細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑及其應(yīng)用，所述的細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑是由23個(gè)氨基酸組成的肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO.1。本發(fā)明的細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑不僅具備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，高轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性小的特點(diǎn)，而且轉(zhuǎn)染時(shí)無需進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作，尤其適合各種高通量細(xì)胞篩選實(shí)驗(yàn)，方便，快速，高效。該試劑的這些特點(diǎn)創(chuàng)造性地解決了高效輸送各種核酸分子到達(dá)目的地的難題。
【專利說明】細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑及其 應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞膜是防止細(xì)胞外物質(zhì)自由進(jìn)入細(xì)胞的屏障，它保證了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn) 定。也正是因?yàn)榧?xì)胞膜的生物屏障作用阻止了許多生物大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而很大 程度地限制了這些物質(zhì)在治療領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，如何引導(dǎo)這些物質(zhì)穿透細(xì)胞膜是一個(gè)迫 切需要解決的問題。
[0003] 介導(dǎo)生物大分子穿透細(xì)胞膜的方法主要包括細(xì)胞穿透肽（cellpenetrating peptides，CPPs)、脂質(zhì)體（liposome)、腺病毒（adenovirus)、納米顆粒（nanoparticle)等。 其中，細(xì)胞穿透肽是一類以非受體依賴，非經(jīng)典內(nèi)吞方式直接穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的多肽， 它富含堿性氨基酸，氨基酸序列通常帶正電荷。細(xì)胞穿透肽的一個(gè)重要特點(diǎn)是可以攜帶 多種不同大小和性質(zhì)的生物活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，包括小分子化合物、染料、核酸、質(zhì)粒DNA、 SiRNA、多肽、蛋白質(zhì)等。細(xì)胞穿透肽作為載體的優(yōu)勢(shì)在于低毒性和無細(xì)胞類型的限制，這一 性質(zhì)為其成為靶向藥物的候選載體提供了可能。其實(shí)際應(yīng)用多集中于各種大分子物質(zhì)，包 括siRNA和質(zhì)粒DNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。
[0004]目前被廣泛應(yīng)用的細(xì)胞穿透肽包括TAT肽（HIV-ι的TAT蛋白功能區(qū)），穿膜肽 (transportan)，寡聚精氨酸[poly(arginine) 9,R9]，MPG(融合HIV-Igp41 的蛋白功能區(qū) 和SV40T抗原的核定位序列）等，盡管細(xì)胞穿透肽本身可以快速和高效的進(jìn)入細(xì)胞，但其實(shí) 際應(yīng)用中的主要問題在于如何優(yōu)化設(shè)計(jì)細(xì)胞穿透肽，使其能有效的結(jié)合siRNA或質(zhì)粒DNA， 高效的進(jìn)入細(xì)胞，快速擺脫內(nèi)涵體或溶酶體導(dǎo)致的降解，將siRNA或質(zhì)粒DNA傳遞到相應(yīng)的 細(xì)胞內(nèi)的作用部位。然而，現(xiàn)有的細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率不高，因此如何獲得高效的 細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑是本領(lǐng)域的技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)特缺陷，本發(fā)明提供一種新型的細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑及其應(yīng) 用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明涉及一種細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑，其特征在于所述的細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑是 由23個(gè)氨基酸組成的肽鏈，其氨基酸序列為SEQIDNO. 1。
[0007] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑是通過固相肽合成 法獲得的。
[0008] 本發(fā)明另一方面還涉及所述的細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑核酸分子轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。
[0009] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染時(shí)無需進(jìn)行培養(yǎng)基更換操 作。
[0010] 本發(fā)明的細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑不僅具備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，高轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性小的特 點(diǎn)，而且轉(zhuǎn)染時(shí)無需進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作，尤其適合各種高通量細(xì)胞篩選實(shí)驗(yàn)，方便，快速， 高效。該試劑的這些特點(diǎn)創(chuàng)造性地解決了高效輸送各種核酸分子到達(dá)目的地的難題。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖I:FITC螢光標(biāo)記的細(xì)胞穿透肽廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)呈綠色熒光。（B， 20μgFAM-標(biāo)記的細(xì)胞穿透肽與180μL細(xì)胞培養(yǎng)基混合后加入到A549細(xì)胞中；A.作為對(duì) 照，相同量的PBS溶液與PBS混合后加入到Α549細(xì)胞中，細(xì)胞核由DAPI染色后呈現(xiàn)藍(lán)色。）
[0012] 圖2 :細(xì)胞穿透肽介導(dǎo)的DY547螢光標(biāo)記的siRNA廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)呈紅色熒 光。B為細(xì)胞穿透肽與180μL細(xì)胞培養(yǎng)基混合后加入到Α549細(xì)胞中。作為對(duì)照，相同量的 PBS溶液與PBS混合后加入到Α549細(xì)胞中，細(xì)胞漿中無紅色熒光顯現(xiàn)。細(xì)胞核由DAPI染色 后呈現(xiàn)藍(lán)色（A)。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0014] 實(shí)施例1:
[0015] 多肽合成
[0016] 多肽合成之后，在美國(guó)金斯特科技股份有限公司（Piscataway,NJ)利用高效液相 色譜法進(jìn)行純化（純度> 95% )。配制FAM(0.ImM)、二異丙基乙胺（0. 5mM)和二氨基甲酰 胺（DMF)混合液，將樹脂固定的多肽（0.ImM)在混合液中孵育12h，使得熒光素集團(tuán)（FAM) 通過氨基乙酸標(biāo)記在多肽的N端。在色譜柱C18中利用反相高效液相層析法對(duì)多肽混合物 進(jìn)行分析純化后，將純化的多肽利用電噴霧電離質(zhì)譜法（ESI-MS)分析。
[0017]siRNAs合成
[0018] 抗PPIB蛋白的DY547標(biāo)記的siRNA由賽默飛世爾科技合成。DY547標(biāo)記的對(duì)照 siRNA購(gòu)買自賽默飛世爾科技Dharmacon。
[0019] 細(xì)胞穿透肽在A549細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)（圖1)
[0020] 將20μIFAM標(biāo)記的細(xì)胞穿透肽加入到180μ1的培養(yǎng)基（DMEM)中，隨后將混合 液加入到Α549細(xì)胞中。作為對(duì)照組，利用等量的PBS將細(xì)胞穿透肽代替。37°C下，將Α549 細(xì)胞培養(yǎng)24h，利用熒光顯微技術(shù)進(jìn)行觀察。
[0021] 在小鼠NRK52細(xì)胞中由細(xì)胞穿透肽介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)
[0022] 常溫下，將IOOnM抗PPIB的siRNA和對(duì)照siRNA/多肽分別在混合液[DMEM+2mM 谷氨酰胺+1%非必需氨基酸（NEAA)+5-10%胎牛血清（FBS)，LifeTechnologies]中共同 孵育15min。同時(shí)，將膠原蛋白I包被的八孔小室載玻片（BDBiosciences，SanJose，CA) 上生長(zhǎng)至融合狀態(tài)達(dá)到?60%的NRK52E細(xì)胞用培養(yǎng)基清洗3次。然后，將細(xì)胞與siRNA或 多肽/siRNA混合液共同孵育24h，最后利用熒光顯微技術(shù)觀察。
[0023] 突光顯微技術(shù)
[0024] 在常溫下，將固定在膠原蛋白I包被的八孔小室載玻片（BDBiosciences,San Jose，CA)上的細(xì)胞利用含3 %多聚甲醛的PBS緩沖液中清洗10min，然后將滴有抗熒光衰減 劑和 4'，6-diamidino_2-phenylindole(DAPI，VECTORLaboratories,Burlingame,CA)的 蓋玻片蓋在載玻片上。利用Zeiss(Thornwood,NY)AxioObserverDl顯微鏡進(jìn)行突光信號(hào) 和圖像采集。利用倒置顯微鏡LDA-PlanX20/0.3Phl objective對(duì)固定后的細(xì)胞拍照，轉(zhuǎn) 染效率超過90%。
[0025]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來 說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
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【權(quán)利要求】
1. 一種細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑，其特征在于所述的細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑是由23個(gè)氨基 酸組成的肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑，所述的細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑是通過固 相肽合成法獲得的。
3. 權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞穿透肽轉(zhuǎn)染試劑核酸分子轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，所述的轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染時(shí)無需進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作。
【文檔編號(hào)】C12N15/87GK104262466SQ201410275600
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】肖涵, 段建熊, 張磊 申請(qǐng)人:山西國(guó)信凱爾生物技術(shù)有限公司