利用含有羥化酶的發(fā)酵液生產(chǎn)11α-羥基坎利酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用羥化酶通氣轉(zhuǎn)化生產(chǎn)11α-羥基坎利酮的方法，屬應(yīng)用微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。主要為解決在分批發(fā)酵中步驟繁瑣、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物吸附于菌絲體難以分離純化等問題。將可以產(chǎn)羥化酶的菌種加入到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時間待菌體生長粗壯后，對菌絲體進(jìn)行超聲破碎，然后進(jìn)行離心，得到的上清液即為轉(zhuǎn)化所需酶液。將一定濃度溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的坎利酮溶液，加入到酶液中，通入無菌空氣、保持?jǐn)嚢韬鸵欢囟冗M(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化結(jié)束后用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，萃取液進(jìn)行減壓蒸干，得到的干物質(zhì)即為轉(zhuǎn)化后的粗產(chǎn)物。該工藝步驟簡單，效率高，成本低，時間短。
【專利說明】利用含有羥化酶的發(fā)酵液生產(chǎn)11 α-羥基坎利酮的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用含有羥化酶的發(fā)酵液生產(chǎn)11α-羥基坎利酮的方法，屬于應(yīng) 用微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 坎利酮（Canrenone)是一種留體激素類心血管藥物，其化學(xué)名稱為（17 a )-17-羥 基-3-氧代孕_4,6-二烯-21-羧酸-γ -內(nèi)酯，臨床上用作醛固酮拮抗劑來治療心衰、高血 壓、水腫、肝腹水等心血管疾病。雖然其效果明顯，但危險性比較大，在心臟病治療中有可能 引起用藥過量而致死的危險后果。目前人們開始通過硝基化、羥基化等途徑，加緊研制其衍 生物，以期增強(qiáng)療效，減少副作用。而在人體內(nèi)發(fā)揮主要作用的是C n位羥基化的甾體底物。
[0003] 11 α -輕基坎利酮（11 a -Hydroxy-canrenone)是坎利酮輕基化反應(yīng)后形成的甾 體類衍生物，是臨床治療心血管疾病藥物依普利酮（Eplerenone)的關(guān)鍵醫(yī)藥中間體。依普 利酮是由11 α -羥基坎利酮出發(fā)經(jīng)六步化學(xué)反應(yīng)最終合成，于2002年4月獲得美國食品藥 物管理局（FDA)批準(zhǔn)，2003年由Pharmacia公司在美國上市。2003年Kelli L. Davis等研 究發(fā)現(xiàn)，依普利酮比起螺內(nèi)酯（Spironolactone)等，副作用明顯減少。因此，11 α -輕基坎 利酮作為合成依普利酮的重要中間體，有著顯著的市場需求。化學(xué)合成11 α -羥基坎利酮 步驟多，專一性不高，存在很多副反應(yīng)，產(chǎn)品純度及收率均較低，生物酶催化技術(shù)作為工業(yè) 生物技術(shù)可持續(xù)發(fā)展最有希望的技術(shù)之一，能有效克服化學(xué)合成法的不足。
[0004] 國內(nèi)目前對微生物轉(zhuǎn)化合成11 α -羥基坎利酮有部分研究和報道，所用的微生物 主要是赭曲霉、根霉等。例如專利（CN 1727494Α)和專利（CN 103255192Α)分別用赭曲霉（AS 3. 4411)和赭曲霉（TCCC41060)進(jìn)行發(fā)酵合成了 11 α -羥基坎利酮；專利（CN 101845474A) 用經(jīng)過波長為200nm-280nm紫外線照射10-30小時的赭曲霉，作為發(fā)酵合成11 α -羥基坎 利酮的微生物；2005年茅燕勇利用赭曲霉（NG0216)、葡枝根霉（NG0305)和粉紅單端孢霉 (NG0207)均進(jìn)行發(fā)酵合成了 11 α -羥基坎利酮，其用冷凝回流法對產(chǎn)物11 α -羥基坎利酮 進(jìn)行了提取，用三次重結(jié)晶法對提取的11 α -羥基坎利酮進(jìn)行了純化；2012年崔鳳杰等對 利用根霉sp. UJS-0602)發(fā)酵合成11 α -輕基坎利酮，并進(jìn)行分離提取。但是直 接利用微生物的酶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化合成11 α -羥基坎利酮鮮見有報道。
[0005] 由于坎利酮、11 α -羥基坎利酮在水中的溶解度極低，微生物轉(zhuǎn)化法產(chǎn)物11 α -羥 基坎利酮主要吸附在菌絲體表面，很難依靠過濾、離心或萃取單純的物理方法分離。轉(zhuǎn)化過 程中菌體仍會生長代謝，產(chǎn)生色素等副產(chǎn)物，使產(chǎn)率降低，產(chǎn)物中雜質(zhì)增多,給純化帶來一 定困難。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明先用菌體制備可轉(zhuǎn)化坎利酮生成含有能夠轉(zhuǎn)化生成11 α -羥基坎利酮的 羥化酶的發(fā)酵液，然后利用發(fā)酵液轉(zhuǎn)化坎利酮，生產(chǎn)11 α -羥基坎利酮，再對產(chǎn)物11 α -羥 基坎利酮進(jìn)行提取。
[0007] 本發(fā)明提供一種利用含有羥化酶的發(fā)酵液生產(chǎn)11 α -羥基坎利酮的方法，具體操 作如下： (1)斜面菌種制備： 生產(chǎn)菌種為根霉(肋辦即狀沙.UJS-0602, CICC3143,購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管 理中心)，將該菌接種到斜面培養(yǎng)基，25-31°C環(huán)境條件下恒溫培養(yǎng)4-8天后，待其表面布滿 孢子，然后轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，25-31°C環(huán)境條件下繼續(xù)恒溫培養(yǎng)4-8天后，待其表面布 滿孢子后，即得生產(chǎn)斜面。
[0008] (2)孢子懸浮液制備： 無菌條件下，將無菌水加入到生產(chǎn)斜面，洗下孢子，用無菌水調(diào)節(jié)孢子液，以得到濃度 為106-101(lCfu/mL的孢子懸浮液。
[0009] (3)搖瓶種子制備： 將孢子液加入裝有50-150mL新鮮無菌培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，接種量1-10%， 25-31°C、搖床轉(zhuǎn)速150-220r/min條件下培養(yǎng)12-48h后，制得種子液。
[0010] ⑷種子液制備： 將所得的搖瓶種子接入培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌的一級種子罐中，接種量1-10%，通入無菌空氣 培養(yǎng)，通氣量為0. 1-2. Ov/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為50-500r/min，控制溫度為28-31°C，培養(yǎng)12-48 小時后即得一級種子。將所得的一級種子接入培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌的二級種子罐中，接種量 1-10%，通入無菌空氣培養(yǎng)，通氣量為0. 1-2. Ov/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為50-500r/min，控制溫度為 28-31°C，培養(yǎng)12-48小時后即得二級種子。
[0011] (5)羥化酶液制備： 將所得的二級種子接入培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌的機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中，接種量1-10%，通入無 菌空氣培養(yǎng)，通氣量為〇. 1-2. Ον/ν/m，攪拌轉(zhuǎn)速為50-500r/min，控制溫度為28-31°C，培 養(yǎng)12-60小時后即得發(fā)酵液。將制得的發(fā)酵液在無菌條件下，進(jìn)行超聲處理，超聲頻率： Ι-lOkHZ，超聲時間5-30min。然后1000-15000r/min離心20-60min，所得上清液即為酶液。
[0012] (6)加坎利酮通氣轉(zhuǎn)化： 將所得的酶液置于經(jīng)過空消滅菌的機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中，加入坎利酮，使坎利酮在混合 液中的濃度為〇. l-10g/L，通入無菌空氣進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通氣量為0. 1-2. Ov/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為 50-500r/min，控制溫度為28-31°C，轉(zhuǎn)化24-108小時后結(jié)束。用等體積乙酸乙酯對所得轉(zhuǎn) 化液進(jìn)行萃取，高效液相（HPLC)檢測所得11 α -羥基坎利酮，純度可達(dá)90. 0-99. 5%。
[0013] 本方法中，根霉斜面培養(yǎng)基組分包括（g/L):葡萄糖22.0,酵母膏20.0,大豆蛋白 胨20. 0,瓊脂30. 0,用濃度為10%磷酸將pH調(diào)至5. 0。搖瓶種子、種子液、發(fā)酵液培養(yǎng)基組 分包括（g/L):葡萄糖15. 0-25. 0,酵母膏14. 5-20. 0,玉米漿30. 0-35. 0。
[0014] 11 α -羥基坎利酮用高效液相色譜（HPLC)檢測條件，色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 (150 _X4. 6 mm, 5 μ m);測定條件：甲醇-水為流動相，梯度洗脫40 min ; 流速：〇. 8 mL/min ;檢測波長280 nm ;柱溫：30°C ;進(jìn)樣量：5 μ L。采用外標(biāo)法計算公式計算 坎利酮和11-α-羥基坎利酮。轉(zhuǎn)化率計算方法：

【權(quán)利要求】
1. 利用含有羥化酶的發(fā)酵液生產(chǎn)11 α -羥基坎利酮的方法，其特征在于，按照以下步 驟進(jìn)行： (1) 斜面菌種制備： 生產(chǎn)菌種為根霉0?辦O/OTS 5/7. UJS-0602)，將該菌接種到斜面培養(yǎng)基，25-31°C環(huán)境條 件下恒溫培養(yǎng)4-8天后，待其表面布滿孢子，然后轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，25-31°C環(huán)境條件 下繼續(xù)恒溫培養(yǎng)4-8天后，待其表面布滿孢子后，即得生產(chǎn)斜面； (2) 孢子懸浮液制備： 無菌條件下，將無菌水加入到生產(chǎn)斜面，洗下孢子，用無菌水調(diào)節(jié)孢子液，以得到濃度 為106-101(lCfu/mL的孢子懸浮液； (3) 搖瓶種子制備： 將孢子液加入裝有50-150mL新鮮無菌培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，接種量1-10%， 25-31°C、搖床轉(zhuǎn)速150-220r/min條件下培養(yǎng)12-48h后，制得種子液； (4) 種子液制備： 將所得的搖瓶種子接入培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌的一級種子罐中，接種量1-10%，通入無菌空氣 培養(yǎng)，通氣量為0. 1-2. Ov/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為50-500r/min，控制溫度為28-31°C，培養(yǎng)12-48 小時后即得一級種子；將所得的一級種子接入培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌的二級種子罐中，接種量 1-10%，通入無菌空氣培養(yǎng)，通氣量為0. 1-2. Ov/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為50-500r/min，控制溫度為 28-31°C，培養(yǎng)12-48小時后即得二級種子； (5) 羥化酶液制備： 將所得的二級種子接入培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌的機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中，接種量1-10%，通入無 菌空氣培養(yǎng)，通氣量為〇. 1-2. Ον/ν/m，攪拌轉(zhuǎn)速為50-500r/min，控制溫度為28-31°C，培 養(yǎng)12-60小時后即得發(fā)酵液；將制得的發(fā)酵液在無菌條件下，進(jìn)行超聲處理，超聲頻率： Ι-lOkHZ，超聲時間5-30min ;然后1000-15000r/min離心20-60min，所得上清液即為酶液； (6) 加坎利酮通氣轉(zhuǎn)化： 將所得的酶液置于經(jīng)過空消滅菌的機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中，加入坎利酮，使坎利酮在混合 液中的濃度為〇. l-l〇g/L，通入無菌空氣進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通氣量為0. 1-2. Ov/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為 50-500r/min，控制溫度為28-31°C，轉(zhuǎn)化24-108小時后結(jié)束；用等體積乙酸乙酯對所得轉(zhuǎn) 化液進(jìn)行萃取，高效液相檢測所得11 α -羥基坎利酮，純度可達(dá)90. 0-99. 5%。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用含有羥化酶的發(fā)酵液生產(chǎn)11 α -羥基坎利酮的方法，其 特征在于，所述的根霉斜面培養(yǎng)基組分包括（g/L):葡萄糖22.0,酵母膏20.0,大豆蛋白胨 20. 0,瓊脂30. 0,用濃度為10%磷酸將pH調(diào)至5. 0 ;所述的搖瓶種子、種子液、發(fā)酵液培養(yǎng)基 組分包括（g/L):葡萄糖15. 0-25. 0,酵母膏14. 5-20. 0,玉米漿30. 0-35. 0。
【文檔編號】C12P33/20GK104046675SQ201410260970
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】管國強(qiáng), 黃達(dá)明, 孫文敬, 張志才, 崔鵬景, 崔鳳杰, 錢靜亞 申請人:江蘇大學(xué)