一種同時檢測人的Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型副流感病毒的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術應用領域，涉及一種以TaqMan探針為基礎的同時檢測人的I型、II型及III型副流感病毒的含內質控的多重熒光RT-PCR方法。本發(fā)明針對人的I型、II型及III型副流感病毒代表株的HN基因的保守序列設計特異性引物和探針，建立了含內質控的一步法多重熒光RT-PCR快速檢測方法，操作簡便快捷，克服了常規(guī)單重熒光RT-PCR單孔單檢的繁瑣，簡化了操作程序，節(jié)省了試驗成本，利用其較高的特異性、靈敏度、高效性和穩(wěn)定性為病毒的現(xiàn)場檢測、衛(wèi)生評價、臨床診斷等方面提供了有力的技術支撐。
【專利說明】—種同時檢測人的I型、M型及I I I型副流感病毒的方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術應用領域，尤其是用于人的I型、II型及III型副流感病毒的同時檢測與鑒定。
【背景技術】
[0002]人副流感病毒(Human parainfluenza viruses, HPIVs)屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)是一種能引起感冒并誘發(fā)氣管炎、支氣管炎和肺炎的主要病原體之一，人群普遍易感。副流感病毒粒子呈球形，有包膜，直徑一般為150~250nm，基因組由不分節(jié)段的單股負鏈RNA組成，包含大約15000個堿基，編碼至少6種常見的結構蛋白(3，-N-P-C-M-F-HN-L-5，)。人副流感病毒(HPIVs)可分以分為4個血清型(HPIV1-4)，HPIV-4根據(jù)抗原性的不同又被分成A和B兩個亞型。HPIV-1和HPIV-3屬于人鼻病毒屬，而PIV2和PIV4屬于腮腺炎病毒屬。HPIV-1、HPIV-2和HPIV-3在嬰幼兒、兒童和免疫缺陷人群中引起下呼吸道感染的主要病原體，同時又是青少年和成年人上呼吸道感染的病原體。特別是HPIV-1和HPIV-3是常常在公共場所引起呼吸道感染主要原因之一，而HPIV-4引起的感染一般癥狀比較輕微，臨床上意義不大，很少引起呼吸道感染的暴發(fā)。所以本發(fā)明檢測方法只針對HPIV1-3三個型別的鑒定。
[0003]人副流感病 毒的HN基因編碼的HN蛋白屬于膜蛋白，主要功能是通過與細胞唾液酸受體的結合，促進病毒與宿主細胞的黏附，并且與病毒的釋放有關。免疫學研究發(fā)現(xiàn)HN也是主要的保護性抗原之一，相應的抗體對病毒具有中和作用，因此HN成為臨床檢測以及疫苗研究的主要目標蛋白之一。
[0004]目前，國內外檢測副流感病毒的經典方法是病毒的分離培養(yǎng)，但是其操作煩瑣，耗費時間長；電鏡、免疫組化、ELISA、常規(guī)PCR等具有各自突出的優(yōu)點，但都很難檢測微量核酸和準確定量，20世紀末發(fā)展起來的實時熒光定量PCR技術(Real-time fluorescentquantitative PCR)是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，該技術不僅實現(xiàn)了對模板的定性和定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實驗多重反應、自動化程度高、無污染性、具有實時性和準確性等特點。因而，在呼吸道病原體檢測中具有巨大應用優(yōu)勢。相對普通PCR及單熒光PCR，多重熒光PCR具有以下優(yōu)點:(1)檢測效率高，即多重熒光PCR可以實現(xiàn)一管多檢，通過收集的不同波長的熒光信號來區(qū)分不同的檢測對象，從而簡化操作流程；(2)節(jié)省試劑成本和人員操作時間，尤其在開展大量樣品檢測時，可以顯著地降低檢測成本和操作時間。(3)本方法中含內質控基因的監(jiān)控，在各類標本中，存在各種影響或抑制PCR反應的因素，且在標本的采集處理、核酸提取、擴增和分析過程中，也可能因人為操作失誤而導致產生假陰性檢測結果。因此本申請采用內質控的方法，在標本中含有的內質控基因(LDHA)經歷檢測標本核酸提取、加樣、PCR擴增及信號檢測的全過程，從而可對每一份標本實施監(jiān)控。
[0005]本發(fā)明成功建立的可同時檢測人的I型、II型及III型副流感病毒一步法多重熒光RT-PCR方法，采用LDHA作為內質控，可以有效監(jiān)控樣本中的PCR抑制因素以及由操作誤差所造成的假陰性結果。并且該方法除了具有特異性強、靈敏度高、檢測效率高及穩(wěn)定性的特點之外，其檢測所需要RNA量較少，且操作簡便快速，在副流感病毒的現(xiàn)場檢測、衛(wèi)生評價、臨床診斷等方面顯示出良好的應用前景。并有利于進一步深入研究相關病原體感染的分子機理和免疫調節(jié)機理、開展有效的臨床治療等方面顯示出良好的應用前景。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明是由國家“十二五”科技重大專項2012ZX10004206-002支持的。我們成功設計和合成了針對人的I型、II型及III型副流感病毒相應HN基因特異性引物和探針?；诖艘锖吞结槪覀兘⒘艘徊椒ê瑑荣|控的多重熒光RT-PCR檢測方法。該方法通過對多種相關病毒的檢測、標準曲線的構建、與商品化單重熒光RT-PCR診斷試劑盒比較、重復性試驗等，說明該方法具有較高的特異性、靈敏度、高效性和穩(wěn)定性。
[0007]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種針對人的I型、II型及III型副流感病毒HN基因的特異性引物和探針序列，如SEQ NO:1至12所示。
[0008]在本發(fā)明的第二方面，提供一種同時檢測人的I型、II型及III型副流感病毒的試劑盒，該試劑盒中含有第一方面所述引物和探針。
[0009]在一個實施方案中，所述試劑盒包括以下成份:
[0010]a)反應緩沖液,所述緩沖液為常規(guī)PCR反應緩沖液； [0011]b)反應酶，所述反應酶為常規(guī)PCR反應酶；
[0012]c) SEQ NO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物；
[0013]d)SEQN0:3、6、9、12 所示的探針；
[0014]e)無RNA酶的水。
[0015]其中如SEQNO:3所示的人I型副流感病毒的HN基因探針5’端由FAM標記，3’端由BHQl標記；如SEQ NO:6所示的人II型副流感病毒的HN基因探針5’端由JOE標記，3’端由BHQl標記；如SEQ NO:9所示的人III型副流感病毒的HN基因探針5’端由ROX標記，3’端由BHQ2標記；如SEQ NO:12所示的質控基因LDHA基因探針5’端由CY5標記，3’端由BHQ2標記。
[0016]在一個具體實施方案中，所述方法為一步法多重熒光RT-PCR檢測試劑盒的具體應用，并使用所述引物和探針作為檢測序列。
[0017]在本發(fā)明的第三方面，提供一種同時檢測人的I型、II型及III型副流感病毒的PCR擴增方法，該方法使用第二方面所述的試劑盒。
[0018]在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟:
[0019]a)四個熒光通道的設置；
[0020]b)反轉錄的溫度與時間；
[0021]c)預熱的溫度與時間；
[0022]d)熱循環(huán)(預熱溫度與時間、退火溫度與時間、熒光收集溫度、循環(huán)數(shù))；
[0023]e)以界定的Ct值來判定檢測結果。
[0024]在本發(fā)明的第四方面，提供第一方面所述引物和探針在制備人的I型、II型及III型副流感病毒的檢測試劑中的應用?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0025]圖1.人I型副流感病毒、人II型副流感病毒、人III型副流感病毒一步法含內質控的多重熒光RT-PCR檢測方法的特異性鑒定，其中:
[0026]圖1A為同時加入人I型副流感病毒、人II型副流感病毒、人III型副流感病毒陽性模板的熒光擴增圖。
[0027]圖1B為加入其他7種呼吸道多病原的陽性模板的熒光擴增圖(以甲型流感病毒為例)。
【具體實施方式】
[0028]本發(fā)明所述人的I型、II型及III型副流感病毒多重熒光RT-PCR檢測方法，是基于相應型別HN基因保守區(qū)設計的特異性引物和探針。
[0029]本發(fā)明的技術途徑是首先利用Appl ied B1systems (ABI)公司開發(fā)的PrimerExpress3.0軟件、針對人的I型、II型及III型副流感病毒相應HN基因的保守區(qū)設計特異性引物和探針序列，確定了最佳配制體系及上機擴增程序，并且進行特異性、靈敏度及穩(wěn)定性等驗證實驗，成功建立了人的I型、II型及III型副流感病毒一步法多重熒光RT-PCR快速檢測方法。下面結合優(yōu)選實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體的實驗方法，通常按照常規(guī)條件和方法，如分子克隆實驗室手冊(Sambrook, et al.New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)及實時熒光PCR技術(李金明，2007)中所述方法或試劑制造商提供的方法。 [0030]同時，需要指出的是，本發(fā)明所述的檢測方法和試劑盒不僅應用于對患者(人、動物)的樣品進行檢測，也包括對環(huán)境中的水樣品、食物樣品、空氣樣品、微生物樣品、動物細胞樣品等多種樣品的非診斷目的的檢測。其應用也都是本領域技術的常用技術手段，并不需要進行特別的、富有創(chuàng)造性的改變。
[0031]實施例1.人的I型、II型及III型副流感病毒各型別HN基因特異性引物和探針設計與合成
[0032]1.1人的I型、II型及III型副流感病毒代表株的相應靶基因HN的選擇及保守區(qū)的確定本研究所用的序列選自NCBI GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中，主要選擇依據(jù)為:(a)年代較近毒株；(b)具有全長序列及主體序列毒株；(c)同亞型序列比對后選取具有代表性的毒株。選取的人的I型、II型及III型副流感病毒代表株的相應HN基因的?目息見表1_1、1_2及1_3。
[0033]本研究分別將所選擇的人的I型、II型及III型副流感病毒代表株的相應HN基因輸入到DNAssist軟件中進行同源比對，確定了相應亞型HN基因的序列保守區(qū)，為引物和探針設計提供了靶區(qū)。
[0034]表1-1.選取人I型副流感病毒(PIVl)代表毒株的HN基因信息
[0035]
【權利要求】
1.一種同時檢測人的I型、II型及III型副流感病毒的方法，其特征在于是含內質控的一步法多重熒光RT-PCR，其特異性引物和探針序列分別為: 1)SEQNO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物； 2)SEQ NO:3、6、9、12 所示的探針。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于如SEQNO:3所示的人I型副流感病毒的HN基因探針5’端由FAM標記，3’端由BHQl標記；如SEQ NO:6所示的人II型副流感病毒的HN基因探針5’端由JOE標記，3’端由BHQl標記；如SEQ NO:9所示的人III型副流感病毒的HN基因探針5’端由ROX標記，3’端由BHQ2標記；如SEQ NO:12所示的內質控基因LDHA基因探針5’端由CY5標記，3’端由BHQ2標記。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述多重熒光RT-PCR的反應體系: a)反應緩沖液； b)反應酶； c)SEQNO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物； d)SEQ NO:3、6、9、12 所示的探針 e)無RNA酶的水補 足體系要求的體積。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述多重熒光RT-PCR的反應條件如下: a)四個熒光通道的設置； b)反轉錄的溫度與時間； c)預熱的溫度與時間； d)熱循環(huán)(預熱溫度與時間、退火溫度與時間、熒光收集溫度、循環(huán)數(shù))； e)以界定的Ct值來判定檢測結果。
5.如權利要求1所述方法在檢測食品及原料、環(huán)境樣本中I型、II型及III型副流感病毒中的用途。
6.權利要求1所述的引物和探針序列在制備I型、II型及III型副流感病毒的檢測試劑中的應用。
7.一種同時檢測I型、II型及III型副流感病毒的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有特異性引物和探針，其序列分別為: 1)SEQNO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物； 2)SEQ NO:3、6、9、12 所示的探針。
8.權利要求7所述的試劑盒在制備I型、II型及III型副流感病毒的診斷試劑中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104032035SQ201410275579
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權日:2014年6月18日
【發(fā)明者】黃芳, 崔淑娟, 石偉先, 王海濱, 張玉松, 陳萌, 于霞麗, 李愛華 申請人:黃芳