鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測試劑盒，該試劑盒含有三對特異性引物。實驗證明，應(yīng)用本發(fā)明可檢測DTMUV和所有亞型AIV并能進行H9亞型AIV分型檢測，具有操作簡便、敏感性高、特異性強等優(yōu)點。本發(fā)明用于H9亞型禽流感病毒感染造成的免疫力減低導致的鴨坦布蘇病毒的混合感染的檢測診斷，既可以節(jié)約時間的成本，又可以減少污染。
【專利說明】鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于PCR檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu Virus, DTMUV)最早發(fā)現(xiàn)于中國的福建、浙江、江蘇等東部沿海主要蛋鴨養(yǎng)殖區(qū)，是一種新興的致病性黃病毒。DTMUV感染鴨后可導致蛋鴨產(chǎn)蛋量嚴重下降，產(chǎn)蛋率可從90%下降至10%以內(nèi)，甚至絕產(chǎn)；感染雛鴨后可導致雛鴨出現(xiàn)站立不穩(wěn)，倒地不起等神經(jīng)癥狀，進而導致雛鴨淘汰率升高，嚴重的甚至高達80 %，因此給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，AIV為單股負鏈RNA,由8個獨立的RNA節(jié)段組成。AIV根據(jù)致病性的不同，可分為高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)。HPAIV (如H5亞型)通常可引起感染鴨群的突然死亡和大量死亡；H9亞型AIV雖屬LPAIV，但它分布廣泛，能造成鴨的免疫抑制并引發(fā)與其他鴨病的混合感染，產(chǎn)蛋鴨感染后也可造成產(chǎn)蛋量的明顯下降，極大影響了蛋鴨的經(jīng)濟效益，因此它對養(yǎng)鴨業(yè)的危害也不可忽視。
[0003]上述疾病都是極大危害養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟效益的鴨病毒性傳染病，目前，對這兩類病毒傳統(tǒng)的檢測方法主要有病毒分離、血清學試驗、瓊脂擴散試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等，但這些方法存在耗時長、敏感性差、難標準化等局限性，尤其是當這兩種病毒混合感染時，更增加了臨床診斷的難度。因此，開發(fā)一種快速檢測DTMUV和AIV且能同時進行H9亞型AIV分型檢測的技術(shù)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種敏感性高、特異性強、操作簡便快速的鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測試劑盒。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測引物組，包括三對特異性引物，分別是引物I和2 (檢測DTMUV)、引物3和4 (檢測AIV分型H9亞型)、引物5和6(檢測AIV)，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.6的喊基序列。
[0006]引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩爾比為
0.5-1: 0.5-1: I: I: I: I。
[0007]引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩爾比為1:1:1:1:1:1。
[0008]上述鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測引物組在PCR擴增方面的應(yīng)用，PCR擴增的退火溫度為50.(TC -60.1°C。
[0009]PCR擴增的退火溫度為53.(TC。
[0010]鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測試劑盒，包括引物組、PCR緩沖液和水；
[0011]引物組包括三對特異性引物，分別是引物I和2、引物3和4、引物5和6，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.6的堿基序列，其濃度均為25 μ mol/mL,在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為 0.8 μ mol/mL-Ι.2 μ mol/mL、0.1 μ mol/mL-Ο.5 μ mol/mL、0.1 μ mol/ml-0.5 μ mol/mL ；
[0012]PCR 緩沖液為 2 X Taq PCR Mix。
[0013]引物I和2、引物3和4、引物5和6在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為0.8 μ mol/mL、0.2 μ mol/mL、0.4 μ mol/mL。
[0014]上述鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測試劑盒在PCR擴增方面的應(yīng)用，PCR擴增的退火溫度為50.(TC -60.1°C。
[0015] PCR擴增的退火溫度為53.(TC。
[0016]針對目前缺乏對DTMUV、所有亞型AIV和H9亞型AIV同時進行檢測和診斷的有效可靠的技術(shù)，發(fā)明人結(jié)合多重PCR —管多檢、高通量、低成本、高效率等優(yōu)點，研究設(shè)計了三對特異性引物，據(jù)此建立了鴨坦布蘇病毒和所有亞型禽流感病毒并能進行H9亞型AIV分型檢測的多重PCR檢測方法，并制備了相應(yīng)的檢測試劑盒。實驗證明，應(yīng)用本發(fā)明可檢測DTMUV和所有亞型AIV并能進行H9亞型AIV分型檢測，具有操作簡便、敏感性高、特異性強等優(yōu)點。本發(fā)明用于H9亞型禽流感病毒感染造成的免疫力減低導致的鴨坦布蘇病毒的混合感染的檢測診斷，既可以節(jié)約時間的成本，又可以減少污染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是多重PCR的特異性試驗結(jié)果電泳圖，圖中，M:100bp DNA ladder ；11:陰性對照(ddH20) ；1:H9AIV的cDNA+鴨坦布蘇病毒的cDNA (等體積混合)；2:H9AIV的cDNA ；3:鴨坦布蘇病毒的cDNA ；4:H5AIV的cDNA ；5:番鴨呼腸孤病毒的cDNA ；6:番鴨細小病毒的DNA ；7:鴨圓環(huán)病毒DNA ；8:鴨副粘病毒的cDNA ；9:鴨肝炎病毒的cDNA ；10:鴨瘟病毒的DNA。
[0018]圖2是多重PCR的敏感性試驗結(jié)果電泳圖，圖中，M:1OObp DNA ladder ；1:450ng/μ LDTMUV、760ng/y L H9、760ng/μ LM 基因的 cDNA ；2:45ng/y L DTMUV、76ng/μ L H9、76ng/μ LM 基因的 cDNA ；3:6.4.5ng/ μ L DTMUV,7.6ng/ μ L Η9、7.6ng/ μ LM 基因的 cDNA ；4:450pg/ μ L DTMUV、760pg/ μ L H9、760pg/ μ LM 基因的 cDNA ；5:45pg/ μ L DTMUV、76pg/ μ LH9、76pg/y LM 基因的 cDNA ；6:4.5pg/μ L DTMUV、7.6pg/y LH9、7.6pg/y LM 基因的 cDNA。
[0019]圖3是應(yīng)用本發(fā)明多重PCR的部分臨床樣品檢測結(jié)果電泳圖，圖中，M為IOObp DNAladder ；1為陽性對照(H9亞型禽流感病毒cDNA+鴨坦布蘇病毒cDNA) ；2~17為實驗室采集的鴨病料。
【具體實施方式】
[0020]以下實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。具體所用材料和試劑如下:
[0021]鴨坦布蘇病毒記載在“鴨坦布蘇病毒與鴨瘟病毒二重RT-PCR檢測方法的建立”，南方農(nóng)業(yè)學報，2014，45 (2):314-317，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0022]鴨瘟病毒AV1221購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；
[0023]鴨肝炎病毒AV2111株(以下簡稱為DHV I)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；
[0024]番鴨細小病毒記載在“廣西番鴨細小病毒的分離和鑒定”，廣西畜牧獸醫(yī)，2002，18(6): 5-7，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0025]鴨圓環(huán)病毒記載在“廣西部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染情況調(diào)查”，中國畜牧獸醫(yī)，2010,37(11): 156-158，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0026]鴨副粘病毒(鴨新城疫)記載在“鴨新城疫病毒和鴨圓環(huán)病毒二重PCR檢測方法的建立”，中國動物檢疫，2012，29 (5):34-37，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0027]番鴨呼腸孤病毒記載在“番鴨花肝病病原的研究”，中國獸醫(yī)科技，2003，5(33):
7-8，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0028]H5亞型禽流感病毒記載在“H5亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測技術(shù)的建立”，南方農(nóng)業(yè)學報，2013，02:323-327，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0029]H9亞型禽流感病毒記載在“多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測鑒別H9亞型禽流感病毒方法的建立”，中國人獸共患病學報，2006，(09):858-860，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0030]IOObp Marker ladder、2XTaq PCRMix(AS111-12)、DNA/RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0031]實施例1、引物的設(shè)計與合成
[0032]根據(jù)GenBank中H9AIV的HA基因、AIV的M基因與DTMUV的NS2基因的保守序列，采用DNAStar軟件進行多序列比對,在保守區(qū)用primer5.0設(shè)計引物。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。(表1)。
[0033]表1引物信息
[0034]
【權(quán)利要求】
1.鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測引物組，其特征在于包括三對特異性引物，分別是引物I和2、引物3和4、引物5和6，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.6的喊基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測引物組，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩爾比為0.5-1: 0.5-1: 1: 1: 1: 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測引物組，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩爾比為1:1:1:1:1:1。
4.權(quán)利要求2所述鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測引物組在PCR擴增方面的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴增的退火溫度為50.(TC -60.1°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴增的退火溫度為53.(TC。
6.一種鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測試劑盒，其特征在于包括引物組、PCR緩沖液和水； 所述引物組包括三對特異性引物，分別是引物I和2、引物3和4、引物5和6，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.6的堿基序列，其濃度均為25 μ mol/mL,在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為 0.8 μ mol/mL-Ι.2 μ mol/mL、0.1 μ mol/mL-Ο.5 μ mol/mL、0.1 μ mol/ml-0.5 μ mol/mL ； 所述PCR緩沖液為2 X Taq PCR Mix。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述引物I和2、引物3和4、引物5和6在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為0.8 μ mol/mL、0.2 μ mol/mL、0.4 μ mol/mL。
8.權(quán)利要求7所述鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測試劑盒在PCR擴增方面的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴增的退火溫度為50.(TC -60.1°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴增的退火溫度為53.(TC。
【文檔編號】C12N15/11GK103993105SQ201410263718
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】謝芝勛, 趙虹, 謝麗基, 劉加波, 羅思思, 謝志勤, 黃嬌玲, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所