與番茄果實(shí)顏色性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供與番茄果實(shí)顏色性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用，所述分子標(biāo)記包含2個SNP標(biāo)記和2個InDel標(biāo)記。SNP-p位于番茄SlMYB12基因起始密碼子上游第8616bp處，此處堿基為C的為紅果番茄，此處堿基為A的為粉果番茄。SNP-s位于SlMYB12起始密碼子下游第307bp處，此處堿基為T的為粉果番茄，此處堿基為C的為紅果番茄。InDel-p是位于SlMYB12基因起始密碼子上游約4kb處大小為603bp的序列，該序列缺失的為粉果番茄。InDel-i位于SlMYB12基因起始密碼子下游第248bp處，該位點(diǎn)后有一個A插入的為粉果番茄。本發(fā)明的分子標(biāo)記可應(yīng)用于番茄分子標(biāo)記輔助育種中，大大加快番茄的育種進(jìn)程。
【專利說明】與番茄果實(shí)顏色性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及與番茄果實(shí)顏色性狀相 關(guān)的分子標(biāo)記。

【背景技術(shù)】
[0002] 番茄果實(shí)顏色是一個重要的農(nóng)藝性狀，同時(shí)直接影響著消費(fèi)者的需求。早期經(jīng)典 遺傳試驗(yàn)證明番茄果實(shí)的顏色由果皮和果肉顏色共同決定，番茄果皮的顏色分為黃色和透 明兩種，由y基因決定，黃色果皮對無色果皮為顯性，黃色果皮的產(chǎn)生是因?yàn)楣麑?shí)在成熟過 程中果皮中大量積累黃色的類黃酮類物質(zhì)，無色果皮中缺少該物質(zhì)的積累。果肉的顏色主 要由紅色和黃色，由r基因控制，不同顏色果皮和果肉的組合會產(chǎn)生不同外觀顏色的果實(shí)。 栽培番茄的果肉多為紅色，因?yàn)楣ゎ伾牟煌霈F(xiàn)了紅果和粉果兩種。前人的研究表明， 控制果皮顏色的y基因是一個轉(zhuǎn)錄因子S1MYB12,此基因的表達(dá)導(dǎo)致番茄果皮中積累大量 類黃酮而為黃色，最終果實(shí)呈現(xiàn)為紅色，粉果的果皮中因沒有類黃酮的積累而呈現(xiàn)粉色。但 是影響該基因表達(dá)的關(guān)鍵位點(diǎn)卻一直沒有發(fā)現(xiàn)，目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)與果皮顏色直接相關(guān) 的分子標(biāo)記。
[0003] 在我國番茄的消費(fèi)以鮮食為主，粉果番茄因其果皮較薄、質(zhì)地松軟、口感較佳而受 到消費(fèi)者的青睞?，F(xiàn)在育種中，對不同果實(shí)材料的篩選由于缺少與果皮顏色控制基因相關(guān) 的分子標(biāo)記，往往借助成熟期表型鑒定的傳統(tǒng)方法，這種方法具有很強(qiáng)的滯后性，并且耗費(fèi) 大量的人力和物力。開發(fā)與果皮顏色相關(guān)的分子標(biāo)記，不僅從苗期就可完成果實(shí)顏色的鑒 定，同時(shí)可以大規(guī)模地對不同材料進(jìn)行篩選，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和社會效益。
[0004] 隨著分子數(shù)量遺傳學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，有關(guān)分子遺傳標(biāo) 記和標(biāo)記輔助選擇的研究廣泛開展，并在植物育種中應(yīng)用，產(chǎn)生了巨大的影響。 InDel (insertion-deletion)插入缺失標(biāo)記，此類標(biāo)記的設(shè)計(jì)是根據(jù)在等位基因位點(diǎn)上一 定數(shù)量的核苷酸插入或缺失而產(chǎn)生的長度多態(tài)性變異，根據(jù)發(fā)生插入或缺失位點(diǎn)的兩側(cè)保 守序列分別設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行該區(qū)域的PCR擴(kuò)增，即為InDel標(biāo)記。SNP(single nucleotide polymorphism)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性， 此類標(biāo)記因具有廣泛的基因組分布性，同時(shí)可進(jìn)行大規(guī)模群體篩選。SNP檢測技術(shù)主要包括 因芯片技術(shù)、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)和焦磷酸測序法等，隨著檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，SNP 標(biāo)記得到了更為廣泛的應(yīng)用。
[0005] 分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種，是指利用DNA分子標(biāo)記對育種材料進(jìn)行選 擇，綜合改良作物的重要經(jīng)濟(jì)性狀，是傳統(tǒng)遺傳育種與現(xiàn)代分子生物學(xué)有機(jī)結(jié)合的育種方 法。分子育種為農(nóng)作物育種開辟了一條新的途徑，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記在農(nóng) 作物育種中的作用將日益突出。在番茄育種中，育種專家希望選擇與番茄果實(shí)顏色密切相 關(guān)的DNA標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)早期選種和提高育種準(zhǔn)確性的目標(biāo)，從而加快遺傳育種進(jìn)程。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一套與番茄果實(shí)顏色性狀高度相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的與番茄果實(shí)顏色性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，包含2個 SNP標(biāo)記和2個InDel標(biāo)記：
[0008] 第1個SNP標(biāo)記SNP-p位于番茄S1MYB12基因起始密碼子上游第8616bp處，此處 堿基為C的為一般為紅果番爺，此處堿基為A的一般為粉果番爺；
[0009] 第2個SNP標(biāo)記SNP-s位于番茄S1MYB12基因起始密碼子下游第307bp處，此處 堿基為C的為紅果番茄，此處堿基為T的為粉果番茄；
[0010] 第1個InDel標(biāo)記InDel-p是位于番茄S1MYB12基因起始密碼子上游約4kb處大 小為603bp的DNA序列，該序列缺失的為粉果番茄；所述序列的核苷酸序列如Seq ID No. 1 所示；
[0011] 第2個InDel標(biāo)記InDel-i位于番茄S1MYB12基因起始密碼子下游第248bp處， 該位點(diǎn)后具有一個A插入的為粉果番茄。
[0012] 本發(fā)明還提供用于檢測上述分子標(biāo)記的特異性引物對，其中：
[0013] 用于檢測標(biāo)記SNP-p的特異性引物對為：
[0014] 正向引物 F5, -GCCTTCTTCTACACCCTT-3，（Seq ID No. 2)
[0015] 反向引物 R5' -ACACCAGTGCTCCTCCTA-3'（Seq ID No. 3)。
[0016] 用于檢測標(biāo)記SNP-s和標(biāo)記InDel-i的特異性引物對為：
[0017] 正向引物 F5, -AATAATGGGAAGAACACC-3'（Seq ID No. 4)
[0018] 反向引物 R5' -TTCTGGACCTAGACTAAA-3'（Seq ID No. 5)。
[0019] 用于檢測標(biāo)記InDel-p的特異性引物對為：
[0020] 正向引物 F5, -AGTGACGAACAACCGACCTA-3，，（Seq ID No. 6)
[0021] 反向引物 R5' -CCTCACAAACGCGGACAAA-3'（Seq ID No. 7)。
[0022] 本發(fā)明還提供一種鑒定番茄果實(shí)顏色的方法，包括以下步驟：
[0023] 1)提取待測番爺?shù)幕蚪MDNA ;
[0024] 2)以待測番茄的基因組DNA為模板，利用用于檢測上述分子標(biāo)記的特異性引物 對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0025] 3)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0026] 前述的方法，步驟2)中利用用于檢測標(biāo)記SNP-p的特異性引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR反應(yīng)體系為：含 L5mmol/L Mg2+的 1XPCR反應(yīng)緩沖液 2μ l，2.5mM dNTPs0.8y 1，10μΜ 上、下游引物各 〇·3μ 1，2·5υ/μ 1 Taq DNA 聚合酶 0·4μ l，20ng/y 1 DNA 模板 2μ 1，ddH20 補(bǔ)齊至20 μ 1。
[0027] PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 個循環(huán)；72°C延伸5min。
[0028] 對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果檢測結(jié)果僅為一條398bp大小的 條帶，說明擴(kuò)增出特異性的目的條帶，相關(guān)序列進(jìn)行焦磷酸測序，如果目的條帶的207bp處 為C，表明待測番茄極有可能是紅果，若目的條帶的207bp處為A，表明待測番茄極有可能是 粉果。
[0029] 前述的方法，步驟2)中利用用于檢測標(biāo)記SNP-s和標(biāo)記InDel-i的特異性引物 對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：含1. 5mmol/L Mg2+的1XPCR反應(yīng)緩沖液2μ 1，2. 5mM dNTPs0.8yl，10yM 上、下游引物各 0·3μ1，2·5υ/μ1 Taq DNA 聚合酶 0.4yl，20ng/yl DNA 模板 2 μ 1，ddH20 補(bǔ)齊至 20 μ 1。
[0030] PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 20s，55°C退火 20s，72°C延伸 30s，35 個循環(huán)；72°C延伸lOmin。
[0031] 對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果檢測結(jié)果僅為一條439bp大小的 條帶，說明擴(kuò)增出特異性的目的條帶，相關(guān)序列進(jìn)行焦磷酸測序，目的條帶在251處有堿基 A插入的待測番茄為粉果；或者在311bp處堿基為T的待測番茄為粉果，在311bp處堿基為 C的待測番茄為紅果。
[0032] 前述的方法，步驟2)中利用用于檢測標(biāo)記InDel-p的特異性引物對進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR 反應(yīng)體系為：含 1.5mmol/L Mg2+的 1XPCR 反應(yīng)緩沖液 2μ1，2·5πιΜ dNTPs0.8yl， 1(^]?上、下游引物各0.3 4 1，2.5"4 1了&9〇嫩聚合酶0.4 4 1，20叩/^10嫩模板2 4 1， ddH20 補(bǔ)齊至 20 μ 1。
[0033] ?0?擴(kuò)增程序?yàn)椋?41：預(yù)變性51^11;941：變性2〇8,551：退火2〇8,721：延伸4〇8,35 個循環(huán)；72°C延伸lOmin。
[0034] 對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果檢測結(jié)果僅為一條360bp大小的 條帶，表明待測番茄為粉果，如果檢測結(jié)果僅含有一條者960bp大小的條帶，表明此位點(diǎn)不 存在缺失，為紅果的基因型。
[0035] 本發(fā)明還提供含有上述引物對的用于檢測番茄果實(shí)顏色的試劑盒。
[0036] 本發(fā)明進(jìn)一步提供上述與番茄果實(shí)顏色性狀相關(guān)的分子標(biāo)記在番茄分子標(biāo)記輔 助育種中的應(yīng)用。即根據(jù)基因型進(jìn)行紅果和粉果番茄品種的選育，從而加快番茄的育種進(jìn) 程。
[0037] 首先對360份番茄種質(zhì)材料進(jìn)行重測序分析，同時(shí)對這360份材料進(jìn)行果皮顏色 表型進(jìn)行鑒定。采用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS)的方法，從10, 990, 318個SNP中找到了 一個與番茄果色相關(guān)的SNP位點(diǎn)（圖1)。根據(jù)番茄基因組拼接版本（SL2. 40)和基因注 釋版本（ITAG2. 3)，該 SNP 位點(diǎn)位于基因 Solyc01g079620(SlMYB12)的 ATG 上游 8616 處 (SL2. 40ch01:71246984)，此位點(diǎn)堿基為C與紅果表型高度連鎖，此位點(diǎn)堿基為A與粉果表 型高度連鎖。對427個具有明確表型個體的基因型進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，205個紅果中有204個個 體為C，222個粉果中有220個個體為A。
[0038] 為了進(jìn)一步尋找控制番茄果色的關(guān)鍵變異位點(diǎn)，對基因 Solyc01g079620與其上 游基因 Solyc01g079610 之間區(qū)域（SL2. 40ch01:71229871-71, 258, 882)所有的變異位點(diǎn)進(jìn) 行了分析，并結(jié)合PCR擴(kuò)增并測序，發(fā)現(xiàn)在基因 Solyc01g079620的ATG上游約4k處存在一 個 603bp(SL2. 40ch:71250781-SL2. 40ch:71250179)的變異，所有的紅果個體（205 個）基 因組中都存在這一 603bp的序列，在118個粉果中缺失此603bp。進(jìn)一步地，對其余4份特 異的粉果個體進(jìn)行檢測，對基因 Solyc01g079620進(jìn)行了擴(kuò)增并測序。發(fā)現(xiàn)其中1份材料在 基因的第二個外顯子出現(xiàn)了一個SNP(SL2. 40 :71255952)發(fā)生了 C-T轉(zhuǎn)換，這種轉(zhuǎn)換產(chǎn)生了 一個TAA的終止密碼子，造成了翻譯的提前終止。對另3份材料的檢測，發(fā)現(xiàn)在基因的第二 個外顯子發(fā)生了一個堿基A的插入（SL2. 40ch01 :71255892后），這種插入產(chǎn)生一個TAG的 終止密碼子，造成翻譯的提前終止。
[0039] 綜上，本發(fā)明共發(fā)現(xiàn)控制番茄果皮顏色基因（y)的三種變異類型：（1)啟動子區(qū)域 603bp缺失；（2)在基因編碼區(qū)上1個堿基的替換產(chǎn)生了終止密碼子；（3)在基因編碼區(qū)上 1個堿基的插入產(chǎn)生了終止密碼子。（圖6)
[0040] 本發(fā)明可替代傳統(tǒng)的待番茄成熟后判斷番茄果色的方法，完全排除人為因素的影 響，使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明方法更為簡單有效，能極大地提高時(shí)間 效益和經(jīng)濟(jì)效益，并可用于大規(guī)模篩選育種材料，大大加快番茄的育種進(jìn)程。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1為本發(fā)明利用GWAS分析方法從101萬個SNP (最小等位基因頻率>5% )中篩 選到與果皮顏色相關(guān)聯(lián)的SNP-p。該SNP位點(diǎn)（用箭頭標(biāo)記）位于番茄第1號染色體基因 Solyc01g079620 的 ATG 上游 8616bp 處。
[0042] 圖2為本發(fā)明利用BWA、SAMtools軟件對目標(biāo)區(qū)域成對reads的檢測原理圖，在粉 果個體中存在603bp的缺失，缺失區(qū)域位于基因上游約4kb處。
[0043] 圖3為本發(fā)明對基因 Solyc01g079620啟動子區(qū)域的缺失狀態(tài)的分子驗(yàn)證結(jié)果。其 中，Μ為DNA Marker,電泳條帶為960bp的個體為紅果個體，電泳條帶為360bp的個體為粉 果個體。
[0044] 圖4為本發(fā)明對基因 Solyc01g079620區(qū)域的測序檢測結(jié)果，在編碼區(qū)一個堿基A 的插入產(chǎn)生了一個終止密碼子TAG，導(dǎo)致翻譯的提起終止，表現(xiàn)粉果的基因型。
[0045] 圖5為本發(fā)明對基因 Solyc01g079620區(qū)域的測序檢測結(jié)果，在編碼區(qū)的一個堿基 C-T的替換，產(chǎn)生了一個終止密碼子TTA，導(dǎo)致翻譯的提起終止，表現(xiàn)粉果的基因型。
[0046] 圖6為本發(fā)明對不同番茄果皮顏色個體檢測發(fā)現(xiàn)的所有變異類型，圖上方顯示y 基因所在的染色體物理位置，圖中部為y基因的結(jié)構(gòu)示意圖，圖下方是檢測到的所有變異 類型和表現(xiàn)型。

【具體實(shí)施方式】
[0047] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0048] 實(shí)施例1與番茄果實(shí)顏色性狀相關(guān)的SNP-p標(biāo)記的獲得
[0049] 對世界各地收集到的360份番茄材料，進(jìn)行重測序，每份材料產(chǎn)生5G左右的數(shù)據(jù) 量，平均覆蓋5倍的番茄基因組，對群體中258份具有明確表型的個體（232紅果和26粉果） 進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，采用復(fù)雜線性模型（mixture line model),利用tassel4.0軟件， 從101萬個SNP中找到了一個與果皮顏色表型高度相關(guān)的SNP位點(diǎn)（圖1)。該SNP位于基 因 Solyc01g079620 (即基因 S1MYB12)的 ATG 上游 8616bp 處（SL2. 40ch01:71246984)，此 位點(diǎn)C與紅果表型高度連鎖（232個紅果全部為C)，A與粉果表型高度連鎖（25個體為A，1 個個體為C)。
[0050] 利用跨含該SNP-p區(qū)域的引物對（Seq ID No. 2-3)，進(jìn)行紅果和粉果的檢測，具體 方法如下：提取待測番茄的基因組DNA，利用用于檢測標(biāo)記SNP-p的特異性引物對進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為：含 1. 5mmol/L Mg2+的 1XPCR反應(yīng)緩沖液 2μ 1，2. 5mM dNTPsO. 8μ 1， 1(^]?上、下游引物各0.3 4 1，2.5"4 1了&9〇嫩聚合酶0.4 4 1，20叩/^10嫩模板2 4 1， ddH20 補(bǔ)齊至 20 μ 1。
[0051] PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 個循環(huán)；72°C延伸5min。
[0052] 對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果檢測結(jié)果僅為一條398bp大小 (Seq ID No.8)的條帶，說明擴(kuò)增出特異性的目的條帶，相關(guān)序列進(jìn)行焦磷酸測序，如果目 的條帶的207bp處為C，表明待測番茄極有可能是紅果，若目的條帶的207bp處為A，表明待 測番茄極有可能是粉果。
[0053] 實(shí)施例2與番茄果實(shí)顏色性狀相關(guān)的InDel-p標(biāo)記的獲得
[0054] 從重測序材料中分別選取20個粉果和20個紅果的測序數(shù)據(jù)（測序時(shí)建 庫長度為500bp，采用雙末端測序策略），利用BWA軟件將它們的重測序數(shù)據(jù)分別 與番茄參考基因組（版本SL2.40)進(jìn)行比對，利用SAMtools軟件將比對結(jié)果轉(zhuǎn)換 為可讀文件。對基因 Solyc01g079620與其上游基因 Solyc01g079610之間區(qū)域 (SL2.40ch01:71229871-71, 258, 882)的所有成對出現(xiàn)的 reads (paired-end reads)進(jìn)行 檢測，發(fā)現(xiàn)在所有紅果個體中一對reads之間的距離都在500bp左右，然而在粉果個體中有 異常reads的出現(xiàn)，它們的距離在llOObp左右，表明粉果個體中存在一個約600bp的缺失 (圖 2)。
[0055] 利用跨該缺失區(qū)域的引物對紅果和粉果個體進(jìn)行PCR檢測，并進(jìn)行焦磷酸測序， 具體方法如下：提取待測番茄的基因組DNA，利用引物對（Seq ID No. 6和7)進(jìn)行檢測，PCR 反應(yīng)體系為：含 1.5mmol/L Mg2+的 1XPCR反應(yīng)緩沖液2μ l，2.5mM dNTPs0.8y 1，10μΜ上、 下游引物各 〇· 3 μ 1，2· 5U/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0· 4 μ 1，20ng/ μ 1 DNA 模板 2 μ 1，ddH20 補(bǔ) 齊至20 μ 1。
[0056] PCR 反應(yīng)條件為：94 °C 5 分鐘；94 °C 30 秒，55 °C 30 秒，72 °C 40 秒，35 個循環(huán)； 72 °C 10 分鐘。
[0057] 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，預(yù)期目的 條帶長度為300-1000bp，對擴(kuò)增序列進(jìn)行測序檢測。
[0058] 結(jié)果分析：電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，紅果個體條帶約為960bp，粉果個體的條帶約 為360bp (圖3)，測序結(jié)果顯示在粉果個體中存在603bp的缺失（Seq ID No. 1)。
[0059] 實(shí)施例3與番茄果皮顏色性狀相關(guān)的SNP-s、InDel-i標(biāo)記的獲得 [0060] 對S1MYB12基因編碼區(qū)進(jìn)行PCR檢測并進(jìn)行焦磷酸測序，具體方法如下：
[0061] 擴(kuò)增所用正向引物為F5' -AATAATGGGAAGAACACC-3'反向引物為 R5, -TTCTGGACCTAGACTAAA-3，。
[0062] PCR 反應(yīng)條件為：94 °C 5 分鐘；94 °C 30 秒，55 °C 30 秒，72 °C 30 秒，35 個循環(huán)； 72 °C 10 分鐘。
[0063] 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，目的條帶 大小為439bp (Seq ID No. 9)，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序檢測。.
[0064] 結(jié)果分析：目的條帶在251處有堿基A插入的待測番茄為粉果（圖4);或者在 31 lbp處堿基為T的待測番茄為粉果，在31 lbp處堿基為C的待測番茄為紅果（圖5)。 [0065] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0001] 序列表 <110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 <120〉與番茄果實(shí)顏色性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用 <130> KHP141113695.1 <160> 9 <170> Patentln version 3.3 <210〉 1 <211〉 603 <212> DNA <2]3>番茄 <400> 1 tctaaattaa atagtggtcg tgttaaaatt atatttctta attgatatga caaataagat 60 agaartnaga atgtnrtgtt tnrtraaaaa tattttatrt rttataanaa gtgtgataaa 120 ataattttat atatttatta tggaaaaatc aaaattttaa aaatatatga aaaagtattt 180 tctacgaaac taatctctca aattcRCcal ttaattgcat cttatttagc taacaaMaat 240 ttgcatgttg aacttcttct aatatactcl agaaatcaat taataaggga ccaaattggt 300 tgtgattttt ttcattaaat cacttgagtt at&atgtatt taatgtatgc cgactgataa 360 cgclagaota tagcttgtct tgaagtcaat ttaaaiaaaa tactaaatac actgatttga 420 ttagtgagta gacaattaca attcatgaal ttatgaaagg cagatttgac ttatagaaaa 480 attgtaacat atttttattt taaataattt ttttattttt taattaaaat taaaattaaa 540 aaaattaaaa taacataaaa aaaagttcca ttctatttaa attttggcca aagagatggt 600 gag 603 <210> 2 <211〉 18 <212> DNA <213) 人工序列 <400> 2 gccttcttct acaccctt 18 <210> 3 <211〉 18 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 3 acaccagtgc tcctccta 18 <210> 4 <211〉 18 <212> DNA <2i3> 人工序列 <400> 4 aataatggga agaacacc 18 <210〉 5 <211> 18 <212> DNA
[0002] <213〉人工序列 <400> 5 ttctggacct agactaaa 18 <210> 6 <2Γ1> 20 <212〉 DNA <213> 人工序列 <400> 6 agtgacgaac aaccgaccta 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 7 cctcacaaac gcgga.caa.a 19 <210> 8 <211〉 398 <212> DNA <213〉番茄 <220> <221> misc_feature <222> (207).. (207) <223〉η 為 c 或 a <400> 8 gccttcttct acacccltgg agtttaatca caagttaact tctactgctt ttgatgaatt 60 cactggaaag aatgctaatg cagaagacac acttcttgat gattttggaa aatatcagag 120 actaataggt aagttat tat act Laactat gactagacct gataiagccl ttgtagtaca 180 agl l clcagL caaia l algc aUtjfctcnafcta aal aLc:l ua丨 aLHgaagfjaa tL.atjLLggag丨 240 agtgagatat ataaaaggaa ctgcaagtct tggattgttt atgccaagca acaaaggaaa 300 tgaaatggta gcttattgtg attaagactg gggggcttgl gtagagacaa gaagatcagt 360 tactggctat atgatcaaac taggaggagc actggtgt 398 <210> 9 <211> 439 <212> DNA <213〉番茄 <220> <221> mlsc_reature <222〉（311).. (311) <223〉n 為 t 或 c <400> 9 aataatggga agaacacctt gttgtgaaaa agtgggcatc aagagaggca gatggactgc 60 agaagaagat caaattctca ctaattatat tatttctaat ggagaaggct cttggaggtc 120 gttacctaaa aatgccggta cgattaccta ctaatctttt attttaattt gaaatttaaa 180 al ttt 111 rt 1 rg1 t t aana gM tttttat aatatt ttal tt rgaaggii l tat t gaga l g 240
[0003] cggaaagagt tgtagactac gatggattaa ttatttgagg tctgatctca agagagggaa 300 cattacttct naagaggaag atataattat aaagttacat gcaactttgg gtaacaggta 360 attagtcaat tacttgattg gactttttag cttgctaatt aaaccactca ttttgtttct 420 tlttagtcta ggtccagaa 439
【權(quán)利要求】
1. 與番茄果實(shí)顏色性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，其特征在于，包含2個SNP標(biāo)記和2個InDel 標(biāo)記； 第1個SNP標(biāo)記SNP-p位于番茄S1MYB12基因起始密碼子上游第8616bp處，此處堿基 為C的為紅果番茄，此處堿基為A的為粉果番茄； 第2個SNP標(biāo)記SNP-s位于番茄S1MYB12基因起始密碼子下游第307bp處，此處堿基 為C的為紅果番茄，此處堿基為T的為粉果番茄； 第1個InDel標(biāo)記InDel-p是位于番茄S1MYB12基因起始密碼子上游4kb處大小為 603bp的DNA序列，該序列缺失的為粉果番茄；所述序列的核苷酸序列如Seq ID No. 1所 示； 第2個InDel標(biāo)記InDel-i位于番茄S1MYB12基因起始密碼子下游第248bp處，該位 點(diǎn)后具有一個A插入的為粉果番茄。
2. 用于檢測權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的特異性引物對，其特征在于，用于檢測標(biāo)記 SNP-p的特異性引物對為： 正向引物 F5' -GCCTTCTTCTACACCCTT-3' 反向引物 R5' -ACACCAGTGCTCCTCCTA-3'。
3. 用于檢測權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的特異性引物對，其特征在于，用于檢測標(biāo)記 SNP-s和標(biāo)記InDel-i的特異性引物對為： 正向引物 F5 ' -AATAATGGGAAGAACACC-3 ' 反向引物 R5 ' -TTCTGGACCTAGACTAAA-3 '。
4. 用于檢測權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的特異性引物對，其特征在于，用于檢測標(biāo)記 InDel-p的特異性引物對為： 正向引物 F5 ' -AGTGACGAACAACCGACCTA-3 ' 反向引物 R5 ' -CCTCACAAACGCGGACAAA-3 '。
5. -種鑒定番茄果實(shí)顏色的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取待測番爺?shù)幕蚪MDNA ; 2) 以待測番茄的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求2-4的引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 3) 檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)中利用權(quán)利要求2的引物對 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：含1. 5mmol/L Mg2+的1XPCR反應(yīng)緩沖液2μ 1，2. 5mM (1階1^0.8 4 1，1(^]\1上、下游引物各0.3 4 1，2.5"4 1了&9〇嫩聚合酶0.4 4 1，20叩/^1 DNA 模板 2 μ 1，ddH20 補(bǔ)齊至 20 μ 1 ; PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸30s，35個循 環(huán)；72°C 延伸 5min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)中利用權(quán)利要求3的引物對 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：含1. 5mmol/L Mg2+的1XPCR反應(yīng)緩沖液2μ 1，2. 5mM (1階1^0.8 4 1，1(^]\1上、下游引物各0.3 4 1，2.5"4 1了&9〇嫩聚合酶0.4 4 1，20叩/^1 DNA 模板 2 μ 1，ddH20 補(bǔ)齊至 20 μ 1 ; PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性20s，55 °C退火20s，72 °C延伸30s，35個循 環(huán)；72°C延伸 lOmin。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)中利用權(quán)利要求4的引物對 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：含1. 5mmol/L Mg2+的1XPCR反應(yīng)緩沖液2μ 1，2. 5mM (1階1^0.8 4 1，1(^]\1上、下游引物各0.3 4 1，2.5"4 1了&9〇嫩聚合酶0.4 4 1，20叩/^1 DNA 模板 2 μ 1，ddH20 補(bǔ)齊至 20 μ 1 ; PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性20s，55 °C退火20s，72 °C延伸40s，35個循 環(huán)；72°C延伸 lOmin。
9. 含有權(quán)利要求2-4所述引物對的用于檢測番茄果實(shí)顏色的試劑盒。
10. 權(quán)利要求1所述與番茄果實(shí)顏色性狀相關(guān)的分子標(biāo)記在番茄分子標(biāo)記輔助育種中 的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104087576SQ201410273647
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】黃三文, 祝光濤, 林濤, 張俊紅, 倫堯堯, 杜永臣, 王孝宣 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所