大腸埃希氏菌Escherichia coli及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物菌種及其制備，特別是指一種大腸埃希氏菌Escherichia?coli及其制備方法。是將編碼禽大腸桿菌病病原菌外膜蛋白中經過克隆的iss基因片段，經過BamHⅠ和SalⅠ雙酶切之后重組于表達質粒pEGX-6p-1，構建原核表達質粒pEGX-6p-1/iss；將原核表達質粒pEGX-6p-1/iss轉化到大腸桿菌BL21-DE3中，構建重組大腸桿菌BL21-DE3/pEGX-6p-1/iss。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術存在的菌苗廣譜性差等技術問題。具有廣譜性好，免疫效果好、工業(yè)化開發(fā)前景廣闊等優(yōu)點。
【專利說明】大腸埃希氏菌Escherichia coli及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物菌種及其制備,特別是指一種大腸埃希氏菌Escherich ia coli及其制備方法。
【背景技術】
[0002]大腸桿菌病是由大腸桿菌埃氏菌的某些致病性血清型菌株引起的疾病總稱。禽大腸桿菌病是指部分或全部由禽致病性大腸桿菌(APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病，包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌性肉芽腫(Hjarre病)、氣囊病(慢性呼吸道疾病即CRD)、大腸桿菌性蜂窩織炎(即炎性過程)、腫頭綜合癥、大腸桿菌性腹膜炎、大腸桿菌性輸卵管炎、大腸桿菌性骨髓炎/滑膜炎(即火雞骨髓炎綜合征)、大腸桿菌性全眼球炎及大腸桿菌性臍炎/卵黃囊感染。大腸桿菌在哺乳動物主要引起腸道疾病，而當禽類收到高致病性大腸桿菌感染而使其防御能力不足以抵抗或完全喪失時，常會引起典型的繼發(fā)性局部或全身性感染。大腸桿菌病給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的損失，是禽病調查中最常報道的疾病及酮體廢棄的主要原因。有資料顯示:禽肉加工中43%肉雞酮體的報廢與大腸桿菌性敗血癥有關。
[0003]現(xiàn)有技術主要是通過利用抗菌素來進行致病性大腸桿菌的治療，但是由于抗生素的濫用，隨著細菌耐藥性的增強，大腸桿菌病也越來越難以防治。從食品安全角度考慮，導致直接食用這些禽畜類產品的人群感染大腸桿菌病的幾率增加?？股氐挠昧吭絹碓酱?，致使農產品藥殘量增大，導致人間接性的食用大量的養(yǎng)殖用藥，這都給人類健康造成隱患。另外傳統(tǒng)疫苗都是通過改 變培養(yǎng)條件，或在不同寄主動物上傳代的辦法使致病微生物的毒性減弱；或是通過物理化學的方法將它們滅活。但這樣的疫苗都不理想，因為弱化的菌株可能發(fā)生回復突變而變成有毒的，或者失去免疫原性，滅活不適當?shù)囊呙邕€會引起疾病的流行。因此，迫切需要發(fā)展一種預防性能更加的新型大腸桿菌病的廣譜疫苗。
[0004]有研究表明，禽大腸桿菌的外膜蛋白在致病性和免疫方面都起著重要的作用。趙香汝(趙香汝，楊漢春.不同血清型禽大腸桿菌外膜蛋白免疫原性研究.張家口農專學報.1999，第15卷第4期:4-6.)和楊漢春的研究表明不同血清型禽大腸桿菌混合的外膜蛋白免疫，無論對同型或異型菌株的攻擊，都有一定的保護作用。李曉霞(李曉霞，邱玉玉，王海蓉.腸致病性大腸桿菌外膜蛋白免疫保護性研究.中國免疫學雜志.2007，第23卷第4期:394-397.)、邱玉玉的研究表明腸致病性大腸桿菌外膜蛋白可以誘導兔對大腸桿菌的特異性體液免疫和細胞免疫應答。
[0005]禽致病性大腸桿菌中的iss基因(increased serum survival gene)是影響雞大腸桿菌菌株補體抗性的一個重要因素，iss基因編碼的蛋白iss屬于外膜蛋白，與細菌抗補體作用有關。有研究表明，禽源大腸桿菌iss基因位于原核核糖體結合位點之后，其編碼的外膜蛋白具有102個氨基酸，約為llkD，對酸有抗性，其中17-22位氨基酸組成了 iss 蛋白的信號妝(Johnson T J, Giddings C W，Horne SM, et a.1 Location ofincreased serum survivalgene and selected virulence traits on a conjugative Rplasmid in an avian Escherichia coli isolate.Avian Dis, 2002, 46 (2): 342-352.NolanLK, GiddingsC ff, Horne SM, et a.1 Complement resistance, as determined by viablecount and flow cytometric methods, and its associationwith the presence of issand the virulence ofavian Escherichia col1.Avian Dis,2002,46 (2):386-392.ChubaP J, Leon M A, Banerjee A, et a.1 Cloning and DNA sequence ofplasmid determinantiss, coding for increased serum survival and surface exclusion,which hashomo I ogywith lambda DNA.MolGen Genet, 1989, 216(2-3): 287-292.)。據(jù)推測，iss 蛋白是通過調節(jié)細胞表面上對補體膜攻擊復合體敏感的位點，導致表面排斥，使菌株具有抗血清補體溶菌作用的能力(Nolan LK, GiddingsC W，Horne SM, et a.1 Complementresistance,as determined by viable count and flow cytometric methods, and itsassociationwith the presence of iss and the virulence ofavian Escherichia coli [J].Avian Dis, 2002, 46 (2): 386-392.Chuba P J, Leon M A, Banerjee A, et a.1 Cloning and DNAsequence ofplasmid determinant iss, coding for increased serum survival and surfaceexclusion, which has homo I ogywith lambda DNA.MolGen Genet, 1989, 216(2-3): 287-292.Dho-Moul in M, Fairbrother.Avian pathogenic Escherichia coli(APEC).JVetRes, 1999, 30 (2-3):299-316.WooleyR E, SpearsK R, Brown J, et a.1 Relationshipof complement resistance and selected virulence factors in pathogenic avianEscherichia col1.Avian Dis, 1992，36(3):679-684.)。在文獻報道中出現(xiàn)過將 iss 基因原核表達產物GST-1ss融合蛋白抗血清能夠減弱菌株的血清抗性，對大腸桿菌強致病力株H02有抑制增值或殺滅作用(雞源致病性大腸桿菌iss基因原核產物的免疫保護作用.畜牧與獸醫(yī)，2010，(42) 11:84-86.樊琢，劉桂芹，王宇，李丹丹，李一經)。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供大腸埃希氏菌Escherichia coli及其制備方法,該大腸埃希氏菌具有更好的廣譜性和免疫效果。
[0007]本發(fā)明的整體技術構思是:
[0008]一種大腸埃希氏菌Escherichia coli,其保藏編號為CGMCC N0.8574。
[0009]本發(fā)明中涉及的大腸埃希氏菌(Escherichia coli), 申請人:已于2013年12月13日提交微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，該保藏單位的地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所內，該保藏機構的簡稱為CGMCC。
[0010] 申請人:對本發(fā)明中涉及的大腸埃希氏菌Escherichia coli CGMCC N0.8574進行了相關試驗，發(fā)現(xiàn)其具有如下理化特性:
[0011]1、伊紅美蘭培養(yǎng)基上37°C，培養(yǎng)16-18小時，形成粉紅色，或者暗粉紅色光澤的菌落，邊緣整齊，菌落直徑l_3mm。
[0012]2、有氨芐青霉素抗性。
[0013]3、在37°C由葡萄糖培養(yǎng)產酸產氣。
[0014]4、能發(fā)酵阿拉伯糖。
[0015]5、能發(fā)酵麥芽糖。
[0016] 大腸埃希氏菌Escherichia coli的制備方法,是將編碼禽大腸桿菌病病原菌外膜蛋白中經過克隆的iss基因片段，經過BamH I和Sal I雙酶切之后重組于表達質粒pEGX-6p-l,構建原核表達質粒pEGX-6p-l/iss ;將原核表達質粒pEGX_6p_l/iss轉化到大腸桿菌BL21-DE3中，構建重組大腸桿菌BL21-DE3/pEGX-6p-l/iss。
[0017]本發(fā)明的具體工藝步驟和工藝條件還有:
[0018]大腸埃希氏菌Escherichia coli的制備方法,包括如下工藝步驟:
[0019]A、培養(yǎng)02血清型大腸桿菌；
[0020]B、02血清型大腸桿菌質粒提取和純化；
[0021]C、PCR 擴增 iss 片段；
[0022]D、構建表達質粒載體pEGX_6p_l/iss ；
[0023]E、篩選陽性菌株。
[0024]所述的步驟A中的培養(yǎng)可以采用LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度37°C，轉速150轉/分鐘，周期18小時。
[0025]所述的步驟A中的培養(yǎng)還可以選用采用LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度37°C，周期18小時。
[0026]所述的步驟B中用質粒提取試劑盒提取02血清型大腸桿菌的質粒，用快速膠回收試劑盒純化02血清型大腸桿菌的質粒DNA。
[0027]所述的步驟C步驟C以 5 ' -cgcggatccaggattctgccgttttta-3 '為上游引物Pl,BamH I酶切位點為Pl中下劃線部分；以5 ' -cgcgtcgaccatatcgatgggcaacta-3丨為下游引物P2，Sal I酶切位點為P2中下劃線部分，以步驟B中純化后的02血清型大腸桿菌的質粒DNA為模板，采用PCR擴增iss片段。
[0028]所述步驟C中PCR反應體系如下:
[0029]
【權利要求】
1.一種大腸埃希氏菌，其特征在于其保藏編號為CGMCC N0.8574。
2.根據(jù)權利要求1所述的大腸埃希氏菌Escherichiacoli的制備方法,其特征在于是將編碼禽大腸桿菌病病原菌中經過克隆的iss基因片段，經過BamH I和Sal I雙酶切之后重組于表達質粒pEGX-6p-l，構建原核表達質粒pEGX-6p-l/iSS ;將原核表達質粒pEGX-6p-l/iss轉化到大腸桿菌BL21-DE3中，構建重組大腸桿菌BL21-DE3/pEGX_6p-l/isso
3.根據(jù)權利要求2所述的大腸埃希氏菌Escherichiacoli的制備方法,其特征在于包括如下工藝步驟: A、培養(yǎng)02血清型禽致病性大腸桿菌； B、02血清型大腸桿菌質粒提取和純化； C、PCR擴增iss片段； D、構建表達質粒載體pEGX-6p-l/iss； E、篩選陽性菌株。
4.根據(jù)權利要求3所述的大腸埃希氏菌Escherichiacoli的制備方法,其特征在于所述的步驟A中的培養(yǎng)采用LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度37°C，轉速150轉/分鐘，周期18小時。
5.根據(jù)權利要求3所述的大腸埃希氏菌Escherichiacoli的制備方法,其特征在于所述的步驟A中的培養(yǎng)采用LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度37°C，周期18小時。
6.根據(jù)權利要求3所述的大腸埃希氏菌Escherichiacoli的制備方法,其特征在于所述的步驟B中用質粒提取試劑盒提取02血清型大腸桿菌的質粒，用快速膠回收試劑盒純化02血清型大腸桿菌的質粒DNA。
7.根據(jù)權利要求3或4中任一項所述的大腸埃希氏菌Escherichiacoli的制備方法，其特征在于所述的步驟C以5 ' -cgcKgatccaggattctgccgttttta-3 ;為上游引物Pl,BamH I酶切位點為Pl中下劃線部分；以5 ' -cgcgtcgaccatatcgatgggcaacta-3丨為下游引物P2，Sal I酶切位點為P2中下劃線部分，以步驟B中純化后的02血清型大腸桿菌的質粒DNA為模板，采用PCR擴增iss片段。
8.根據(jù)權利要求7中所述的大腸埃希氏菌Escherichiacoli的制備方法,其特征在于所述步驟C中PCR反應體系如下:
9.根據(jù)權利要求3所述的大腸埃希氏菌Escherichia coli的制備方法,其特征在于所述步驟D中包括如下工藝步驟: Dl、利用雙酶切方法，酶切目的基因PCR產物片段，并純化PCR產物酶切片段； D2、利用雙酶切方法，酶切pEGX-6p-l，并純化pEGX_6p-l酶切片段； D3、連接構建表達質粒載體pEGX-6p-l/iss 步驟D3中連接體系如下:

【文檔編號】C12N1/21GK104004698SQ201410260536
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權日:2014年6月11日
【發(fā)明者】楊廣平, 陳淑芳, 馬興樹, 張鑫, 李忠鵬, 王洋, 武路剛 申請人:河北科星藥業(yè)有限公司