一種長裙竹蓀抑菌活性單體的分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種長裙竹蓀抑菌活性單體的分離純化方法，本發(fā)明的長裙竹蓀抑菌活性單體的分離純化方法，包括長裙竹蓀子實(shí)體預(yù)處理、浸提、萃取、硅膠柱層析、反相硅膠柱層析。長裙竹蓀不僅營養(yǎng)豐富，含有多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，還具有健脾益胃、降血脂、降血壓，抗腫瘤、抗凝血、消腫止痛、抗艾滋病、刺激免疫、抗輻射以及較強(qiáng)的抑菌防腐作用，竹蓀與肉共煮，肉不易變質(zhì)，是一種天然的食品防腐劑。從長裙竹蓀中分離出具有抑菌活性的單體，它可以開發(fā)成一種天然防腐劑應(yīng)用于食品，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種長裙竹蓀抑菌活性單體的分離純化方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種活性物質(zhì)的分離方法，具體涉及一種長裙竹蓀中抑菌活性單體的分離純化方法。
[0002]

【背景技術(shù)】
fjUDi ctyophora Indus i at a )又稱竹參、面紗菌、竹雞蛋,隸屬于真菌門、擔(dān)子菌綱、鬼筆菌目、鬼筆菌科、竹蓀屬。菌裙是竹蓀特有的形態(tài)特征，由海綿質(zhì)組成，1cm以上的稱長裙竹蓀。長裙竹蓀不僅營養(yǎng)豐富，含有多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，還具有健脾益胃、降血月旨、降血壓，抗腫瘤、抗凝血、消腫止痛、抗艾滋病、刺激免疫、抗輻射以及較強(qiáng)的抑菌防腐作用，是一種天然的食品防腐劑。竹蓀與肉共煮，肉不易變質(zhì)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明:長裙竹蓀粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌、李斯特菌、副溶血弧菌等細(xì)菌有很明顯的抑菌效果，并且較低的濃度即可以起較好的抑菌和殺菌效果；且抑菌物質(zhì)在PH5.0-8.5的弱酸至弱堿性條件下穩(wěn)定，對(duì)高溫高壓也很穩(wěn)定，這與很許多防腐劑只有在酸性條件下才能發(fā)揮防腐作用相比有很大的優(yōu)勢(shì)。
[0003]從長裙竹蓀中分離出具有抑菌活性的單體，它可以開發(fā)成一種天然防腐劑應(yīng)用于食品，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的是提供一種分離長裙竹蓀中抑菌活性單體物質(zhì)的方法，為食品提供一種安全的天然防腐劑。
[0005]本發(fā)明的長裙竹蓀抑菌活性單體的分離純化方法，包括長裙竹蓀子實(shí)體預(yù)處理、浸提、萃取、硅膠柱層析、反相硅膠柱層析，其操作步驟如下:
(1).長裙竹蓀子實(shí)體預(yù)處理:竹蓀子實(shí)體干品于60°c烘箱中烘烤3h，然后用植物粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，得到子實(shí)體粉末；
(2).浸提:稱取長裙竹蓀子實(shí)體粉末，按液固重量分?jǐn)?shù)比26?24:1加入無水乙醇，72°C下水浴1.5h后抽濾得濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器100rpm、6(TC下將液體旋干，所得固形物為長裙竹蓀粗提物，備用；
(3).萃取:長裙竹蓀粗提物溶于水，依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，每層萃取3-5次即可；取乙酸乙酯層萃取物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上60°C下蒸干溶劑，得乙酸乙酯層固形物，備用;
(4).硅膠柱層析:
I)第一次硅膠柱層析:①裝柱:準(zhǔn)確稱取適量200-300目硅膠于燒杯中，加入石油醚攪拌成漿，在色譜柱底端塞一團(tuán)棉花，往柱中加入5mL石油醚，將漿液緩緩傾入柱中，使硅膠自然沉降，同時(shí)用玻璃棒輕輕敲擊色譜柱以排除氣泡，將層析柱下端開關(guān)打開，使流動(dòng)相自然流下，直至液面在柱面上方約3cm，用700mL第一個(gè)流動(dòng)相平衡；②上樣:將試樣溶于少量甲醇中，用4倍于試樣的硅膠研磨混勻，揮干溶劑，使其松散，經(jīng)漏斗緩緩加入色譜柱上方，然后用少量流動(dòng)相淋洗柱壁，使硅膠柱表面平整；③淋洗:用石油醚:乙酸乙酯=6.5-7:2.8-3,0.8-1:0.8-1依次分別淋洗5個(gè)柱體積，兩種比例淋洗液各自用量為1500 mL，用錐形瓶收集洗脫液，每瓶收集300mL，共得到10個(gè)片段，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50°C蒸干各個(gè)片段的液體，依次編號(hào)為D11-D11號(hào)，合并Df-D1S片段的組分，備用；
2)第二次硅膠柱層析:①裝柱:同I);②上樣:同I);③淋洗:用石油醚:乙酸乙酯=6.5-7:2.8-3,5.6-6:3.6_4依次分別淋洗3個(gè)柱體積，兩種比例淋洗液各自用量為750 mL用錐形瓶收集洗脫液，每瓶收集250mL，共得到6個(gè)片段，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50°C蒸干各個(gè)片段的液體，依次編號(hào)為D21-D26號(hào),合并D23-D24片段組分,備用；
3)第三次硅膠柱層析:①裝柱:同I);②上樣:同I);③淋洗:用石油醚:乙酸乙酯=7.5-8:1.8-2,7-7.5:3_3.5依次分別淋洗3個(gè)柱體積，兩種比例淋洗液各自用量為750mL,用錐形瓶收集洗脫液，每瓶收集250mL，共得到6個(gè)片段，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50°C蒸干各個(gè)片段的液體，依次編號(hào)為D31-D36號(hào),合并D34-D35片段組分,備用；
(5).反相硅膠柱層析:用1g硅膠裝柱，用300mL甲醇洗柱，300mL超純水平衡，然后將上述合并的D34-D35片段組分溶解于2mL甲醇中，加入層析柱上方，控制流速為10mL/min，用300mL超純水淋洗，用錐形瓶收集，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50°C蒸干液體得到白色結(jié)晶體即為具有抑菌活性的單體。
[0006]步驟(3)中，其中粗提物和水的重量份數(shù)比為1:18?20，石油醚與乙酸乙酯重量分?jǐn)?shù)比為1:廣2。
[0007]本發(fā)明用于保護(hù)利用本方法分離純化得到的長裙竹蓀中抑菌活性單體。
[0008]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:用本發(fā)明的方法分離純化的抑菌活性的單體，是一種天然的抑菌物質(zhì)，可以開發(fā)成一種天然防腐劑應(yīng)用于食品，克服人工合成的食品防腐劑給消費(fèi)者帶來的副作用，因此在食品上具有廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)該抑菌單體在弱酸至弱堿性條件下穩(wěn)定，對(duì)高溫高壓也很穩(wěn)定，這與很許多防腐劑只有在酸性條件下才能發(fā)揮防腐作用相比有很大的優(yōu)勢(shì)。
[0009]

【具體實(shí)施方式】
為了充分公開本發(fā)明的長裙竹蓀抑菌活性單體的分離方法，以下結(jié)合實(shí)施例加以說明。
[0010]實(shí)施例1
一種長裙竹蓀中抑菌活性單體的分離方法，包括以下步驟:
1.長裙竹蓀子實(shí)體預(yù)處理:竹蓀子實(shí)體干品于60°c烘箱中烘烤3h，然后用植物粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，得到子實(shí)體粉末。
[0011]2.浸提:稱取長裙竹蓀子實(shí)體粉末lOOOg，按液固重量分?jǐn)?shù)比25:1加入無水乙醇，72°C下水浴1.5h后抽濾得濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器60°C下將液體旋干，所得固形物190g為長裙竹蓀粗提物，備用。
[0012]3.萃取:取10g長裙竹蓀粗提物溶于2000 mL水，依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，一般每層萃取3-5次即可，每次萃取劑的用量為4000mL。取乙酸乙酯層萃取物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上60°C下蒸干溶劑，得乙酸乙酯層固形物8.7g，備用。
[0013]4.硅膠柱層析:
(I)第一次硅膠柱層析:①裝柱:準(zhǔn)確稱取適量200-300目硅膠于燒杯中，加入石油醚攪拌成漿。在色譜柱底端塞一團(tuán)棉花，往柱中加入5mL石油醚，將漿液緩緩傾入柱中，使硅膠自然沉降，同時(shí)用玻璃棒輕輕敲擊色譜柱以排除氣泡，將層析柱下端開關(guān)打開，使流動(dòng)相自然流下，直至液面在柱面上方約3cm。用700mL第一個(gè)流動(dòng)相平衡。②上樣:將8.7g萃取物溶于20mL甲醇中，用35g的硅膠研磨混勻，揮干溶劑，使其松散，經(jīng)漏斗緩緩加入色譜柱上方，然后用少量流動(dòng)相淋洗柱壁，使硅膠柱表面平整。③淋洗:取130g硅膠濕法裝柱，取乙酸乙酯層固形物7.5g干法上樣，用石油醚:乙酸乙酯分別為7:3和1:1依次分別淋洗5個(gè)柱體積用錐形瓶收集洗脫液，共得到10個(gè)片段，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上lOOrpm，50°C蒸干各個(gè)片段的液體，依次編號(hào)為D11-D11號(hào)。合并其中Df-D1S片段的組分共1.96g，備用。
[0014](2)第二次硅膠柱層析:①裝柱:同(I)。②上樣:同(I)。③淋洗:取10g硅膠濕法
裝柱，將(I)中合并的1.96g組分干法上樣，用石油醚:乙酸乙酯分別為7:3和6:4依次分別淋洗3個(gè)柱體積，用錐形瓶收集洗脫液，共得到6個(gè)片段，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50°C蒸干各個(gè)片段的液體，依次編號(hào)為D21-D26號(hào)。合并其中D23-D24片段組分共0.35g,備用。
[0015](3)第三次硅膠柱層析:①裝柱:同(I)。②上樣:同(I)。③淋洗:取50g硅膠濕法裝柱，將(2)中合并的0.35g組分干法上樣，用石油醚:乙酸乙酯=8:2、7:3依次分別淋洗3個(gè)柱體積，用錐形瓶收集洗脫液，共得到6個(gè)片段，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50°C蒸干各個(gè)片段的液體，依次編號(hào)為D31-D36號(hào)。合并D34-D35片段組分共lOOmg，備用。
[0016]5.反相娃膠柱層析:用1g娃膠(型號(hào)2p-18)裝柱,用300mL甲醇洗柱，300mL超純水平衡，然后將合并的D34-D35片段組分10mg溶解于2mL甲醇中，加入層析柱上方?？刂屏魉贋?0mL/min,依次用300mL超純水淋洗,用錐形瓶收集,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50°C蒸干各個(gè)片段的液體得到白色結(jié)晶體即為具有抑菌活性的單體，該單體化合物經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)表明對(duì)指示菌腸炎沙門氏菌和巨大芽孢桿菌有很強(qiáng)的抑制作用，其中對(duì)腸炎沙門氏菌的半抑制濃度為51.58 μ g/mL ;對(duì)巨大芽孢桿菌的半抑制濃度為83.06 μ g/mL。
[0017]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種長裙竹蓀抑菌活性單體的分離純化方法，其特征在于:包括長裙竹蓀子實(shí)體預(yù)處理、浸提、萃取、硅膠柱層析、反相硅膠柱層析。
2.根椐權(quán)利要求1所述的長裙竹蓀抑菌活性單體的分離純化方法，其特征在于:具體操作步驟如下: (O長裙竹蓀子實(shí)體預(yù)處理:竹蓀子實(shí)體干品于60°c烘箱中烘烤3h，然后用植物粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，得到子實(shí)體粉末； (2)浸提:稱取長裙竹蓀子實(shí)體粉末，按液固重量分?jǐn)?shù)比26?24:1加入無水乙醇，72°C下水浴1.5h后抽濾得濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器100rpm、6(TC下將液體旋干，所得固形物為長裙竹蓀粗提物，備用； (3)萃取:長裙竹蓀粗提物溶于水，依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，每層萃取3-5次即可；取乙酸乙酯層萃取物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上60°C下蒸干溶劑，得乙酸乙酯層固形物，備用； (4)硅膠柱層析: 1)第一次硅膠柱層析:①裝柱:準(zhǔn)確稱取適量200-300目硅膠于燒杯中，加入石油醚攪拌成漿，在色譜柱底端塞一團(tuán)棉花，往柱中加入5mL石油醚，將漿液緩緩傾入柱中，使硅膠自然沉降，同時(shí)用玻璃棒輕輕敲擊色譜柱以排除氣泡，將層析柱下端開關(guān)打開，使流動(dòng)相自然流下，直至液面在柱面上方約3cm，用700mL第一個(gè)流動(dòng)相平衡；②上樣:將試樣溶于少量甲醇中，用4倍于試樣的硅膠研磨混勻，揮干溶劑，使其松散，經(jīng)漏斗緩緩加入色譜柱上方，然后用少量流動(dòng)相淋洗柱壁，使硅膠柱表面平整；③淋洗:用石油醚:乙酸乙酯=6.5-7:2.8-3,0.8-1:0.8-1依次分別淋洗5個(gè)柱體積，兩種比例淋洗液各自用量為1500 mL，用錐形瓶收集洗脫液，每瓶收集300mL，共得到10個(gè)片段，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50°C蒸干各個(gè)片段的液體，依次編號(hào)為D11-D11號(hào)，合并Df-D1S片段的組分，備用； 2)第二次硅膠柱層析:①裝柱:同I);②上樣:同I);③淋洗:用石油醚:乙酸乙酯=6.5-7:2.8-3,5.6-6:3.6_4依次分別淋洗3個(gè)柱體積，兩種比例淋洗液各自用量為750 mL用錐形瓶收集洗脫液，每瓶收集250mL，共得到6個(gè)片段，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50°C蒸干各個(gè)片段的液體，依次編號(hào)為D21-D26號(hào),合并D23-D24片段組分,備用； 3)第三次硅膠柱層析:①裝柱:同I);②上樣:同I);③淋洗:用石油醚:乙酸乙酯=7.5-8:1.8-2,7-7.5:3_3.5依次分別淋洗3個(gè)柱體積，兩種比例淋洗液各自用量為750mL,用錐形瓶收集洗脫液，每瓶收集250mL，共得到6個(gè)片段，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50°C蒸干各個(gè)片段的液體，依次編號(hào)為D31-D36號(hào),合并D34-D35片段組分,備用； 反相硅膠柱層析:用1g硅膠裝柱，用300mL甲醇洗柱，300mL超純水平衡，然后將上述合并的D34-D35片段組分溶解于2mL甲醇中，加入層析柱上方，控制流速為10mL/min，用300mL超純水淋洗，用錐形瓶收集，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50°C蒸干液體得到白色結(jié)晶體即為具有抑菌活性的單體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種長裙竹蓀抑菌活性單體的分離純化方法，其特征在于:步驟(3)中，其中粗提物和水的重量份數(shù)比為1:18?20，石油醚與乙酸乙酯重量分?jǐn)?shù)比為1:1?2。
4.一種如權(quán)利要求1或2所述的一種長裙竹蓀抑菌活性單體的分離純化方法制得的長裙竹蓀抑菌活性的單體。
【文檔編號(hào)】A23L3/3472GK104068449SQ201410267889
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】江玉姬, 謝寶貴, 鄭麗珠, 劉新銳, 鄧優(yōu)錦 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)