0072]稱取0.1g肝素-酪胺Ofep-Tyr)溶解在IOml的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH = 5.4)中得到I %的Hep-Tyr水溶液,稱取Ig明膠加入到上述Hep-Tyr水溶液中,40°C水浴加熱溶解,靜置消泡,得到均勻混合的Hep-Tyr和明膠水溶液。
[0073]加入0.5ml濃度為100U/ml的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,0.1ml濃度為500U/ml的辣根過氧化物酶,加入0.06ml濃度為25mM的H2O2,快速均勻混合,至于柱狀模具中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,得到柱狀生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。
[0074]反復(fù)水洗該水凝膠,去除殘留的H2O2、醋酸、醋酸鈉后,將其保存在蒸餾水中,即得兩種不同酶催化交聯(lián)的明膠/Hep-Tyr互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。明膠通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián)得到蛋白大分子網(wǎng)絡(luò),Hep-Tyr通過辣根過氧化物酶交聯(lián)得到多糖大分子網(wǎng)絡(luò)。
[0075]實(shí)施例9[0076]稱取0.1g殼聚糖-對羥基苯丙酸(CHPA)溶解在IOml的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.4)中得到1%的CHPA水溶液,稱取Ig玉米蛋白加入到上述CHPA水溶液中,40°C水浴加熱溶解,靜置消泡,得到均勻混合的CHPA和玉米蛋白水溶液。
[0077]加入0.5ml濃度為100U/ml的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,0.1ml濃度為500U/ml的辣根過氧化物酶,加入0.06ml濃度為25mM的H2O2,快速均勻混合,至于模具中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,得到生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。
[0078]反復(fù)水洗該水凝膠,去除殘留的H2O2、醋酸、醋酸鈉后,將其保存在蒸餾水中,即得兩種不同酶催化交聯(lián)的玉米蛋白/CHPA互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。玉米蛋白通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián)得到蛋白大分子網(wǎng)絡(luò),CHPA通過辣根過氧化物酶氧化酚羥基交聯(lián)得到多糖大分子網(wǎng)絡(luò)。
[0079]實(shí)施例10
[0080]稱取0.1g殼聚糖-對羥基苯丙酸(CHPA)溶解在IOml的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.4)中得到CHPA水溶液,稱取Ig含有賴氨酸和谷氨酰胺小分子肽加入到上述CHPA水溶液中,40°C水浴加熱溶解,靜置消泡。加入0.5ml濃度為50U/ml的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,0.1ml濃度為500U/ml的辣根過氧化物酶,快速均勻混合,至于模具中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,得到生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。
[0081]反復(fù)水洗該水凝膠,去除殘留的醋酸、醋酸鈉后,將其保存在蒸餾水中,即得兩種不同酶催化交聯(lián)的多肽/CHPA互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,小分子肽通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián)得到多肽大分子網(wǎng)絡(luò),CHPA通過辣根過氧化物酶氧化酚羥基交聯(lián)得到多糖大分子網(wǎng)絡(luò)。
[0082]實(shí)施例11
[0083]稱取0.1g透明質(zhì)酸-酪胺(HA-Tyr)溶解在IOm蒸餾水中得到I %的ΗΑ-Tyr水溶液,稱取Ig明膠加入到上述HA-Tyr水溶液中,40°C水浴加熱溶解,靜置消泡,得到均勻混合的HA-Tyr和明膠水溶液。
[0084]加入0.5ml濃度為100U/ml的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,0.1ml濃度為500U/ml的酪氨酸酶,加入0.06ml濃度為25mM的H2O2,快速均勻混合,至于模具中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,得到生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。
[0085]反復(fù)水洗該水凝膠,去除殘留的H2O2后,將其保存在蒸餾水中,即得兩種不同酶催化交聯(lián)的明膠/HA-Tyr互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,明膠通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián)得到蛋白大分子網(wǎng)絡(luò),HA-Tyr通過辣根過氧化物酶交聯(lián)得到多糖大分子網(wǎng)絡(luò)。
[0086]實(shí)施例12
[0087]稱取0.1g殼聚糖-對羥基苯丙酸(CHPA)溶解在IOml的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.4)中得到CHPA水溶液,稱取Ig明膠加入到上述CHPA水溶液中,40°C水浴加熱溶解,靜置消泡,得到均勻混合的CHPA和明膠水溶液。
[0088]加入0.25ml濃度為200U/ml的凝血酶,0.1ml濃度為500U/ml的辣根過氧化物酶,加入0.06ml濃度為25mM的H2O2,快速均勻混合,至于模具中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,得到生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。
[0089]反復(fù)水洗該水凝膠,去除殘留的H2O2、醋酸、醋酸鈉后,將其保存在蒸餾水中,即得兩種不同酶催化交聯(lián)的明膠/CHPA互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,明膠通過凝血酶交聯(lián)得到蛋白大分子網(wǎng)絡(luò),CHPA通過辣根過氧化物酶交聯(lián)得到多糖大分子網(wǎng)絡(luò)。
[0090]實(shí)施例13[0091]稱取0.1g殼聚糖-對羥基苯丙酸(CHPA)溶解在IOml的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.4)中得到CHPA水溶液,稱取Ig明膠加入到上述CHPA水溶液中,40°C水浴加熱溶解,靜置消泡,得到均勻混合的CHPA和明膠水溶液。
[0092]加入0.5ml濃度為100U/ml的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,0.1ml濃度為500U/ml的漆酶,快速均勻混合,至于模具中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,得到生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。
[0093]反復(fù)水洗該水凝膠,去除殘留的醋酸、醋酸鈉后,將其保存在蒸餾水中,即得兩種不同酶催化交聯(lián)的明膠/CHPA互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,明膠通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián)得到蛋白大分子網(wǎng)絡(luò),CHPA通過漆酶交聯(lián)得到多糖大分子網(wǎng)絡(luò)。
[0094]實(shí)施例14
[0095]稱取0.2g殼聚糖-對羥基苯丙酸(CHPA)溶解在20ml的醋酸-醋酸鈉緩沖液(PH=5.4)中得到CHPA水溶液,稱取2g明膠加入到上述CHPA水溶液中,40°C水浴加熱溶解,靜置消泡后,加入0.2ml濃度為500U/ml的辣根過氧化物酶快速均勻混合,得到均勻混合的CHPA和明膠水溶液。
[0096]在40°C將上述混合液用微量注射泵以50ml/h的速度注射到含谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶濃度為15U/ml、H2O2濃度為0.8mM的水溶液中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,得到纖維狀互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。反復(fù)水洗該水凝膠,去除殘留的H2O2、醋酸、醋酸鈉后,將其保存在蒸餾水中,SP得兩種不同酶催化交聯(lián)的明膠/CHPA互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠纖維。
[0097]實(shí)施例15
[0098]稱取0.2g殼聚糖-對羥基苯丙酸(CHPA)溶解在20ml的醋酸-醋酸鈉緩沖液(PH=5.4)中得到I %的CHPA水溶液,稱取2g明膠加入到上述CHPA水溶液中,40°C水浴加熱溶解后,另加入2000IU重組人表皮生長因子,攪拌均勻,靜置消泡,得到含有重組人表皮生長因子的CHPA和明膠水溶液。
[0099]加入1ml濃度為100U/ml的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,0.2ml濃度為500U/ml的辣根過氧化物酶,加入0.12ml濃度為25mM的H2O2,快速均勻混合,至于柱狀磨具中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,得到膜狀互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。反復(fù)水洗該水凝膠,去除殘留的H2O2、醋酸、醋酸鈉后,將其保存在蒸餾水中,得到兩種不同酶催化交聯(lián)的明膠/CHPA互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。將上述水凝膠進(jìn)一步經(jīng)氣體發(fā)泡,真空冷凍干燥,得到明膠/CHPA互穿網(wǎng)絡(luò)多孔狀材料,可作為藥物釋放系統(tǒng)材料。
[0100]實(shí)施例16
[0101]稱取0.1g殼聚糖-對羥基苯丙酸(CHPA)溶解在IOml的醋酸-醋酸鈉緩沖液(PH=5.4)中得到CHPA水溶液,加入0.5ml濃度為100U/ml的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶均勻混合。稱取Ig明膠加入到上述CHPA水溶液中,40°C水浴加熱溶解,靜置消泡后,加入0.2ml濃度為500U/ml的辣根過氧化物酶和0.12ml濃度為8mM的H2O2均勻混合。上述兩種混合液快速均勻混合后,注入角膜接觸鏡模具中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,得到互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠角膜接觸鏡。反復(fù)水洗該水凝膠接觸鏡,去除殘留的H2O2、醋酸、醋酸鈉后,將其保存在蒸餾水中,即得兩種不同酶催化交聯(lián)的明膠/CHPA互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠角膜接觸鏡。 [0102]實(shí)施例17
[0103]稱取0.2g殼聚糖-對羥基苯丙酸(CHPA)溶解在20ml的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.4)中得到I %的CHPA水溶液,稱取2g明膠加入到上述CHPA水溶液中,40°C水浴加熱溶解,靜置消泡,得到均勻混合的CHPA和明膠水溶液。
[0104]加入1ml濃度為100U/ml的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,0.2ml濃度為500U/ml的辣根過氧化物酶,加入0.12ml濃度為25mM的H2O2,快速均勻混合,至于柱狀磨具中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,得到膜狀互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。反復(fù)水洗該水凝膠,去除殘留的H2O2、醋酸、醋酸鈉后,進(jìn)一步經(jīng)液氮冷凍干燥,得到兩種不同酶催化交聯(lián)的明膠/CHPA多孔海綿狀生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,可作為組織工程支架、組織修復(fù)材料。
[0105]實(shí)施例18
[0106]制備明膠濃度為10%,殼聚糖-對羥基苯丙酸(CHPA)含量分別為0^,0.5%,I %,1.5%的明膠/CHPA混合溶液,加入TG酶、HRP酶、H2O2使終濃度分別為10U/mL、5U/mL、
0.15mM。按表1中的組成混合加入到模具中,于40°C下反應(yīng)交聯(lián)40min,即得兩種酶催化交聯(lián)的互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。
[0107]表1.明膠/CHPA互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的組成
[0108]
【權(quán)利要求】
1.一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,其特征在于,包括: 1)鍵合引入酚羥基的多糖大分子通過酚羥基在氧化酶催化作用下氧化交聯(lián)形成的多糖大分子網(wǎng)絡(luò); 2)蛋白質(zhì)或含有氨基酸殘基的多肽通過轉(zhuǎn)移酶催化形成肽鍵交聯(lián)的蛋白質(zhì)或多肽網(wǎng)絡(luò); 上述兩個網(wǎng)絡(luò)之間互相貫穿,沒有化學(xué)鍵結(jié)合,其中蛋白或多肽網(wǎng)絡(luò)的含量為水凝膠干重總質(zhì)量的0.5% -99.5 %,多糖大分子網(wǎng)絡(luò)的含量為水凝膠干重總質(zhì)量的.0.5% -99.5%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,其特征在于,所述多糖大分子是透明質(zhì)酸、葡聚糖、殼聚糖、硫酸軟骨素、肝素、阿拉伯膠、瓊脂多糖、多聚果糖、甘露聚糖、半乳聚糖、結(jié)冷膠、瓜爾膠、海藻酸、硫酸乙酰肝素、淀粉及其衍生物中的任意一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,其特征在于,所述鍵合引入酚羥基具體是指多糖大分子通過酯鍵或酰胺鍵結(jié)合酪胺、酪氨酸、多巴胺、高香草酸、沒食子酸、對羥基苯乙酸、對羥基苯丙酸中的任一種得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,其特征在于,所述蛋白質(zhì)是明膠、膠原、絲素蛋白、玉米蛋白、纖維蛋白、彈性蛋白、粘蛋白、糖蛋白中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,其特征在于,所述氨基酸殘基是賴氨酸或谷氨酰胺殘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,其特征在于,所述氧化酶是過氧化物酶、辣根過氧化物酶、酪氨酸酶、漆酶、嗜熱菌蛋白酶、磷酸酯酶中的任一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,其特征在于,所述轉(zhuǎn)移酶是谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶、凝血酶中任一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠,其特征在于,所述的水凝膠中還含有添加劑,該添加劑是細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白、維生素、胰島素、留體激素、地塞米松、藥物或無機(jī)鹽中的一種或多種的混合物,添加劑的含量為水凝膠總質(zhì)量的0.01% -3%。
9.權(quán)利要求1~8任一所述的一種生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠以濕態(tài)或干態(tài)的膜狀、纖維狀、多孔海綿狀,用于角膜接觸鏡、藥物釋放載體、組織工程支架或組織修復(fù)材料。
10.一種制備權(quán)利要求1~8任一所述的生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的方法,其特征在于,步驟為: 1)制備含有酚羥基的多糖大分子; 2)以含有酚羥基的多糖大分子和蛋白質(zhì)或含有氨基酸殘基的多肽為反應(yīng)原料在氧化酶、轉(zhuǎn)移酶和過氧化氫的催化下制備生物大分子互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠;鍵合引入酚羥基的多糖大分子通過酚羥基在氧化酶催化作用下氧化交聯(lián)形成多糖大分子網(wǎng)絡(luò);蛋白質(zhì)或含有氨基酸殘基的多肽通過轉(zhuǎn)移酶催化形成肽鍵交聯(lián)的蛋白質(zhì)或多肽網(wǎng)絡(luò)。
【文檔編號】C12P19/04GK104004231SQ201410259494
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】李新松, 張葉敏, 吳旸, 范治平 申請人:東南大學(xué)