一種用于檢測豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系，制備的豬瘟病毒感染報告細(xì)胞系含有CSFV特異識別的氨基酸序列、GFP熒光淬滅序列以及GFP蛋白。該細(xì)胞系只有在感染CSFV后才發(fā)出綠色熒光，不需要后續(xù)處理，可以在病毒感染后快速、直觀地報告病毒感染情況；檢測靈敏度高，而且可以一次分析多個樣本。該報告細(xì)胞系既可以用于CSFV的診斷，也可以用于病毒分離培養(yǎng)、抗病毒藥物篩選及疫苗生產(chǎn)，在臨床檢測、實(shí)驗(yàn)室研究上具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種用于檢測豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明提供了一種用于檢測豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系，可用于報告豬瘟病毒的感染以及豬瘟病毒分離培養(yǎng)、抗豬瘟病毒藥物的相關(guān)研究，同時提供了相應(yīng)的制備方法，屬于細(xì)胞生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]【背景技術(shù)】:
病毒分離培養(yǎng)雖然是病原微生物檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但還需用血清學(xué)或分子生物學(xué)方法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，此外整個診斷周期大約需要2-7天的時間。
[0003]免疫學(xué)方法一般檢測待檢樣品中的豬瘟病毒抗體，而病毒的抗體產(chǎn)生一般需要在感染后7天左右，所以此法一般不用于CSF的早期診斷。且如需要獲得病毒，還要進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
[0004]分子生物學(xué)方法費(fèi)用較高，同時易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，且確診CSFV感染后，如需要獲得病毒，還要進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
[0005]病毒感染報告細(xì)胞系既可用于病毒的檢測，也可用于病毒的分離培養(yǎng)。目前公開發(fā)表的報告細(xì)胞系主要是基于激活LTR (長末端重復(fù)序列)及其下游報告基因的細(xì)胞系，且使用的報告蛋白 主要是氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β_半乳糖苷酶、螢火蟲熒光素酶、分泌型堿性磷酸酶等。這些細(xì)胞系在感染相關(guān)病毒后仍需要后續(xù)處理，才能最終得出檢測結(jié)果，而不能快速、直觀地報告病毒感染情況。另外，目前國內(nèi)外關(guān)于豬瘟病毒報告細(xì)胞系的研究尚沒有報道。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明公開了一種用于檢測豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系，該細(xì)胞感染豬瘟病毒后，可以在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，可用于檢測豬瘟病毒的感染以及豬瘟病毒分離培養(yǎng)、抗豬瘟病毒藥物的相關(guān)研究。
[0007]本發(fā)明還提供了豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系的制備方法，適用于人工制備該細(xì)胞系O
[0008]本發(fā)明提供的用于檢測豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系，其特征在于:
該細(xì)胞含有CSFV特異識別的氨基酸序列、GFP熒光淬滅序列以及GFP蛋白。該細(xì)胞感染豬瘟病毒后，可以在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光；而未感染CSFV或感染其他病毒時，該細(xì)胞系不發(fā)出綠色熒光。
[0009]本發(fā)明公開了一種真核表達(dá)報告載體pEGFP-linker-quench,用于構(gòu)建上述豬痕病毒感染的報告細(xì)胞系。
[0010]本發(fā)明構(gòu)建的真核表達(dá)報告載體pEGFP-1 inker-quench是在pEGFP_Cl載體(Clontech)的基礎(chǔ)上，插入人工合成的DNA片段而成。
[0011]本發(fā)明公開的pEGFP-1 inker-quench上插入的人工合成的DNA片段表達(dá)后形成突光淬滅蛋白和CSFV特異性識別并剪切的肽段，且與GFP融合表達(dá)。
[0012]本發(fā)明公開的可編碼熒光淬滅蛋白和CSFV特異性識別并剪切的肽段的DNA序列為:Szagatctacagaaacagaaacagaaacagaaacagaaacagaattgaaggagctagctcagggggataagct
ttgcaac
gattcaagtgatcctcttgttgttgccgcaagtatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatc
gtcttggatcc~3o
[0013]本發(fā)明所述豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系的制備方法，包括以下步驟:
1.人工合成DNA片段
5^agatctacagaaacagaaacagaaacagaaacagaaacagaattgaaggagctagctcagggggataagct
ttgcaacgattc
aagtgatcctcttgttgttgccgcaagtatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatcgtcttMatcc-3，其中劃線部分分別為Bgl II和BamHI酶切位點(diǎn)。
[0014]2.真核表達(dá)報告載體pEGFP-1 inker-quench的構(gòu)建
將上述合成的DNA片段經(jīng)Bgl II和BamHI雙酶切后，連接到真核表達(dá)載體pEGFP-Cl的相應(yīng)酶切位點(diǎn)上，構(gòu)建成真核表達(dá)報告載體pEGFP-1 inker-quench。
[0015]3.豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系的建立
將上述構(gòu)建的真核表達(dá)報告載體pEGFP-1 inker-quench用AseI酶切線性化,用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到PK-15細(xì)胞中，對經(jīng)抗性篩選獲得的陽性細(xì)胞進(jìn)行鑒定，對鑒定正確的陽性細(xì)胞進(jìn)行凍存。
[0016]3.1載體線性化:提取pEGFP-1 inker-quench質(zhì)粒,用AseI酶切,然后乙醇沉淀，用無菌ddH20溶解。
[0017]3.2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染:將線性化的載體按照脂質(zhì)體Fugene HD (Roche)說明書轉(zhuǎn)染PK-15 細(xì)胞，5 % CO2, 37 °C培養(yǎng)。
[0018]3.3報告細(xì)胞系的獲得:上述經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用G418篩選8_10天后，獲得抗性細(xì)胞；
4.豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞的鑒定
采用PCR法及熒光顯微鏡觀察進(jìn)行鑒定，得到豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞。
[0019]本發(fā)明所述報告細(xì)胞系的PCR鑒定方法所用引物序列為:
GFPl:5_tatggatccatggtgagcaagggcgag_3 ；
GFP2:5-tatggtaccttacttgtacagctcgtcca_30
[0020]本發(fā)明采用PCR法及熒光顯微鏡觀察對所獲得的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，已經(jīng)成功獲得了豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞，鑒定結(jié)果證明該細(xì)胞只有感染豬瘟病毒后可發(fā)出綠色熒光，且靈敏性和特異性較強(qiáng)，可用于CSFV感染的相關(guān)研究。
[0021]本發(fā)明的積極效果在于:制備的豬瘟病毒感染報告細(xì)胞系含有CSFV特異識別的氨基酸序列、GFP熒光淬滅序列以及GFP蛋白。該細(xì)胞系只有在感染CSFV后才發(fā)出綠色熒光，不需要后續(xù)處理，可以在病毒感染后快速、直觀地報告病毒感染情況；檢測靈敏度高，而且可以一次分析多個樣本。該報告細(xì)胞系既可以用于CSFV的診斷，也可以用于病毒分離培養(yǎng)、抗病毒藥物篩選及疫苗生產(chǎn)，在臨床檢測、實(shí)驗(yàn)室研究上具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0022]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1.真核表達(dá)報告載體pEGFP-1 inker-quench結(jié)構(gòu)圖；
圖2.報告細(xì)胞PCR鑒定結(jié)果圖；圖3.報告細(xì)胞熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖；
圖4.報告細(xì)胞感染CSFV結(jié)果圖；
圖5.報告細(xì)胞靈敏性分析圖；
圖6.報告細(xì)胞特異性分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下實(shí)施例證明本發(fā)明的效果，下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0024]實(shí)施例1
真核表達(dá)報告載體pEGFP-1 inker-quench的構(gòu)建 I合成DNA片段
5^agatctacagaaacagaaacagaaacagaaacagaaacagaattgaaggagctagctcagggggataagct
ttgcaacg
attcaagtgatcctcttgttgttgccgcaagtatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatcgtcttggatcc-3,其中劃線部分分別為Bgl II和BamHI酶切位點(diǎn)。 [0025]2實(shí)驗(yàn)過程
1)pEGFP-1 inker-quench的構(gòu)建:用Bgl II和BamHI雙酶切pEGFP-Cl載體，回收載體片段；將上述人工合成的DNA片段與回收的pEGFP-Cl載體片段連接；
2)轉(zhuǎn)化將上述連接后的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得陽性菌株；
3)結(jié)果測序鑒定,成功構(gòu)建了pEGFP-1 inker-quench (圖1);
4)結(jié)論成功構(gòu)建了用于制備豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系的表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-1inker-quench。
[0026]實(shí)施例2
豬瘟病毒感染報告細(xì)胞系的制備
I質(zhì)粒 pEGFP-1 inker-quench ；
2細(xì)胞PK-15細(xì)胞；
3實(shí)驗(yàn)過程
O載體線性化:提取pEGFP-1 inker-quench質(zhì)粒,用限制性內(nèi)切酶AseI酶切載體，回收載體，并用無菌ddH20溶解；
2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染:將上述線性化的載體按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑FugeneHD說明書的方法轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液，5 % CO2, 37 °C培養(yǎng)；
3)報告細(xì)胞系的獲得及鑒定:上述經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用G418篩選8-10天后，獲得抗性細(xì)胞；采用PCR法及熒光顯微鏡觀察進(jìn)行鑒定，得到豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞。命名為 PK15-CSFV-GFP 細(xì)胞；
其中，本發(fā)明所述報告細(xì)胞系的PCR鑒定方法所用引物序列為:
GFPl:5_tatggatccatggtgagcaagggcgag_3 ；
GFP2:5_tatggtaccttacttgtacagctcgtcca_3 ；
4)結(jié)果可以用鑒定引物擴(kuò)增出大小約為720bp條帶(圖2)，且在熒光顯微鏡下觀察到該細(xì)胞不發(fā)熒光，與正常細(xì)胞無顯著差異(圖3)，達(dá)到了預(yù)期效果；
5)結(jié)論獲得豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系PK15-CSFV-GFP。
[0027]實(shí)施例3
豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系感染CSFV實(shí)驗(yàn) I細(xì)胞豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系PK15-CSFV-GFP ；
2病毒CSFV ；
2實(shí)驗(yàn)過程PK15-CSFV-GFP細(xì)胞密度達(dá)到50-70%時，感染CSFV(6TCID50)，繼續(xù)培養(yǎng)，并在感染后24，48，72小時用熒光顯微鏡觀察發(fā)光情況；
3結(jié)果在感染CSFV后24，48和72小時均可以觀察到較強(qiáng)的綠色熒光，而在未感染的細(xì)胞中無綠色熒光(圖4)。
[0028]4結(jié)論豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系在CSFV感染后可發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光。
[0029]實(shí)施例4
豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系的靈敏性 I細(xì)胞豬瘟病毒 感染的報告細(xì)胞系PK15-CSFV-GFP ；
2病毒CSFV ；
2實(shí)驗(yàn)過程選取上述豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞，接種不同濃度的CSFV，在感染后48小時用熒光顯微鏡觀察；
3結(jié)果感染48小時后，接種不同濃度CSFV的細(xì)胞中均可以觀察到顯著的綠色熒光，而在對照細(xì)胞中沒有綠色熒光；
4結(jié)論豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系靈敏性較好，可用于檢測CSFV感染相關(guān)研究(圖5)。
[0030]實(shí)施例5
豬瘟病毒感染報告細(xì)胞系的特異性 I細(xì)胞豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系PK15-CSFV-GFP ；
2病毒 CSFV, PRRSV, PRV，PCV2, HEV ；
2實(shí)驗(yàn)過程選取上述豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞，分別接種CSFV，PRRSV, PRV, PCV2，HEV病毒，在感染后48小時用熒光顯微鏡觀察；
3結(jié)果感染CSFV的細(xì)胞中可以觀察到顯著的綠色熒光，而在感染其他病毒的細(xì)胞及對照細(xì)胞中均沒有綠色熒光；
4結(jié)論豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系只在感染CSFV后才發(fā)出綠色熒光(圖6)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系，其特征在于:該細(xì)胞在PK-15細(xì)胞的基礎(chǔ)上插入了 CSFV特異識別的氨基酸序列、GFP熒光淬滅序列以及GFP蛋白。
2.一種真核表達(dá)報告載體pEGFP-linker-quench,其特征在于: 在pEGFP-Cl載體的基礎(chǔ)上，插入SEQ N0.1的人工合成的DNA片段而成。
3.權(quán)利要求1所述的用于檢測豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系的制備方法，包括以下步驟: 1)人工合成DNA片段
5^agatctacagaaacagaaacagaaacagaaacagaaacagaattgaaggagctagctcagggggataagctttgcaac gattcaagtgatcctcttgttgttgccgcaagtatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatcgtcttggatcc-3, 其中，劃線部分分別為Bgl II和BamHI酶切位點(diǎn)； 2)真核表達(dá)報告載體pEGFP-linker-quench的構(gòu)建 將上述合成的DNA片段經(jīng)Bgl II和BamHI雙酶切后，連接到真核表達(dá)載體pEGFP-Cl的相應(yīng)酶切位點(diǎn)上，構(gòu)建成真核表達(dá)報告載體pEGFP-linker-quench ； 3)豬瘟病毒感染的報 告細(xì)胞系的建立及鑒定 將上述構(gòu)建的真核表達(dá)報告載體pEGFP-linker-quench用AseI酶切線性化,用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到PK-15細(xì)胞中，對經(jīng)抗性篩選獲得的陽性細(xì)胞進(jìn)行PCR法及熒光顯微鏡鑒定，對鑒定正確的陽性細(xì)胞進(jìn)行凍存。
4.權(quán)利要求1所述用于檢測豬瘟病毒感染的報告細(xì)胞系的PCR鑒定方法，其特征在于: 所用引物序列為:
GFPl:5_tatggatccatggtgagcaagggcgag_3 ；
GFP2:5-tatggtaccttacttgtacagctcgtcca_30
【文檔編號】C12N5/10GK104017904SQ201410273857
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】任林柱, 陳福旺, 楊鑫, 歐陽紅生, 逢大欣 申請人:吉林大學(xué)