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      DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測方法及檢測試劑盒的制作方法

      文檔序號:478983閱讀:201來源:國知局
      DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測方法和檢測用試劑盒,該方法包括如下步驟:以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物;PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行LDR擴(kuò)增,得到LDR的擴(kuò)增產(chǎn)物;用測序儀的Genescan功能對LDR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析,判斷各耐藥位點(diǎn)的基因型,提供具體藥物相關(guān)位點(diǎn)的信息。本發(fā)明的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測方法及檢測試劑盒采用PCR關(guān)聯(lián)LDR方法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)關(guān)聯(lián)連接酶檢測反應(yīng))進(jìn)行檢測,能夠方便檢出DNMT3α的各種基因分型,具有結(jié)果可靠穩(wěn)定、操作簡單、快速的特點(diǎn),簡化了傳統(tǒng)的PCR測序檢測方法中,產(chǎn)物純化和沉淀等繁瑣步驟,減少檢測時間,有較大的臨床應(yīng)用價值。
      【專利說明】DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 α基因位點(diǎn)分型檢測方法及檢測試劑盒
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明涉及一種急性髓系白血病突變基因的檢測方法,尤其涉及一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 a (DNMT3 α )基因位點(diǎn)分型檢測方法及檢測試劑盒。
      【背景技術(shù)】
      [0002]急性髓系白血病是目前危害青少年的最嚴(yán)重的疾病之一,DNMT3a突變?yōu)榧毙运柘蛋籽☆A(yù)后判斷提供了新的分子生物學(xué)標(biāo)記,尤其是R882位點(diǎn)是突變的熱點(diǎn)。
      [0003]連接酶檢測反應(yīng)(LDR, ligase detection reaction)是近年來發(fā)展的一種核酸檢測技術(shù),是在反應(yīng)中僅加入一對探針,模板被線性擴(kuò)增。主要應(yīng)用于單核苷酸檢測領(lǐng)域,如單核苷酸多態(tài)性檢測(SNP) (Detection of HLA Polymorphisms by LigaseDetection Reaction and a Universal Array Format: A Pilot Study for Low ResolutionGenotyping.Clarissa Consolandij Elena Bustij Cinzia Peraj et al; Human Immunology64,168 - 178 (2003))。近幾年,又出現(xiàn)了將LDR技術(shù)和PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)關(guān)聯(lián)使用(Norman P.Gerryl et al., J.Mol.Biol.(1999) 292,251-262,U.S.Pat.Pub.N0.2003/0032016A1)。同時,隨著LDR技術(shù)的逐步成熟,相關(guān)LDR檢測產(chǎn)品也在不斷問世,如腫瘤化療療效及毒副作用檢測的LDR方案,心腦血管疾病易感基因LDR檢測等產(chǎn)品。目前,已經(jīng)有人成功報道了將乙型肝炎病毒中的YMDD和HDD用LDR技術(shù)在測序平臺上進(jìn)行了成功檢測(A novel method based on ligase detection reaction for low abundant YIDD mutantsdetection in hepatitis B virus.Zhenxian X.and, Junxua X, et al Hepatology Research34 (2006) 150 - 155)。的那是針對目前的檢測,所有的相關(guān)的位點(diǎn)都是單堿基突變。還沒有開發(fā)出針對多基因位點(diǎn)的檢測技術(shù)與方法。
      [0004]有鑒于上述現(xiàn)有的多基因位點(diǎn)的檢測技術(shù)存在的缺陷,本發(fā)明人基于從事此類產(chǎn)品設(shè)計制造多年豐富的實(shí)務(wù)經(jīng)驗(yàn)及專業(yè)知識,并配合學(xué)理的運(yùn)用,積極加以研究創(chuàng)新,以期創(chuàng)設(shè)一種新型DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 α基因位點(diǎn)分型檢測方法及檢測試劑盒,使其更具有實(shí)用性。經(jīng)過不斷的研究、設(shè)計,并經(jīng)反復(fù)試作樣品及改進(jìn)后,終于創(chuàng)設(shè)出確具實(shí)用價值的本發(fā)明。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005]本發(fā)明的主要目的在于,克服現(xiàn)有的基因位點(diǎn)檢測存在的缺陷,而提供一種新型DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 α基因位點(diǎn)分型檢測方法及檢測試劑盒從而更加適于實(shí)用,且具有產(chǎn)業(yè)上的利用價值。
      [0006]本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提出的一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 α基因位點(diǎn)分型檢測方法,該方法包括如下步驟:
      以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物;
      PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行LDR擴(kuò)增,得到LDR的擴(kuò)增產(chǎn)物;
      用測序儀的Genescan功能對LDR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析,判斷各耐藥位點(diǎn)的基因型,提供具體藥物相關(guān)位點(diǎn)的信息。
      [0007]本發(fā)明檢測DNMT3 α基因位點(diǎn)的原理:
      UPCR技術(shù)的基本原理:
      類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性一退火一延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93°C左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55°C左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合;③引物的延伸:DNA模板一引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。
      [0008]2、LDR技術(shù)原理:
      LDR是利用高溫連接酶實(shí)現(xiàn)對基因多態(tài)性位點(diǎn)的識別。高溫連接酶一旦檢測到DNA與互補(bǔ)的兩條寡聚核苷酸接頭對應(yīng)處存在著基因點(diǎn)突變類型的堿基錯配,則連接反應(yīng)就不能進(jìn)行。并通過溫控循環(huán)該特異性連接反應(yīng)可反復(fù)進(jìn)行,達(dá)到線性擴(kuò)增的效果。
      [0009]3、DNMT3a 檢測序列
      GGATTGTTCAAAATTACTCTTATTTCTGCTGGGTTGTGAAACTCTAGGCAGTGATGACCTTACTACCTTTAA
      GGTCACAGAAACCAGCACAGTGCCTGGCACATGGTTGGTGATCTGAGTGCCGGGTTGTTTATAAAGGACAGAAGATT
      CGGCAGAACTAAGCAGGCGTCAGAGGAGTTGGTGGGTGTGAGTGCCCCTGTCCCTGCACTTCGGGTGGCTGCTGGTC
      CTCCGGGTCCTGCTGTGTGGTTAGACGGCTTCCGGGCAGCCTGGTCTGGCCAGCACTCACCCTGCCCTCTCTGCCTT
      TTCTCCCCCAGGGTATTTGGTTTCCCAGTCCACTATACTGACGTCTCCAACATGAGCCg/jCTTGGCGAGGCAGAGA
      CTGCTGGGCCGGTCATGGAGCGTGCCAGTCATCCGCCACCTCTTCGCTCCGCTGAAGGAGTATTTTGCGTGTGTGTA
      AGGGACATGGGGGCAAACTGAGGTAGCGACACAAAGTTAAACAAACAAACAAAAAACACAAAACATAATAAAACACC
      AAGAACATGAGGATGGAGAGAAGTATCAGCACCCAGAAGAGAAAAAGGAATTTAAAACAAAAACCACAGAGGCGGAA
      ATACCGGAGGGCTTTGCCTTGCGAAAAGGGTTGGACATCATCTCCTGATTTTTCAATGTTATTCTTCAGTCCTATTT
      AAAAACAAAACCAAGCTCCCTTCCCTTCCTCCCC
      更進(jìn)一步的的,前述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a基因位點(diǎn)分型檢測方法,所述PCR擴(kuò)增時的引物為一對正向引物和反向引物。
      [0010]更進(jìn)一步的,前述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 α基因位點(diǎn)分型檢測方法,所述正向引物序列為:5’ -TCCTGCTGTGTGGTTAGACG-3’ ;所述反向引物序列為:5’ -CCATGTCCCTTACACACACG-3’。
      [0011]更進(jìn)一步的,前述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3d基因位點(diǎn)分型檢測方法,所述LDR擴(kuò)增時采用的探針為熒光標(biāo)記探針和檢測探針。LDR所用探針為包括相關(guān)位點(diǎn)的探針,這些探針涉及到兩種探針,第一種探針是熒光標(biāo)記探針,其中一部分為和模板配對部分,另一部分則可引入隨機(jī)系列來調(diào)整LDR產(chǎn)物長度,同時進(jìn)行3’熒光標(biāo)記和5’端的磷酸化標(biāo)記;第二種探針為檢測探針,包含兩部分,其中一部分為和模板配對部分,另一部分則可引入隨機(jī)系列來調(diào)整LDR產(chǎn)物長度。其中第二種探針根據(jù)突變位點(diǎn)的需要進(jìn)行設(shè)計,它可以為2-4根探針,探針中的3’端為檢測位點(diǎn)。每組相關(guān)位點(diǎn)的探針,針對核酸單堿基變化來設(shè)定檢測探針的長度,以實(shí)現(xiàn)不同的核酸堿基對應(yīng)不同的LDR產(chǎn)物長度。
      [0012]更進(jìn)一步的,前述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測方法,所述熒光標(biāo)記探針的熒光基團(tuán)為 5-FAM、6-FAM、TAMRA, HEX、TET, JOE、VIC、NED、ROX, Dl、D2、D3 或 D4。
      [0013]一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 α基因位點(diǎn)分型檢測試劑盒,所述檢測試劑盒由如下三部分組成:PCR試劑、LDR試劑和標(biāo)準(zhǔn)品。
      [0014]更進(jìn)一步的,前述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測試劑盒,所述PCR試劑包含一對正向引物和反向引物、雙蒸水、聚合酶、聚合酶配套緩沖液、dNTP與鎂離子,
      其中,聚合酶為Taq酶,鎂離子由MgC12提供。
      [0015]更進(jìn)一步的,前述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測試劑盒,所述LDR試劑包含相關(guān)位點(diǎn)的熒光探針、雙蒸水、Taq連接酶和連接酶配套緩沖液。
      [0016]更進(jìn)一步的,前述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測試劑盒,所述標(biāo)準(zhǔn)品為野生型質(zhì)粒DNA。
      [0017]更進(jìn)一步的,前述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 α基因位點(diǎn)分型檢測試劑盒,所述正向引物序列為:5’ -TCCTGCTGTGTGGTTAGACG-3’ ;所述反向引物序列為:5’ -CCATGTCCCTTACACACACG-3’。
      [0018]借由上述技術(shù)方案,本發(fā)明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 α基因位點(diǎn)分型檢測方法及檢測試劑盒至少具有下列優(yōu) 點(diǎn):
      本發(fā)明的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 α基因位點(diǎn)分型檢測方法及檢測試劑盒采用PCR關(guān)聯(lián)LDR方法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)關(guān)聯(lián)連接酶檢測反應(yīng))進(jìn)行檢測,能夠方便檢出DNMT3 α的各種基因分型,具有結(jié)果可靠穩(wěn)定、操作簡單、快速的特點(diǎn),簡化了傳統(tǒng)的PCR測序檢測方法中,產(chǎn)物純化和沉淀等繁瑣步驟,減少檢測時間,有較大的臨床應(yīng)用價值。
      [0019]上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述,為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段,并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施,以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例詳細(xì)說明如后。
      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0020]圖1為樣本I測試結(jié)果;
      圖2為樣本2測試結(jié)果;
      圖3為樣本3測試結(jié)果。
      【具體實(shí)施方式】
      [0021]為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效,對依據(jù)本發(fā)明提出的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 α基因位點(diǎn)分型檢測方法及檢測試劑盒其【具體實(shí)施方式】、特征及其功效,詳細(xì)說明如后。
      [0022]實(shí)施例1
      DNMT3a基因位點(diǎn)分型的檢測方法步驟如下:
      I提取基因組DNA
      抽取急性白血病DNMT3 α基因未突變病例的外周血,按照Promaga公司基因組DNA抽提試劑盒操作說明書進(jìn)行抽提。
      [0023]2 PCR 擴(kuò)增所提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增:所用PCR引物為兩對正向引物和反向引物,
      正向引物 5,-TCCTGCTGTGTGGTTAGACG-3,
      反向引物 5’ -CCATGTCCCTTACACACACG-3’
      PCR各組分體系見表1:
      表1
      【權(quán)利要求】
      1.一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3d基因位點(diǎn)分型檢測方法,其特征在于,該方法包括如下步驟: 以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物; 對PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行LDR擴(kuò)增,得到LDR的擴(kuò)增產(chǎn)物; 對LDR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析,判斷各耐藥位點(diǎn)的基因型。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測方法,其特征在于,所述PCR擴(kuò)增時的引物為一對正向引物和反向引物。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測方法,其特征在于,所述正向引物序列為:5’ -TCCTGCTGTGTGGTTAGACG-3’ ; 所述反向引物序列為:5’ -CCATGTCCCTTACACACACG-3’。
      4.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測方法,其特征在于,所述LDR擴(kuò)增時采用的探針為熒光標(biāo)記探針和檢測探針。
      5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測方法,其特征在于,所述熒光標(biāo)記探針的熒光基團(tuán)為 5-FAM、6-FAM、TAMRA, HEX、TET, JOE、VIC、NED、ROX, Dl、D2、D3 或 D4。
      6.一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 α基因位點(diǎn)分型檢測試劑盒,其特征在于,所述檢測試劑盒由如下三部分組成:PCR試劑、LDR試劑和標(biāo)準(zhǔn)品。
      7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a基因位點(diǎn)分型檢測試劑盒,其特征在于,所述PCR試劑包含一對正向引物和反向引物、雙蒸水、聚合酶、聚合酶配套緩沖液、dNTP與鎂離子, 其中,聚合酶為Taq酶,鎂離子由MgCl2提供。
      8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測試劑盒,其特征在于,所述LDR試劑包含相關(guān)位點(diǎn)的熒光探針、雙蒸水、Taq連接酶和連接酶配套緩沖液。
      9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測試劑盒,其特征在于,所述標(biāo)準(zhǔn)品為野生型質(zhì)粒DNA。
      10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3α基因位點(diǎn)分型檢測試劑盒,其特征在于,所述正向引物序列為:5 ’ -TCCTGCTGTGTGGTTAGACG-3 ’;所述反向引物序列為:5’ -CCATGTCCCTTACACACACG-3’。
      【文檔編號】C12Q1/68GK103993099SQ201410265682
      【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
      【發(fā)明者】祁小飛 申請人:蘇州大學(xué)
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