一種塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種食用菌塊菌液體發(fā)酵工藝，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。所述工藝解決了人工栽培菌塊周期長、成本高等問題，其具體步驟：將塊菌菌種接種于PDA培養(yǎng)基在22-27℃下培養(yǎng)5-10天；然后轉(zhuǎn)接入裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶，置于轉(zhuǎn)速100-180r/min的搖床中培養(yǎng)5-8天得液體菌種，溫度為22-27℃；將液體菌種接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得到塊菌菌絲體，發(fā)酵條件：攪拌速度200r/min，溶氧50％，pH值6.0-8.0，溫度22-27℃，時間5-8天，塊菌菌絲體經(jīng)提取制得塊菌多糖。所述工藝降低了生產(chǎn)成本，通過特定的培養(yǎng)基，顯著提高塊菌胞外和胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量，有利于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。
【專利說明】一種塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種食用菌塊菌液體發(fā)酵工藝，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]塊菌與魚子醬、鵝肝醬，在歐美被稱為三大珍品，在歐洲國家領(lǐng)袖在國際交往中是非常流行的食品，是世界公認(rèn)的頂級食品。塊菌的子囊果呈球形、半球形或塊狀，直徑一般在1.5-12厘米，成熟后為褐色、紅褐色至深褐色，基部常凹陷，表面布以大小不一的小疣。塊菌富含17種氨基酸、8種維生素、適量的蛋白質(zhì)、以及雄性酮、留醇、鞘脂、脂肪酸、氨基酸及微量元素等50余種生理活性成分，據(jù)研究，塊菌多糖作為一個新的真菌多糖，毒性低、水溶性好、抑制腫瘤作用明顯，是抗腫瘤免疫療法的藥物。
[0003]塊菌作為一種生長于地下的藥食兩用真菌，在自然界中要求生長于堿性土壤、氣候溫和的環(huán)境，同時與橡樹、櫟樹等樹種的根系共生，苛刻的生長條件直接導(dǎo)致了其天然產(chǎn)量的供不應(yīng)求。為了彌補(bǔ)塊菌天然產(chǎn)量的不足有不少學(xué)者進(jìn)行了半人工模擬栽培的研究，但是人工栽培存在周期長，一般需要7-9年，需要耗費(fèi)大量的人力和物理，成本高，且受環(huán)境條件影響大，在一定程度上限制了對其開發(fā)利用，而采用液體發(fā)酵技術(shù)是目前深度開發(fā)食用菌活性成分的有效方法，并已成功在靈芝、香菇等珍稀食藥用菌實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，但是目前塊菌液體發(fā)酵的研究報(bào)道較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種發(fā)酵成本低，菌絲生產(chǎn)效率高的塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝。
[0005]本發(fā)明上述的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝，所述的工藝包括如下步驟:
[0006]S1、斜面菌種活化培養(yǎng):將塊菌菌種接種于PDA培養(yǎng)基上,進(jìn)行斜面菌種的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22-27°C，培養(yǎng)時間5-10天；
[0007]S2、液體菌種的制備:挑取步驟SI中活化好的斜面菌種，將其轉(zhuǎn)接入裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床中培養(yǎng)制得液體菌種，培養(yǎng)條件為:溫度為22_27°C，搖床轉(zhuǎn)速為100-180r/min，培養(yǎng)時間為5_8天；所述液體培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:15_25g/L，酵母:1.5-2.5g/L，麥芽提取物:2.5-7.5g/L, KH2PO4:0.5-1.5g/L, MgSO4.7H20:0.25-0.75g/L，維生素BI:100 μ g/L,余量為蒸懼水，pH值為6.0-8.0 ；
[0008]S3、液體發(fā)酵培養(yǎng):將步驟S2中制得的液體菌種接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得到塊菌菌絲體，經(jīng)提取制得塊菌多糖；其中，發(fā)酵條件為:攪拌速度為200r/min，溶氧為50%，pH值為6.0-8.0，溫度22_27°C，時間5_8天；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:15-25g/L，麥芽提取物:2.5-7.5g/L，KH2PO4:0.5-1.5g/L, MgSO4.7H20:0.25-0.75g/L，水解乳蛋白:25-35g/L，維生素B1: 100 μ g/L，余量為蒸餾水。
[0009]在本發(fā)明塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝步驟S2中若搖床轉(zhuǎn)速太慢，培養(yǎng)基中的溶解氧就不足，很快就會影響菌絲生長。若培養(yǎng)時間太短，菌絲還沒生長，塊菌多糖的產(chǎn)量極低，而培養(yǎng)時間太長培養(yǎng)基營養(yǎng)不夠，菌絲容易自溶，反而影響最終塊菌多糖的收率。而培養(yǎng)的溫度、PH太高或太低都會抑制菌絲的生長，從而影響塊菌多糖的收率。
[0010]步驟S3中的溶氧、pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間都直接影響著塊菌的生長，過高或者過低都會降低最終產(chǎn)物的收率，因此，本發(fā)明塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝中將步驟S3中的發(fā)酵條件嚴(yán)格控制為攪拌速度200r/min，溶氧50%，pH值6.0-8.0，溫度22_27°C，時間5-8天。
[0011]作為優(yōu)選，在上述塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝中，步驟SI中所述的塊菌菌種為印度塊菌(TuberIndicum)、臺灣原生塊菌(TuberFormosanum)、意大利白塊菌(TuberMagnatum)、法國黑抱塊菌(TuberMelanosporum)、假凹陷塊菌(TuberPseudoexcavatum)中的一種或多種。這些塊菌菌種均可通過商業(yè)途徑購買得到。
[0012]作為優(yōu)選，在上述塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝中，步驟S2中所述的液體培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:20g/L，酵母:2.0g/L，麥芽提取物:5.0g/L, KH2PO4:1.0g/L,MgSO4.7H20:0.5g/L，維生素 B1: 100 μ g/L，余量為蒸餾水。 [0013]作為優(yōu)選，在上述塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝中，步驟S3中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:20g/L,麥芽提取物:5.0g/L, KH2PO4:1.0g/L, MgSO4.7H20:
0.5g/L，維生素BI dOOyg/L，水解乳蛋白:30g/L，余量為蒸餾水。
[0014]作為優(yōu)選，在上述塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝中，步驟S3中所述的接種量為 200-800mg/L。
[0015]作為參考:所述的PDA瓊脂培養(yǎng)基為:MgS04.7H20:0.15g/L，KH2PO4:0.30g/L,葡萄糖:20g/L，維生素BI:0.05g/L，土豆:200g/L。所述PDA瓊脂培養(yǎng)基可通過商業(yè)途徑購買得到。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0017](I)、本發(fā)明避免了從價格昂貴的塊菌子實(shí)體中提取多糖過程中原料有限等不利因素，大大降低了生產(chǎn)成本。
[0018](2)、本發(fā)明通過特定的培養(yǎng)基，有效促進(jìn)細(xì)胞生長，提高生物量，顯著提高塊菌胞外和胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量，可達(dá)2.5g/L，有利于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
[0020]實(shí)施例1
[0021]斜面菌種活化培養(yǎng):將塊菌菌種接種于PDA培養(yǎng)基上,進(jìn)行斜面菌種的培養(yǎng),培養(yǎng)溫度23°C，培養(yǎng)時間7天；
[0022]液體菌種的制備:挑取上述活化好的斜面菌種，將其轉(zhuǎn)接入裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床中培養(yǎng)制得液體菌種，培養(yǎng)條件為:溫度為23°C，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，培養(yǎng)時間為6天；所述液體培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:20g/L，酵母:2.0g/L，麥芽提取物:5.0g/L, KH2PO4:1.0g/L, MgSO4.7H20:0.50g/L，維生素 B1: 100 μ g/L，余量為蒸餾水，pH值為 6.0-8.0 ；[0023]液體發(fā)酵培養(yǎng):將上述制得的液體菌種接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得到塊菌菌絲體，初始接種量為500mg/L，發(fā)酵條件為:攪拌速度為200r/min，溶氧為50%，初始pH值為6.0，溫度23°C，時間7天；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:20g/L，麥芽提取物:5.0g/L, KH2PO4:1.0g/L, MgSO4.7H20:0.50g/L，水解乳蛋白:30g/L，維生素BI: 100 μ g/L,余量為蒸懼水；
[0024]將上述制得的塊菌菌絲體在50°C下干燥至恒重，研磨成粉末，取100mg，用15mL85%的乙醇在60°C下浸提30min，重復(fù)兩次，去除單糖、雙糖、低聚糖等干擾成分，再于沸水浴中浸提lh, 5000r/min離心15min,取上清液定容至100mL,濃硫酸-苯酹法測定多糖含量為2.6g/L。
[0025]實(shí)施例2
[0026]斜面菌種活化培養(yǎng):將塊菌菌種接種于PDA培養(yǎng)基上,進(jìn)行斜面菌種的培養(yǎng),培養(yǎng)溫度25°C，培養(yǎng)時間6天；
[0027]液體菌種的制備:挑取上述活化好的斜面菌種，將其轉(zhuǎn)接入裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床中培養(yǎng)制得液體菌種，培養(yǎng)條件為:溫度為24°C，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，培養(yǎng)時間為5天；所述液體培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:25g/L，酵母:1.8g/L，麥芽提取物:3.0g/L, KH2PO4:1.2g/L，MgSO4.7H20:0.60g/L，維生素 B1: 100 μ g/L，余量為蒸餾水，pH值為 6.0-8.0 ；
[0028]液體發(fā)酵培養(yǎng):將上述制得的液體菌種接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得到塊菌菌絲體，初始接種量為500mg/L，發(fā)酵條件為:攪拌速度為200r/min，溶氧為50%，初始pH值為6.0，溫度24°C，時間5天；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:25g/L，麥芽提取物:3.0g/L, KH2PO4:1.2g/L, MgSO4.7H20:0.60g/L，水解乳蛋白:28g/L，維生素BI: 100 μ g/L,余量為蒸懼水；
[0029]將上述制得的塊菌菌絲體在50°C下干燥至恒重，研磨成粉末，取100mg，用15mL85%的乙醇在60°C下浸提30min，重復(fù)兩次，去除單糖、雙糖、低聚糖等干擾成分，再于沸水浴中浸提lh, 5000r/min離心15min,取上清液定容至IOOmL,濃硫酸-苯酹法測定多糖含量為2.4g/L。
[0030]實(shí)施例3
[0031]斜面菌種活化培養(yǎng):將塊菌菌種接種于PDA培養(yǎng)基上,進(jìn)行斜面菌種的培養(yǎng),培養(yǎng)溫度22°C，培養(yǎng)時間8天；
[0032]液體菌種的制備:挑取上述活化好的斜面菌種，將其轉(zhuǎn)接入裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床中培養(yǎng)制得液體菌種，培養(yǎng)條件為:溫度為26°C，搖床轉(zhuǎn)速為170r/min，培養(yǎng)時間為7天；所述液體培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:18g/L，酵母:2.3g/L，麥芽提取物:6.0g/L, KH2PO4:0.7g/L，MgSO4.7H20:0.30g/L，維生素 B1: 100 μ g/L，余量為蒸餾水，pH值為 6.0-8.0 ；
[0033]液體發(fā)酵培養(yǎng):將上述制得的液體菌種接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得到塊菌菌絲體，初始接種量為500mg/L，發(fā)酵條件為:攪拌速度為200r/min，溶氧為50%，初始pH值為7.0，溫度26°C，時間6天；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:15g/L，麥芽提取物:5.5g/L, KH2PO4:0.8g/L, MgSO4.7H20:0.30g/L，水解乳蛋白:32g/L，維生素BI: 100 μ g/L,余量為蒸懼水；[0034]將上述制得的塊菌菌絲體在50°C下干燥至恒重，研磨成粉末，取100mg，用15mL85%的乙醇在60°C下浸提30min，重復(fù)兩次，去除單糖、雙糖、低聚糖等干擾成分，再于沸水浴中浸提lh, 5000r/min離心15min,取上清液定容至100mL,濃硫酸-苯酹法測定多糖含量為2.5g/L。
[0035]現(xiàn)有技術(shù)中液體深層發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的制備方法制得的多糖含量一般為0.91-1.60g/L，可見通過本發(fā)明塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝明顯提高了多糖的產(chǎn)量,并大大降低了生產(chǎn)成本,有利于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。
[0036]本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員可以對所描述的具體實(shí)施例做各種修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。
[0037]盡管對本發(fā)明已作出了詳細(xì)的說明并引證了一些具體實(shí)施例，但是對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說，只要不離開本發(fā)明的精神和范圍可作各種變化或修正是顯然的。
【權(quán)利要求】
1.一種塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝，其特征在于，所述工藝包括如下步驟: 51、斜面菌種活化培養(yǎng):將塊菌菌種接種于PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行斜面菌種的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22-27°C，培養(yǎng)時間5-10天； 52、液體菌種的制備:挑取步驟SI中活化好的斜面菌種，將其轉(zhuǎn)接入裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床中培養(yǎng)制得液體菌種，培養(yǎng)條件為:溫度為22-27°C，搖床轉(zhuǎn)速為100-180r/min，培養(yǎng)時間為5_8天；所述液體培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:15_25g/L，酵母:1.5-2.5g/L，麥芽提取物:2.5-7.5g/L, KH2PO4:0.5-1.5g/L, MgSO4.7H20:0.25-0.75g/L，維生素BI:100 μ g/L,余量為蒸懼水，pH值為6.0-8.0 ； 53、液體發(fā)酵培養(yǎng):將步驟S2中制得的液體菌種接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得到塊菌菌絲體，經(jīng)提取制得塊菌多糖；其中，發(fā)酵條件為:攪拌速度為200r/min，溶氧為50%，pH值為6.0-8.0，溫度22_27°C，時間5_8天；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:15-25g/L,麥芽提取物:2.5-7.5g/L，KH2PO4:0.5-1.5g/L, MgSO4.7H20:0.25-0.75g/L，水解乳蛋白:25-35g/L，維生素B1: 100 μ g/L，余量為蒸餾水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝，其特征在于，步驟SI中所述的塊菌菌種為印度塊菌(Tuber Indicum)、臺灣原生塊菌(TuberFormosanum)、意大利白塊菌(TuberMagnatum)、法國黑孢塊菌(TuberMelanosporum)、假凹陷塊菌(TuberPseudoexcavatum)中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝，其特征在于，步驟S2中所述的液體培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:20g/L，酵母:2.0g/L，麥芽提取物:5.0g/L，KH2PO4:1.0g/L, MgSO4.7H20:0.5g/L，維生素 B1: 100 μ g/L，余量為蒸餾水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝，其特征在于，步驟S3中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖:20g/L，麥芽提取物:5.0g/L, KH2PO4:1.0g/L,MgSO4.7H20:0.5g/L，維生素B1:100 μ g/L，水解乳蛋白:30g/L，余量為蒸餾水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的塊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌多糖的工藝，其特征在于，步驟S3中所述的接種量為200-800mg/L。
【文檔編號】C12P19/04GK104017841SQ201410263701
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】杜孟浩, 張金萍, 胡立松 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所