特異響應(yīng)逆境信號的nfiS基因的用途及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種特異響應(yīng)外界脅迫抗性的nfiS基因的用途及其使用方法。本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了nfiS基因?yàn)榭赊D(zhuǎn)錄的有功能性的非編碼RNA基因，以及該基因可作為功能元件轉(zhuǎn)入其他微生物并提高受體菌株的氧化脅迫抗性和鹽脅迫抗性這一成果，提供了特異響應(yīng)逆境信號的nfiS基因的用途及其使用方法，該方法構(gòu)建的具有攜帶nfiS基因的重組工程菌株，在高濃度的氧脅迫和高濃度的鹽脅迫下，相對于不含有nfiS基因的菌株相同條件下具有更高的生存率；nfiS基因在提高菌株氧化脅迫抗性和鹽脅迫抗性方面具有很大的應(yīng)用前景。
【專利說明】特異響應(yīng)逆境信號的nfiS基因的用途及其使用方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種特異響應(yīng)外界脅迫抗性的基因 的用途及其使用方法。 【背景技術(shù)】
[0002] 非編碼RNAs (non-coding RNAs, ncRNAs)是一類非常重要的調(diào)節(jié)子，此類調(diào)節(jié)子 能夠使細(xì)胞調(diào)節(jié)它們的生理特性而適應(yīng)環(huán)境的改變。已有的研究表明ncRNAs在細(xì)菌的蔗 糖代謝、細(xì)胞外膜應(yīng)激反應(yīng)、群體感應(yīng)和細(xì)菌毒力等方面發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，其調(diào)控模 式已經(jīng)成為細(xì)菌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要"分支"。
[0003] 生物固氮是固氮微生物的一種特殊的生理功能，已知具固氮作用的微生物約近50 個(gè)屬，包括細(xì)菌、放線菌和藍(lán)細(xì)菌（即藍(lán)藻)，它們在生活方式、固氮作用類型等發(fā)面都有著 較大區(qū)別。由于固氮條件本身是一個(gè)對碳、氮和氧要求較為嚴(yán)格的脅迫環(huán)境，而固氮微生物 中開展非編碼RNA功能研究的報(bào)道不多，因此非編碼RNA在固氮微生物環(huán)境適應(yīng)性方面發(fā) 揮著怎樣的作用目前仍未知。
[0004] 固氮施氏假單胞菌的非編碼RNA/7/沉序列(基因序列為SEQ ID NO: 1)中，沒有起始 密碼子和終止密碼子，現(xiàn)有技術(shù)中沒有發(fā)現(xiàn)其能轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA，也沒有其用途方面的相 關(guān)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種特異響應(yīng)抗性的/7/沉基因的用途及其使用方法。發(fā)明人在進(jìn)行施 氏假單胞菌基因組研究過程中，首次發(fā)現(xiàn)了 基因?yàn)榭赊D(zhuǎn)錄的 有功能性的非編碼RNA基因，并發(fā)現(xiàn)該基因可用于提高菌株氧化脅迫抗性和鹽脅迫抗性， 為獲得具有高效固氮活性和脅迫抗性的工程菌及其改造提供新的研究方向和理論基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明中，所述/7/沉基因即為參與固氮施氏假單胞菌脅迫應(yīng)答反應(yīng)的非編碼RNA 基因，其是經(jīng)核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的DNA轉(zhuǎn)錄而成的非編碼RNA基因。
[0007] -種特異響應(yīng)逆境信號的/7/沉基因的用途，所述/7/沉基因用于提高菌株氧化脅迫 抗性和/或鹽脅迫抗性。
[0008] 上述方案優(yōu)選的是，所述基因是經(jīng)核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的DNA轉(zhuǎn)錄而成 的非編碼RNA基因。
[0009] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述菌株為固氮施氏假單胞菌或大腸桿菌及其衍生菌 株。
[〇〇1〇] 一種利用基因提高菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的方法，包括克隆完 整的/?々；?基因的DNA片段序列和構(gòu)建具有氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的重組菌株的步 驟。
[0011] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述/7/沉基因是經(jīng)核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的DNA轉(zhuǎn)錄 而成的非編碼RNA基因。
[0012] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述克隆完整的/7/沉基因的DNA序列包括從施氏假單胞 菌Μ?&--ΓΥ)基因組中通過PCR擴(kuò)增出完整的/?//；?基因的DNA片段序列。
[0013] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述構(gòu)建具有氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的重組菌 株的步驟為： (1) 將克隆出的完整的基因的DNA片段序列進(jìn)行酶切； (2) 將酶切后的/7/沉基因的DNA片段序列插入到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處； (3) 將步驟（2)中的載體通過熱激轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到菌株中，構(gòu)建重組表達(dá)菌株，即具 有氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的重組菌株。
[0014] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述酶切是用及?ΗΙ和歷ii/III酶進(jìn)行雙酶切。
[0015] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述表達(dá)載體是pLAFR3載體。
[0016] 上述任一方案優(yōu)選的是，所述菌株為固氮施氏假單胞菌或大腸桿菌及其衍生菌 株。
[0017] 上述任一方案優(yōu)選的是，在步驟（2)中，還包括在表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處插入驗(yàn) 證基因。
[0018] 上述任一方案優(yōu)選的是，包含所述驗(yàn)證基因的表達(dá)載體為四環(huán)素抗性。
[0019] 一種通過利用/7/7；?基因提高菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的方法構(gòu)建的重 組菌株。
[0020] 本發(fā)明中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)條 件。
[0021] 本發(fā)明所述的特異響應(yīng)逆境信號的/7/沉基因的發(fā)明途徑為： 1、非編碼RNA對特異信號的響應(yīng)體外表達(dá)分析表明/7/沉基因能夠特異的響應(yīng)氧脅迫信 號。
[0022] 固氮施氏假單胞菌A1501 0°. A1501)中/7/7；?基因?qū)ρ趺{迫信號的響應(yīng)， 實(shí)驗(yàn)步驟如下： (1) 將施氏假單胞菌A1501菌在LB液體培養(yǎng)基中活化，30° C過夜培養(yǎng)； (2) 次日4000 rpm離心lOmin收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體兩次； (3) 用生理鹽水懸浮菌體，調(diào)0D6QQ ~ 1. 0 ; (4) 分別將菌體在以下幾個(gè)時(shí)相中培養(yǎng)：有氮好氧條件（CN0，K培養(yǎng)基)、無氮微好氧條 件（CN_0_，K培養(yǎng)基中不添加氮源，并且充氬氣排空氣三分鐘，然后注入0. 5%的氧氣)、氧限 制條件（CK0_，K培養(yǎng)基中不添加氮源，并且充氬氣排空氣三分鐘)、好氧條件（CN_0, K培養(yǎng) 基不添加氣源)，調(diào)〇D6(i(i 0. 5 ; (5) 培養(yǎng)液30°C震蕩培養(yǎng)0· 5 h后，8000 rpm離心5 min，收集菌體； (6) 采用Promega大量提取RNA試劑盒Z3741提取細(xì)菌總RNA，將使用量相同的樣品 RNA進(jìn)行單鏈DNA (cDNA)反轉(zhuǎn)。
[0023] (7)通過qRT-PCR方法對/7/沉基因在不同脅迫條件下的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，結(jié) 果如圖1所示，圖1中：縱坐標(biāo)表示基因在mRNA水平上的相對表達(dá)量，橫坐標(biāo)代表/?形 基因。其中黑色柱狀圖代表氧充足條件下/7/沉基因的表達(dá)量；網(wǎng)格柱狀圖代表氧限制條件 下/7/沉基因的表達(dá)量；灰色柱狀圖代表有氮有氧條件下/7/沉基因的表達(dá)量；斜格柱狀圖代 表無氮微好氧條件下基因的表達(dá)量. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：固氮施氏假單胞菌A1501的全基因組中含有/7/沉基因的DNA序列，從 圖1中可以看出，氧限制條件下（CND/7形基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，與好氧條件（CO)相 比提高了 338倍；此外，與有氮好氧條件（CNO)相比，在無氮微好氧條件下（CN^n/7/沉的轉(zhuǎn) 錄水平也顯著提高了近8倍，表明/7/沉基因能夠特異的感應(yīng)氧脅迫信號。
[0024] 2、/?//；?生物信息學(xué)分析Rfam數(shù)據(jù)庫和GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLASTN比對分析表明 （DNA序列如SEQ ID NO: 1所示）基因?qū)儆谝活惥哂蟹N特異性的功能仍未確定的RNA家 族(如圖2所示)。
[0025] 基因生物信息學(xué)分析： 在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了/7/7；?基因的編碼序列（DNA序列如SEQ ID N0:1所示)，將/7/7；? 的核苷酸序列在Rfam數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了比對，發(fā)現(xiàn)/7/沉的序列與數(shù)據(jù)庫中的RNA家族中 的任何成員不存在同源性，這表明可能屬于一類新的功能仍未確定的RNA家族；而 GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLASTN比對則進(jìn)一步顯示/?形的同源序列僅僅在四株施氏假單胞菌 0°· stoizeriDSIMiee，/7· ATCC17588，/7· CCUG29243 和/"· RCH2) 中存在(如圖2)，這說明/7/沉是一類功能未知的具有種特異性的非編碼RNA。
[0026] 3、/7/沉突變株的構(gòu)建分別將包含該非編碼RNA上下游同源基因序列的自殺載體轉(zhuǎn) 至A A1501中，利用同源重組的原理獲得/?//；?的缺失突變株A15 Λ/?，/；?。
[0027] 4、/?形表達(dá)載體的構(gòu)建：首先PCR擴(kuò)增獲得完整的/?形DNA片段，然后將克隆片 段進(jìn)行和沒雙酶切，插入到廣宿主表達(dá)載體pLAFR3的多克隆位點(diǎn)處，最后 將/7/7；?表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌TranslO中獲得具有四環(huán)素抗性的重組表達(dá)菌株凡coh Trans 10 (/?形)。
[0028] 5、氧化脅迫抗性的影響H202沖擊實(shí)驗(yàn)顯示/7/7；?基因的缺失能夠降低A1501菌在氧 化脅迫條件下的生存率，與野生型相比菌株生存率降低了一個(gè)數(shù)量級，而qRT-PCR結(jié)果進(jìn) 一步證明/7/沉的缺失能夠降低氧化脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，推測/7/沉可能通過對氧信號 的響應(yīng)參與到了固氮施氏假單胞菌A1501氧化脅迫抗性的調(diào)控過程。此外，/7/沉基因的重 組表達(dá)能夠顯著提高大腸桿菌TranslO的氧化脅迫抗性，說明該基因在提高菌株氧化脅迫 抗性方面具有很大的應(yīng)用前景。
[0029] 6、鹽脅迫抗性的影響鹽沖擊實(shí)驗(yàn)表明/7/7；?基因的缺失也能夠降低A1501菌株在鹽 脅迫條件下的生存率，與野生型相比生存率降低了一個(gè)數(shù)量級，表明除了影響固氮施 氏假單胞菌A1501氧化脅迫抗性以外，也可能參與到了菌株滲透調(diào)節(jié)機(jī)制的反應(yīng)過程。
[0030] 發(fā)明人通過上述途徑發(fā)現(xiàn)了 /7/沉基因?yàn)榭赊D(zhuǎn)錄的有功能性的非編碼RNA基因，該 基因可作為功能元件轉(zhuǎn)入其他微生物并提高受體菌株的氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性， 為獲得具有高效固氮活性和脅迫抗性的工程菌及其改造提供新的研究方向和理論基礎(chǔ)，同 時(shí)填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中沒有發(fā)現(xiàn)基因能轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA的空白。本發(fā)明中構(gòu)建的具有 /?，/；?基因的重組菌株，在高濃度的氧脅迫下和/或高濃度的鹽脅迫下，生存率較高，相同條 件下，不含/?々；?基因的菌株存活率低了很多;/?々；?基因在提高菌株氧化脅迫抗性和鹽脅迫抗 性方面具有很大的應(yīng)用前景。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為按照本發(fā)明特異響應(yīng)逆境信號的/7/沉基因的用途及其使用方法中/7/沉基因 對特異信號響應(yīng)的分析。
[0032] 圖2為按照本發(fā)明特異響應(yīng)逆境信號的/7/沉基因的用途及其使用方法中固氮施氏 假單胞菌A1501中/7/沉基因的比對分析。
[0033] 圖3為按照本發(fā)明特異響應(yīng)逆境信號的/7/沉基因的用途及其使用方法一優(yōu)選實(shí)施 例中施氏假單胞菌A1501和/7/沉缺失突變株A15 Λ/7/7；?對氧化脅迫敏感性的比較。
[0034] 圖4為按照本發(fā)明特異響應(yīng)逆境信號的/7/沉基因的用途及其使用方法一優(yōu)選實(shí)施 例中/7/沉基因缺失對施氏假單胞菌A1501氧化脅迫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。
[0035] 圖5為按照本發(fā)明特異響應(yīng)逆境信號的/7/沉基因的用途及其使用方法一優(yōu)選實(shí)施 例中大腸桿菌Trans 10和重組表達(dá)菌株凡co/iTrans 10 (/7/Z?)氧化脅迫敏感性的比較。
[0036] 圖6為按照本發(fā)明特異響應(yīng)逆境信號的/7/沉基因的用途及其使用方法一優(yōu)選實(shí)施 例中施氏假單胞菌A1501〇°. A1501)和/?//；?缺失突變株Α15Λ/7/7；?在高濃度鹽沖 擊條件下存活率的比較。 【具體實(shí)施方式】
[〇〇37] 為了進(jìn)一步了解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做更為詳細(xì)地闡述；實(shí)施 例僅用于舉例說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具 體操作過程中，在發(fā)明的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要做一些非實(shí)質(zhì)性地 修改，這些修改都應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[〇〇38] 實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條 件，例如 Sambrook 等分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0039] 實(shí)施例1 一、固氮施氏假單胞菌A1501 (A A1501)中/7/7；?基因缺失突變株的構(gòu)建： 首先利用融合PCR技術(shù)將目的基因的上游片段、壯觀霉素抗性盒基因以及目的基因的 下游片段融合成一大小約為2. 3 kb的長片段，然后將克隆片段進(jìn)行和雙酶 切，連接到自殺載體pK18mobSacB上。將構(gòu)建好的自殺重組質(zhì)粒通過三親結(jié)合的方法導(dǎo)入 到野生型A1501菌中，通過與染色體上基因的同源重組將自殺質(zhì)粒整合到了染色體上，利 用抗性篩選和PCR驗(yàn)證得到單交換菌株，然后根據(jù)基因在10%蔗糖選擇壓下致死的特 性，將經(jīng)過PCR驗(yàn)證的單交換克隆按照10'ΚΓ 4和ΚΓ5的稀釋梯度分別涂布在含有10%蔗 糖的壯觀霉素抗性的LB平板，進(jìn)行雙交換的篩選，經(jīng)PCR驗(yàn)證得到目的基因/7/沉的缺失突 變菌株 Α15 Λ/7/7；?。
[0040] 二、利用/7/7；?基因提高大腸桿菌TranslO菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的 方法，包括克隆完整的基因的DNA片段序列和構(gòu)建具有氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗 性的突變菌株。
[0041] 本實(shí)施例中，所述基因是經(jīng)核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的DNA轉(zhuǎn)錄而成的非編 碼RNA基因。
[0042] 本實(shí)施例中，所述克隆完整的/?形基因的DNA序列包括從施氏假單胞菌 Μ?&--ΓΥ)基因組中通過PCR擴(kuò)增出完整的/?形基因的DNA片段序列，PCR擴(kuò) 增特異性引物序列為：ncRNAOICBF -SEQ ID Ν0:2 和 ncRNAOlCHR -SEQ ID Ν0:3。
[0043] 本實(shí)施例中，所述構(gòu)建具有氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的大腸桿菌TranslO 重組菌株的步驟為： (1) 將克隆出的完整的基因的DNA片段序列進(jìn)行酶切； (2) 將酶切后的/7/沉基因的DNA片段序列插入到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處； (3) 將步驟（2)中的載體通過熱激轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到菌株中，構(gòu)建重組表達(dá)菌株，即具 有較高氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的大腸桿菌TranslO重組菌株。
[0044] 本實(shí)施例中，所述酶切是用和Λ?/^ΙΙΙ酶進(jìn)行雙酶切，所述表達(dá)載體是 PLAFR3 載體。
[0045] 本實(shí)施例中，在步驟（2)中，還包括在表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處插入驗(yàn)證基因。含 有所述驗(yàn)證基因的表達(dá)載體為四環(huán)素抗性。
[0046] 三、基因?qū)κ┦霞賳伟?501和大腸桿菌TranslO菌株脅迫抗性的影響： 所用的菌液：野生型施氏假單胞菌A15 01、本實(shí)施例中制備的缺失突變菌株 Α15Δ/?々5、本實(shí)施例中制備的大腸桿菌重組菌株凡coJ7TranslO (/?形)、野生型大腸桿菌 E. coli Trans 10 〇
[0047] 在固體平板上挑取單菌落在液體LB培養(yǎng)基中分別過夜培養(yǎng)，次日轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng) 基中使〇D 6(l(l約為0. 1，30°C培養(yǎng)2-3 h，至0D6(KI約0. 6左右。首先各取1 ml菌體，稀釋到10_4 為空白對照，然后再各取1 ml菌體加入終濃度為20 mM H202沖擊10 min，或加入終濃度1. 5 MNaCl沖擊60min，最后將每個(gè)處理稀釋至10_4,取8 μ 1點(diǎn)到LB固體平板上，30°C或37°C 過夜培養(yǎng)。
[0048] 本發(fā)明首先收集20 mM H202沖擊10 min的A1501、A15 Λ/?形菌株，然后采用 Promega大量提取RNA試劑盒Z3741提取細(xì)菌總RNA，將使用量相同的樣品RNA進(jìn)行單鏈 DNA(cDNA)反轉(zhuǎn)，最后利用qRT-PCR技術(shù)對菌株中氧化脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。
[0049] 氧化脅迫抗性的影響H202沖擊實(shí)驗(yàn)顯示： 1、/?々；？基因的缺失能夠降低A1501菌在氧化脅迫條件下的生存率，與野生型相比菌株 生存率降低了一個(gè)數(shù)量級，如圖3所示。
[0050] 2、qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步證明/?//；?的缺失能夠降低A1501菌中氧化脅迫相關(guān)基因 的轉(zhuǎn)錄水平，如圖4所示。表明/7/沉可能通過對氧信號的響應(yīng)參與到了固氮施氏假單胞菌 A1501氧化脅迫抗性的調(diào)控過程。
[0051] 3、/7/沉基因的重組表達(dá)能夠顯著提高大腸桿菌TranslO的氧化脅迫抗性，如圖5所 示。表明該基因在提高菌株氧化脅迫抗性方面具有一定的應(yīng)用前景。
[0052] 4、施氏假單胞菌Α1501〇°. Μ?&--τΥΑΙδΟΙ)和/?形缺失突變株Α15Λ/?形在高濃度 鹽沖擊條件下存活率的比較，如圖6所示。從圖中可以得出，/7/沉缺失突變株Α15 Λ/7/沉在 高濃度鹽沖擊條件下存活率低于施氏假單胞菌A1501〇°. ste&eriAlSOl)的存活率，說明 /?，/；?基因的缺失也能夠降低A1501菌株在鹽脅迫條件下的生存率，與野生型相比生存率降 低了一個(gè)數(shù)量級，這表明除了影響固氮施氏假單胞菌A1501氧化脅迫抗性以外，也參與 到了菌株滲透調(diào)節(jié)機(jī)制的反應(yīng)過程，可見，該基因在提高菌株鹽脅迫抗性方面具有一定的 應(yīng)用前景。
[0053] 實(shí)施例2 一種特異響應(yīng)逆境信號的基因的用途，所述基因用于提高固氮施氏假單胞菌 A1501菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性；所述/7/沉基因是經(jīng)核苷酸序列為SEQ ID NO: 1 的DNA轉(zhuǎn)錄而成的非編碼RNA基因。
[0054] -種利用形基因提高菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的方法，包括克隆完 整的/?々；?基因的DNA片段序列和構(gòu)建具有氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的重組菌株的步 驟；所述/?/沉基因是經(jīng)核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的DNA轉(zhuǎn)錄而成的非編碼RNA基因。
[0055] 本實(shí)施例中，所述克隆完整的/?形基因的DNA序列包括從施氏假單胞菌 Μ?&--ΓΥ)基因組中通過PCR擴(kuò)增出完整的/?//；?基因的DNA片段序列。
[0056] 本實(shí)施例中，所述構(gòu)建具有氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的重組菌株的步驟 為： (1) 將克隆出的完整的基因的DNA片段序列進(jìn)行酶切； (2) 將酶切后的/7/沉基因的DNA片段序列插入到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處； (3) 將步驟（2)中的載體通過熱激轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到野生型大腸桿菌Trans 10中，構(gòu)建 重組表達(dá)菌株，即具有較高氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的重組菌株。
[0057] 本實(shí)施例中，所述酶切是用和Λ?/^ΙΙΙ酶進(jìn)行雙酶切；所述表達(dá)載體是 PLAFR3 載體。
[0058] 本實(shí)施例中，在步驟（2)中，還包括在表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處插入驗(yàn)證基因；包 含所述驗(yàn)證基因的表達(dá)載體為四環(huán)素抗性。
[0059] 本實(shí)施例中，野生型固氮施氏假單胞菌Α1501菌株中具有/7/沉基因，其本身具有較 高氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性，通過本發(fā)明的利用/?々；?基因提高菌株氧化脅迫抗性和/ 或鹽脅迫抗性的方法，制備的重組菌株，相比于野生型大腸桿菌TranslO,其耐氧化脅迫和 /或鹽脅迫抗性得到了很大的提高。
[0060] 本發(fā)明中發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了/7/沉基因?yàn)榭赊D(zhuǎn)錄的有功能性的非編碼RNA基因，且該基 因可作為功能元件轉(zhuǎn)入其他微生物并提高受體菌株的氧化脅迫抗性和鹽脅迫抗性，為獲得 具有高效固氮活性和脅迫抗性的工程菌及其改造提供新的研究方向和理論基礎(chǔ)，填補(bǔ)了現(xiàn) 有技術(shù)中沒有發(fā)現(xiàn)/?/沉基因能轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA的空白。本發(fā)明中構(gòu)建的具有/7/沉基因 的重組菌株，在高濃度的氧脅迫下和高濃度的鹽脅迫下，生存率較高，相同條件下，不含/?，/；? 基因的菌株存活率低了很多;/?/沉基因在提高菌株氧化脅迫抗性和鹽脅迫抗性方面具有很 大的應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1. 一種特異響應(yīng)逆境信號的基因的用途，所述基因用于提高菌株氧化脅迫抗 性和/或鹽脅迫抗性。
2. 如權(quán)利要求1所述的特異響應(yīng)逆境信號的/7形基因的用途，其特征在于，所述/7形基 因是經(jīng)核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的DNA轉(zhuǎn)錄而成的非編碼RNA基因。
3. 如權(quán)利要求1所述的特異響應(yīng)逆境信號的形基因的用途，其特征在于，所述菌株為 固氮施氏假單胞菌或大腸桿菌及其衍生菌株。
4. 一種利用/7/沉基因提高菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的方法，包括克隆完整 的/7/7；?基因的DNA片段序列和構(gòu)建具有氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的重組菌株的步 驟。
5. 如權(quán)利要求4所述的利用/7/沉基因提高菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的方 法，其特征在于，所述/?々；?基因是經(jīng)核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的DNA轉(zhuǎn)錄而成的非編碼RNA 基因。
6. 如權(quán)利要求4所述的利用/7/沉基因提高菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的方 法，其特征在于，所述克隆完整的/7/沉基因的DNA序列包括從施氏假單胞菌基因組中通過 PCR擴(kuò)增出完整的/7/沉基因的DNA片段序列。
7. 如權(quán)利要求4所述的利用/7/沉基因提高菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的方 法，其特征在于，所述構(gòu)建具有氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的重組菌株的步驟為： (1) 將克隆出的完整的基因的DNA片段序列進(jìn)行酶切； (2) 將酶切后的/7/沉基因的DNA片段序列插入到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處； (3) 將步驟（2)中的載體通過熱激轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到菌株中，構(gòu)建重組表達(dá)菌株，即具 有氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的重組菌株。
8. 如權(quán)利要求7所述的利用/7/沉基因提高菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的方 法，其特征在于，所述酶切是用SaMH和Λ?/^ΙΙΙ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。
9. 如權(quán)利要求7所述的利用/7/沉基因提高菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的方 法，其特征在于，所述表達(dá)載體是PLAFR3載體。
10. 如權(quán)利要求7所述的利用/7/沉基因提高菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的方 法，其特征在于，所述菌株為固氮施氏假單胞菌或大腸桿菌及其衍生菌株。
【文檔編號】C12N1/21GK104046635SQ201410262604
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】燕永亮, 戰(zhàn)崳華, 鄧志平, 陸偉, 林敏 , 張新雄, 王亞君 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 東莞市保得生物工程有限公司