一種用于血液中全基因組dna提取試劑盒及其方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從血液中提取全基因組DNA的試劑盒及其使用方法。其特征在于試劑盒包括紅細(xì)胞裂解液、白細(xì)胞洗滌液、消化液、蛋白酶K、純化液、gDNA鹽析液、gDNA洗滌液及gDNA洗脫液等。本發(fā)明血液中全基因組DNA提取試劑盒使用方法的特征在于采用裂解紅細(xì)胞后洗滌得到白細(xì)胞，將含有蛋白酶K的消化液裂解白細(xì)胞，通過(guò)改進(jìn)的氯化鋰純化液進(jìn)一步純化后鹽析液層析獲得高純度全基因組DNA。本發(fā)明試劑盒提取血液中全基因組DNA時(shí)，不用事先對(duì)血液中進(jìn)行血漿和血清分離，只需取新鮮或冰凍的抗凝全血，最低需要的血量可達(dá)到20μl或者血斑即可。本發(fā)明試劑盒獲得純度更高的全基因組DNA可完全解鏈和高效地進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用于PCR擴(kuò)增、基因表達(dá)、基因測(cè)序、全基因組測(cè)序、外顯子組測(cè)序、基因突變和單核苷酸多態(tài)性等科研或臨床診斷分析。
【專利說(shuō)明】—種用于血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從血液中提取全基因組DNA的試劑盒及利用其從血液中提取全基因組DNA的方法。本發(fā)明所述試劑盒提取血液中全基因組DNA時(shí)，不用事先對(duì)血液中進(jìn)行血漿和血清分離，只需取新鮮或冰凍的抗凝全血，最低需要的血量可達(dá)到20 μ I或者血斑即可。其高效提取獲得的高純度的全基因組DNA，可用于PCR擴(kuò)增、基因表達(dá)、基因測(cè)序、全基因組測(cè)序、外顯子組測(cè)序、基因突變和單核苷酸多態(tài)性等科研或臨床診斷分析。。
【背景技術(shù)】
[0002]全基因組DNA (genomic DNA, gDNA)為單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部基因信息。所有的生命信息均可以從全基因組DNA中發(fā)現(xiàn)，包括與疾病密切相關(guān)的基因表達(dá)、基因突變和單核苷酸多態(tài)性等問題。從基因水平分析可以早發(fā)現(xiàn)、早診斷所用疾病的發(fā)生，在分子遺傳學(xué)和臨床檢測(cè)中DNA檢查已有逐步取代血清學(xué)檢查(ELISA檢測(cè))。因而，獲取全基因組DNA是所有相關(guān)的科研和臨床檢測(cè)的第一步，聞效率提取獲得聞純度的全基因組DNA是至關(guān)重要的。
[0003]目前經(jīng)典基因組DNA提取方法主要分為4個(gè)步驟:1.使用淋巴細(xì)胞分離液梯度離心分離得到血液中白細(xì)胞，或者直接低滲透裂解紅細(xì)胞后離心收集白細(xì)胞；2.使用細(xì)胞裂解液裂解白細(xì)胞釋放出基因組DNA，如高氯酸鈉法、SDS法、NaI法和尿素提取法等；3.有機(jī)溶劑抽提去除蛋白質(zhì)和血紅素等雜質(zhì)，即酚/氯仿抽提；4.用乙醇沉淀或透析等沉淀分離DNA。該方法具有提取的DNA純度高、蛋白質(zhì)和血紅素等雜質(zhì)少的優(yōu)點(diǎn)，但該方法需要的血液樣本大，殘留DNA溶液中含有酚類等有機(jī)物質(zhì)對(duì)DNA聚合酶有抑制作用，特別是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)對(duì)擴(kuò)增過(guò)程產(chǎn)生抑制作用。另外，酚、氯仿和異丙醇等有機(jī)溶劑易造成環(huán)境污染，有損操作者健康，使得該方法的應(yīng)用受到一定的限制。
[0004]基因組DNA非有機(jī)溶劑提取法采用細(xì)胞裂解液使白細(xì)胞釋放DNA，使用蛋白酶K、蛋白酶E、蛋白酶K和核糖核酸酶和強(qiáng)堿(NaOH或Κ0Η)等對(duì)蛋白質(zhì)和RNA進(jìn)行允分消化分解。在高鹽的條件下用乙醇直接沉淀分離純化DNA。該方法避免了使用有毒作用的有機(jī)溶劑，提取的DNA純度較高和提取效率高，但其需要的血量大，單獨(dú)使用蛋白酶消化時(shí)間很長(zhǎng)，可能對(duì)白細(xì)胞裂解不充分，另外使用強(qiáng)堿對(duì)操作者健康不利，也可能影響后續(xù)PCR擴(kuò)增效率。
[0005]硅膠膜離心吸附柱方法利用硅膠膜特異性吸附DNA能力，通過(guò)漂洗取出蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，后用低鹽溶液洗脫得到基因組DNA，操作中未用到酚、氯仿等有機(jī)溶劑以及強(qiáng)堿，但用離心柱提取的gDNA容易產(chǎn)生拖尾，表明其提取的gDNA純度不高，或有降解的產(chǎn)生。
[0006]血液中全基因組DNA提取方法必須減少有機(jī)溶劑或強(qiáng)堿對(duì)操作者健康和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，在微量的血液樣本時(shí)也能高效提取全基因組DNA，因此，使用高效裂解白細(xì)胞和純化gDNA以及不進(jìn)行血清和血漿分離的試劑盒，對(duì)高效提取高純度全基因DNA具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種從血液中高效地提取全基因組DNA的試劑盒及其從血液中提取全基因組DNA的方法，用以解決減少有機(jī)溶劑或強(qiáng)堿對(duì)操作者健康和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響等問題，即使在微量的血液樣本時(shí)也能高效提取得到高純度的全基因組DNA。
[0008]通過(guò)發(fā)明人多年來(lái)對(duì)上萬(wàn)例臨床血液樣本的提取全基因組DNA工作經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)改進(jìn)，發(fā)現(xiàn)在含有 lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0)，0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)，0.2mol/LNaCl，10% SDS的消化液中添加20mg/ml蛋白酶K，處理后能高效地裂解白細(xì)胞，可以分解與DNA結(jié)合在一起的核蛋白，使DNA被游離釋放在消化液中。也發(fā)現(xiàn)采用LiCl可沉淀糖類、脂類、大量蛋白質(zhì)和高分子RNA，在向水浴過(guò)夜后白細(xì)胞的裂解混合液中加入含7.5mol/L LiCl的純化液可大量去除糖類、脂類、蛋白質(zhì)和高分子RNA等雜質(zhì)，該過(guò)程無(wú)需再使用RNA酶消化處理，即可去除大量RNA。
[0009]本發(fā)明采用價(jià)格廉價(jià)的預(yù)冷無(wú)水乙醇即可析出大量全基因組DNA，不需要通過(guò)有機(jī)溶劑進(jìn)行抽提。并且應(yīng)用80%乙醇的洗滌液進(jìn)行洗滌和含lmol/LTris-HCl (pH值8.0)，
0.5mol/LEDTA(pH值8.0)的洗脫液進(jìn)行洗脫，將獲得高純度的全基因組DNA。因而，在此基礎(chǔ)上研發(fā)可高效從血液中提取高純度的全基因組DNA的試劑盒及其方法。
[0010]本發(fā)明所提供的一種血液中全基因組DNA提取試劑盒，其特征在于各組成分別為:
[0011]I)紅細(xì)胞裂解液:滅菌的去離子超純水(電阻率大于18MQ*cm)，400ml/瓶；
[0012]2)白細(xì)胞洗滌液:為0.1% (體積比)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-XlOO)，300ml/ 瓶:
[0013]3)消化液:含lmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH值8.0),0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA) (pH值 8.0)，0.2mol/L NaCl, 10% (質(zhì)量體積比)十二烷基硫酸(SDS)，40ml/支；
[0014]4)蛋白酶K:為20mg/ml蛋白酶K, Iml/支；
[0015]5)純化液:為5-7.5mol/L氯化鋰(LiCl)、氯化鈉或氯化鉀，40ml/瓶；
[0016]6) gDNA鹽析液:無(wú)水乙醇，500ml/瓶；
[0017]7) gDNA洗滌液:為80% (體積比)乙醇，40ml/瓶；
[0018]8) gDNA 洗脫液:含 lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0)，0.5mol/L EDTA (pH值 8.0)，IOml/支。
[0019]上述gDNA提取試劑盒組份可用于Iml血量的50次血液中全基因組DNA提取，并可組成100次、200次和500次等gDNA提取試劑盒，含使用說(shuō)明書一份，試劑盒保存在4°C冰箱。
[0020]所述血液中全基因組DNA提取試劑盒中純化液，優(yōu)選地為7.5mol/L氯化鋰(LiCl)。
[0021]本發(fā)明所提供的血液中提取全基因組DNA的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0022]I)血液紅細(xì)胞裂解:先向每個(gè)15ml離心管中加入等于血液樣本8倍體積的紅細(xì)胞裂解液，將血液樣本加入該離心管中，手動(dòng)振蕩混勻，4°C放置20~30min后2000rpm(轉(zhuǎn)每分鐘)低速離心15min ;離心結(jié)束后，將上清液棄之(凍存血液需先放入37°C水浴鍋中水浴，至血液樣本融化后加入到紅細(xì)胞裂解液中)；[0023]2)白細(xì)胞洗滌:向含白細(xì)胞沉淀的15ml離心管中加入2~3ml的白細(xì)胞洗滌液，混勻后放入低速水平離心機(jī)，2000rpm低速離心15min，將上清液小心棄之，可重復(fù)洗滌一次；
[0024]3)白細(xì)胞消化裂解:取0.2ml蛋白酶K加入到消化液中混勻，向每一份白細(xì)胞沉淀中加入700 μ I “消化液+蛋白酶K”的混合溶液，吹打混勻后，轉(zhuǎn)移至2.0ml離心管中，56°C水浴2-3h，沉淀消失后37°C水浴過(guò)夜；
[0025]4)細(xì)胞雜質(zhì)沉淀:向水浴過(guò)夜后的混合液中分別加入800μ I純化液，振蕩混勻，放入-20°C冰箱30min-lh ;然后13000rpm高速離心10min，將離心后的上清液倒入新的
2.0ml離心管中；
[0026]5) gDNA析出:上述離心后上清液快速充分震蕩混勻，并迅速倒入裝有13ml預(yù)冷無(wú)水乙醇的15ml離心管中；待gDNA逐漸析出，用移液器將肉眼可見的絮狀漂浮物小心地挑起，轉(zhuǎn)移至加有800 μ I gDNA洗滌液的1.5ml離心管中；
[0027]6) gDNA洗漆:收集完析出的gDNA后15000rpm高速離心10min,棄上清,可重復(fù)洗滌一次；洗滌完畢的gDHA敞口在超凈臺(tái)中開風(fēng)機(jī)放置，至gDNA洗滌液完全揮發(fā)；
[0028]7) gDNA洗脫:向揮發(fā)干的gDNA中加入100-200 μ I的gDNA洗脫液，震蕩混勻，在4°C冰箱中至gDNA完全溶解，即得到高純度全基因組DNA，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0029]本發(fā)明提供的用于血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法不限于人類的抗凝血，還可以用于哺乳 動(dòng)物、禽類、兩棲類動(dòng)物等；需要的血液樣品量最低可以達(dá)到20μ 1，甚至血斑和血跡，均可提取得到高純度的全基因組DNA。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的用于血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法還可以用于冷凍儲(chǔ)存的血液，包括在_20°C冰箱、-80°C冰箱或液氮儲(chǔ)存的血液樣本。
[0030]通過(guò)本發(fā)明所述的試劑盒及其方法得到的高純度gDNA，其特征在于經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為單一條帶，無(wú)拖尾和雜帶；超微量分光光度計(jì)檢測(cè)A260 /A280比值大于1.8，表明無(wú)蛋白和酚類物質(zhì)污染；A260/A230的比值大于2.0，表明無(wú)碳水化合物(糖類)、鹽類或有機(jī)溶劑污染；超微量分光光度計(jì)檢測(cè)Iml血量提取的gDNA效率可達(dá)到20 μ g/ml以上；滿足所有基因研究和檢測(cè)的樣品要求。
[0031]與其它方法相比，本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在:
[0032]1.不用對(duì)血液中進(jìn)行預(yù)處理，直接使用血液進(jìn)行全基因組DNA提取，特別是使用冷凍儲(chǔ)存的血液，因此減少二次污染機(jī)會(huì)，在科研工作和臨床檢測(cè)中提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度，使結(jié)果更加真實(shí)可信。
[0033]2.如果血液樣本量很低或是血斑時(shí)，傳統(tǒng)方法很難獲取到數(shù)量高的gDNA，本發(fā)明利用了血液中基因組DNA充分從白細(xì)胞中釋放出來(lái)并減少蛋白質(zhì)和RNA的干擾，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，適用于微量的gDNA提取和檢測(cè)。
[0034]3.本發(fā)明使用的試劑中不含苯、氯仿等有毒物質(zhì)，對(duì)人體無(wú)危害。
[0035]4.本發(fā)明所用的LiCl純化液可沉淀糖類、脂類、大量蛋白質(zhì)和高分子RNA，無(wú)需用RNA酶，提取出來(lái)的gDNA純度高和數(shù)量多，可以直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)和后續(xù)工作。
[0036]本發(fā)明提供的血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法用于科研或臨床診斷用的PCR擴(kuò)增、基因表達(dá)、基因測(cè)序、全基因組測(cè)序、外顯子組測(cè)序、基因突變和單核苷酸多態(tài)性等分析?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1表示本發(fā)明所述的試劑盒及其方法提取血液中的全基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖。
[0038]圖2表示本發(fā)明所述的試劑盒及其方法提取血跡中的全基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039]本發(fā)明通過(guò)自主設(shè)計(jì)的含有l(wèi)mol/L Tris-HCl (pH 值 8.0)，0.5mol/L EDTA (pH 值
8.0),0.2mol/L NaCl, 10% SDS的消化液中聯(lián)合20mg/ml蛋白酶K，經(jīng)過(guò)56°C水浴2_3h，沉淀消失后37°C水浴過(guò)夜處理能高效地裂解白細(xì)胞，可以分解與DNA結(jié)合在一起的核蛋白，使DNA被游離釋放在消化液中。在向水浴過(guò)夜后白細(xì)胞的裂解混合液中加入含7.5mol/LLiCl的純化液可大量去除蛋白質(zhì)和高分子RNA等雜質(zhì)。
[0040]本發(fā)明采用價(jià)格廉價(jià)的預(yù)冷無(wú)水乙醇即可析出大量全基因組DNA，不需要通過(guò)有機(jī)溶劑進(jìn)行抽提。并且應(yīng)用80%乙醇的洗滌液進(jìn)行洗滌和含lmol/LTris-HCl (pH值8.0)，
0.5mol/LEDTA(pH值8.0)的洗脫液進(jìn)行洗脫，將獲得高純度的全基因組DNA。因而，在此基礎(chǔ)上研發(fā)可高效從血液中提取高純度的全基因組DNA的試劑盒及其方法。
[0041]本發(fā)明所提供的一種血液中全基因組DNA提取試劑盒，其特征在于各組成分別為:
[0042]I)紅細(xì)胞裂解液:滅菌的去離子超純水(電阻率大于18MQ*cm)，400ml/瓶；
[0043]2)白細(xì)胞洗滌液:為0.1% (體積比)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-XlOO)，300ml/ 瓶:
[0044]3)消化液:含lmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH值8.0),0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA) (pH值 8.0)，0.2mol/L NaCl, 10% (質(zhì)量體積比)十二烷基硫酸(SDS)，40ml/支；
[0045]4)蛋白酶K:為20mg/ml蛋白酶K, Iml/支；
[0046]5)純化液:為 5-7.5mol/L 氯化鋰(LiCl)，40ml/ 瓶；
[0047]6) gDNA鹽析液:無(wú)水乙醇，500ml/瓶；
[0048]7) gDNA洗滌液:為8O % (體積比)乙醇，40ml/瓶；
[0049]8) gDNA 洗脫液:含 lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0)，0.5mol/L EDTA (pH值 8.0)，IOml/支。
[0050]本發(fā)明所提供的血液中全基因組DNA提取試劑盒的各組成制備方法如下:
[0051]I)紅細(xì)胞裂解液，去離子超純水(ddH20)(電阻率大于18ΜΩ*αιι)，經(jīng)121°C，100千帕壓強(qiáng)下滅菌20分鐘處理；
[0052]2)白細(xì)胞洗滌液，50ml Triton-XlOO加入400ml滅菌的去離子超純水中，68°C助溶，定容至500ml，制備成10% Triton-XlOO的母液；然后將IOml 10% Triton-XlOO母液加入990ml滅菌的去離子超純水中配制成0.1% Triton-XlOO的白細(xì)胞洗滌液；
[0053]3)消化液:60.55g Tris 堿溶于 400mlddH20 中，用 HCl 調(diào) pH 值 8.0 (濃 HCl 約加2.0ml)，用ddH20定容至500ml,經(jīng)121 °C, 100千帕壓強(qiáng)下滅菌20分鐘配制成lmol/LTris-HCl (pH 值 8.0)；
[0054]93.05g EDTA-Na 鹽磁力攪拌溶于 400ml ddH20 中，用 NaOH 調(diào) pH 值 8.0 (NaOH 顆粒約加入IOg)，用ddH20定容至500ml，經(jīng)121 °C，100千帕壓強(qiáng)下滅菌20分鐘配制成0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)；
[0055]5.844g NaCl 溶于 400ml ddH20 中，定容至 500ml，經(jīng) 121 °C，100 千帕壓強(qiáng)下滅菌 20分鐘配制成0.2mol/L NaCl ；
[0056]20.0g SDS溶于160ml滅菌的ddH20中，68°C助溶,用滅菌的ddH20定容至200ml,配制成10% SDS ；
[0057]分別取lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0) 5ml,0.5mol/L EDTA(pH 值 8.0) 10ml,0.2mol/LNaC125mlU0% SDS25ml，用滅菌的ddH20定容至500ml，配制成消化液。
[0058]4)蛋白酶K, IOOmg蛋白酶K干粉,加入5ml滅菌的ddH20,顛倒混勻，分裝成20ng/ul 200ul，存放于-20°C冰箱中備用；
[0059]5)純化液，158.96g無(wú)水LiCl磁力攪拌，溶于400ml滅菌的ddH20中，用滅菌的ddH20定容至500ml,配制成純化液；
[0060]6) gDNA析出液，分析純無(wú)水乙醇，-20°C冰箱預(yù)冷，即為gDNA析出液；
[0061]7) gDNA洗滌液，取400ml分析純無(wú)水乙醇至500ml無(wú)菌玻璃瓶中，加100mL滅菌的ddH20,顛倒混勻，配制成gDNA洗漆液；
[0062]8) gDNA 洗脫液，60.55g Tris 堿溶于 400ml ddH20 中，用 HCl 調(diào) pH 值 8.0 (濃 HCl約加2.0ml)，用ddH20定容至500ml，經(jīng)121。。，100千帕壓強(qiáng)下滅菌20分鐘配制成lmol/LTris-HCl(pH值 8.0)；
[0063]93.05g EDTA-Na 鹽磁力攪拌溶于 400ml ddH20 中，用 NaOH 調(diào) pH 值 8.0 (NaOH 顆粒約加入IOg)，用ddH20定容至500ml，經(jīng)121 °C，100千帕壓強(qiáng)下滅菌20分鐘配制成0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)；
[0064]分別取lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0) 5ml 和 0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0) Iml 用滅菌的ddH20定容至500ml,配制成gDNA洗脫液。
[0065]上述gDNA提取試劑盒組份可用于Iml血量的50次血液中全基因組DNA提取，并可組成100次、200次和500次等gDNA提取試劑盒，含使用說(shuō)明書一份，試劑盒保存在4°C冰箱，有效期I年。
[0066]所述血液中全基因組DNA提取試劑盒中純化液，優(yōu)選地為7.5moI/L氯化鋰(LiCl)。
[0067]本發(fā)明所提供的血液中提取全基因組DNA的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0068]I)血液紅細(xì)胞裂解:先向每個(gè)15ml離心管中加入等于血液樣本8倍體積的紅細(xì)胞裂解液，將血液樣本加入該離心管中，手動(dòng)振蕩混勻，4°C放置20~30min后2000rpm(轉(zhuǎn)每分鐘)低速離心15min ;離心結(jié)束后，將上清液棄之(凍存血液需先放入37°C水浴鍋中水浴，至血液樣本融化后加入到紅細(xì)胞裂解液中)；
[0069]2)白細(xì)胞洗滌:向含白細(xì)胞沉淀的15ml離心管中加入2~3ml的白細(xì)胞洗滌液，混勻后放入低速水平離心機(jī)，2000rpm低速離心15min，將上清液小心棄之，可重復(fù)洗滌一次；
[0070]3)白細(xì)胞消化裂解:取0.2ml蛋白酶K加入到消化液中混勻，向每一份白細(xì)胞沉淀中加入700 μ I “消化液+蛋白酶K”的混合溶液，吹打混勻后，轉(zhuǎn)移至2.0ml離心管中，56°C水浴2-3h，沉淀消失后37°C水浴過(guò)夜；
[0071]4)細(xì)胞雜質(zhì)沉淀:向水浴過(guò)夜后的混合液中分別加入800μ I純化液，振蕩混勻，放入-20°C冰箱30min-lh ;然后13000rpm高速離心10min，將離心后的上清液倒入新的
2.0ml離心管中；
[0072]5) gDNA析出:上述離心后上清液快速充分震蕩混勻，并迅速倒入裝有13ml預(yù)冷無(wú)水乙醇的15ml離心管中；待gDNA逐漸析出，用移液器將肉眼可見的絮狀漂浮物小心地挑起，轉(zhuǎn)移至加有800 μ I gDNA洗滌液的1.5ml離心管中；
[0073]6) gDNA洗漆:收集完析出的gDNA后15000rpm高速離心10min,棄上清,可重復(fù)洗滌一次；洗滌完畢的gDNA敞口在超凈臺(tái)中開風(fēng)機(jī)放置，至gDNA洗滌液完全揮發(fā)；
[0074]7) gDNA洗脫:向揮發(fā)干的gDNA中加入100-200 μ I的gDNA洗脫液，震蕩混勻，在4°C冰箱中至gDNA完全溶解，即得到高純度全基因組DNA，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0075]本發(fā)明提供的用于血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法不限于人類的抗凝血，還可以用于哺乳動(dòng)物的血液，如鼠、兔、豬、羊、狗和貓；禽類、兩棲類動(dòng)物等；需要的血液樣品量最低可以達(dá)到20μ 1，甚至血斑和血跡，均可提取得到高純度的全基因組DNA。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的用于血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法還可以用于冷凍儲(chǔ)存的血液，包括在_20°C冰箱、-80°C冰箱或液氮儲(chǔ)存的血液樣本。
[0076]通過(guò)本發(fā)明所述的試劑盒及其方法得到的高純度gDNA，其特征在于通過(guò)如下質(zhì)量控制:
[0077]提取的全基因組DNA提取效果用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，染料為溴化乙錠(EthidiumBromide, EB)替代物,在制膠的時(shí)候加入凝膠中。分別取3μ1 gDNA提取樣品，加入2 μ I上樣緩中液混合點(diǎn)樣，并點(diǎn)樣5 μ I DNA分子標(biāo)準(zhǔn)品(marker)，電泳條件為120V電壓，電泳20min，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)(藍(lán)盾-621)觀察拍照，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為單一條帶，無(wú)拖尾和雜帶，表明提取的gDNA無(wú)其他DNA污染。。
[0078]取2 μ I gDNA提取樣品，以無(wú)菌去離子水為空白，用超微量分光光度計(jì)(Spectrophotometer:NanoDrop2000)測(cè)定波長(zhǎng)為 230nm、260nm 和 280nm 的吸光度值，即A230、A260 和 A280。
[0079]利用純dsDNA的A260/A280和A260/A230比值，評(píng)估提取DNA的純度。本發(fā)明的試劑盒及其方法提取得到的gDNA經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A280比值均大于1.8，表明無(wú)蛋白和酚類物質(zhì)污染；A260/A230的比值均大于2.0，表明無(wú)碳水化合物(糖類)、鹽類或有機(jī)溶劑污染；
[0080]按照dsDNA的換算公式:DNA含量(μ g/mL全血)=A260 X 50 μ g/ml X 10 (稀釋倍數(shù))Χ50(50μ I DNA溶液)/1000(用于DNA提取的全血量為1000 μ I)，計(jì)算提取的DNA含量，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)Iml血量提取的gDNA效率可達(dá)到20 μ g/ml以上；滿足所有基因研究和檢測(cè)的樣品要求。
[0081]質(zhì)檢合格的DNA將濃度調(diào)整到50ng/ml，_20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0082]本發(fā)明提供的血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法用于科研或臨床診斷，提取得到的高純度和數(shù)量gDNA可完全解鏈和高效地進(jìn)行PCR擴(kuò)增，滿足基因表達(dá)、基因測(cè)序、外顯子組測(cè)序、基因突變和單核苷酸多態(tài)性等分析。[0083]以下，結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更具體的描述，但本發(fā)明不限于此。
[0084]實(shí)施例一血液中全基因組DNA提取試劑盒
[0085]試劑盒各組份如下:
[0086]I)紅細(xì)胞裂解液:去離子超純水(ddH20)，電阻率大于18MQ*cm)，經(jīng)121 °C，100千帕壓強(qiáng)下滅菌20分鐘處理；滅菌后每400ml分裝到500ml無(wú)菌塑料瓶中；
[0087]2)白細(xì)胞洗滌液:50ml Triton-XlOO加入400ml滅菌的去離子超純水中，68°C助溶，定容至500ml，制備成10% Triton-XlOO的母液；然后將IOml 10% Triton-XlOO母液加入990ml滅菌的去離子超純水中配制成0.1% Triton-XlOO的白細(xì)胞洗滌液；每300ml分裝到300ml無(wú)菌塑料瓶中；
[0088]3)消化液:60.55g Tris 堿溶于 400ml ddH20 中，用 HCl 調(diào) pH 值 8.0 (濃 HCl 約加2.0ml)，用ddH20定容至500ml,經(jīng)121 °C, 100千帕壓強(qiáng)下滅菌20分鐘配制成lmol/LTris-HCl(pH 值8.0)；
[0089]93.05g EDTA-Na 鹽磁力攪拌溶于 400ml ddH20 中，用 NaOH 調(diào) pH 值 8.0 (NaOH 顆粒約加入IOg)，用ddH20定容至500ml，經(jīng)121 °C，100千帕壓強(qiáng)下滅菌20分鐘配制成0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)；
[0090]5.844g NaCl 溶于 400ml ddH20 中，定容至 500ml，經(jīng) 121 °C，100 千帕壓強(qiáng)下滅菌 20分鐘配制成0.2mol/LNaCl ；
[0091]20.0g SDS溶于160ml滅菌的ddH20中，68°C助溶,用滅菌的ddH20定容至200ml,配制成10% SDS ；
[0092]分別取lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0) 5ml,0.5mol/L EDTA(pH 值 8.0) 10ml,0.2mol/LNaC125mlU0% SDS25ml，用滅菌的 ddH20 定容至 500ml，配制成含 lmol/L Tris-HCl (pH 值8.0)，0.511101/1^01六(？!1值8.0)，0.211101/1恥(:1，10%十二烷基硫酸(SDS)的消化液，每40ml分裝到50ml無(wú)菌塑料瓶中；
[0093]4)蛋白酶K:IOOmg蛋白酶K干粉,加入5ml滅菌的ddH20,顛倒混勻，配制成20ng/ul蛋白酶K，每1ml分裝到Iml無(wú)菌塑料管中，存放于_20°C冰箱中備用；
[0094]5)純化液:158.96g無(wú)水LiCl磁力攪拌，溶于400ml滅菌的ddH20中，用滅菌的ddH20定容至500ml，配制成純化液含7.5mol/L LiCl，每40ml分裝到50ml無(wú)菌塑料瓶中；
[0095]6) gDNA鹽析液:分析純無(wú)水乙醇，每500ml分裝到500ml無(wú)菌塑料瓶中；
[0096]7) gDNA洗滌液:取400ml分析純無(wú)水乙醇至500ml無(wú)菌玻璃瓶中，加100mL滅菌的ddH20，顛倒混勻，配制成gDNA洗滌液；每40ml分裝到50ml無(wú)菌塑料瓶中；
[0097]8) gDNA 洗脫液:60.55g Tris 堿溶于 400ml ddH20 中，用 HCl 調(diào) pH 值 8.0 (濃 HCl約加2.0ml)，用ddH20定容至500ml，經(jīng)121C，100千帕壓強(qiáng)下滅菌20分鐘配制成lmol/LTris-HCl(pH值 8.0)；
[0098]93.05g EDTA-Na 鹽磁力攪拌溶于 400ml ddH20 中，用 NaOH 調(diào) pH 值 8.0 (NaOH 顆粒約加入IOg)，用ddH20定容至500ml，經(jīng)121 °C，100千帕壓強(qiáng)下滅菌20分鐘配制成0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)；
[0099]分別取lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0) 5ml 和 0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0) Iml 用滅菌的ddH20定容至500ml,配制成gDNA洗脫液,每IOml分裝到IOml無(wú)菌塑料管中。
[0100]由上述8種試劑做成的gDNA提取試劑盒可用于Iml血量的50次血液中全基因組DNA提取，并可組成100次、200次和500次等gDNA提取試劑盒，含使用說(shuō)明書一份，試劑盒保存在4 °C冰箱，有效期為I年。
[0101]實(shí)施例二使用本發(fā)明試劑盒提取凍存血液中全基因組DNA
[0102]采集8位臨床糖尿病視網(wǎng)膜病變患者和7位正常人5ml EDTA抗凝血(與合作單位科研合作項(xiàng)目，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，并與志愿者簽署知情同意書)。
[0103]I)血液紅細(xì)胞裂解:先將凍存血液從_80°C冰箱中取出放入37°C水浴鍋中水浴，至血液樣本融化。向每個(gè)15ml離心管中加入8ml的紅細(xì)胞裂解液，并加入1ml血液樣本，手動(dòng)振蕩混勻，4°C放置20min后2000rpm低速離心15min ;離心結(jié)束后，將上清液棄之；
[0104]2)白細(xì)胞洗滌:向含白細(xì)胞沉淀的15ml離心管中加入2ml的白細(xì)胞洗滌液，混勻后放入低速水平離心機(jī),2000rpm低速離心15min，將上清液小心棄之，可重復(fù)洗滌一次；
[0105]3)白細(xì)胞消化裂解:取0.2ml蛋白酶K加入到消化液中混勻，向每一份白細(xì)胞沉淀中加入700 μ I “消化液+蛋白酶K”的混合溶液，吹打混勻后，轉(zhuǎn)移至2.0ml離心管中，56°C水浴2-3h，沉淀消失后37°C水浴過(guò)夜；
[0106]4)細(xì)胞雜質(zhì)沉淀:向水浴過(guò)夜后的混合液中分別加入800μ I純化液，振蕩混勻，放入_20°C冰箱30min ;然后13000rpm高速離心10min，將離心后的上清液倒入新的2.0ml離心管中；
[0107]5) gDNA析出:上述離心后上清液快速充分震蕩混勻，并迅速倒入裝有13ml預(yù)冷無(wú)水乙醇的15ml離心管中；待gDNA逐漸析出，用移液器將肉眼可見的絮狀漂浮物小心地挑起，轉(zhuǎn)移至加有800 μ I gDNA洗滌液的1.5ml離心管中；
[0108]6) gDNA洗漆:收集完析出的gDNA后15000rpm高速離心10min,棄上清,可重復(fù)洗滌一次；洗滌完畢的gDNA敞口在超凈臺(tái)中開風(fēng)機(jī)放置，至gDNA洗滌液完全揮發(fā)；
[0109]7) gDNA洗脫:向揮發(fā)干的gDNA中加入100-200 μ I的gDNA洗脫液，震蕩混勻，在4°C冰箱中至gDNA完全溶解，即得到高純度全基因組DNA，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0110]提取的全基因組DNA提取效果用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，染料為溴化乙錠(EthidiumBromide, EB)替代物,在制膠的時(shí)候加入凝膠中。分別取3μ1 gDNA提取樣品，加入2 μ I上樣緩沖液混合點(diǎn)樣，并點(diǎn)樣5 μ I DNA分子標(biāo)準(zhǔn)品(marker)，電泳條件為120V電壓，電泳20min，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)(藍(lán)盾-621)觀察拍照，圖1顯示瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的全基因組DNA均為單一條帶，無(wú)拖尾和雜帶，表明提取的gDNA無(wú)其他DNA污染。
[0111]實(shí)施例三使用本發(fā)明試劑盒提取血跡中全基因組DNA
[0112]取8位臨床患者Iml抗凝血分別加入到破舊衣服中，室溫放置2-3天。將沾有血跡的布?jí)K剪下，分別放入加有30ml紅細(xì)胞裂解液的50ml離心管中，漩渦振蕩5min，4°C放置20min后用鑷子取出布?jí)K,盡量讓液體滴干,然后2000rpm低速離心15min ;離心后棄上
清液；
[0113]向含白細(xì)胞沉淀的50ml離心管中加入30ml的白細(xì)胞洗滌液，混勻后低速離心機(jī)，1000rpm低速離心10min,將上清液小心棄之,重復(fù)洗漆2次；其余步驟按照實(shí)施例二中步驟3-7完成，提取的全基因組DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，圖2顯示瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的全基因組DNA均為單一條帶，無(wú)拖尾和雜帶，表明提取的gDNA無(wú)其他DNA污染。[0114]實(shí)施例四提取的gDNA純度檢測(cè)和定量
[0115]取實(shí)施例二和三中提取的gDNA2y I樣品，以無(wú)菌去離子水為空白，用超微量分光光度計(jì)(Spectrophotometer:NanoDrop2000)測(cè)定波長(zhǎng)為 230nm、260nm 和 280nm 的吸光度值，即A230、A260和A280，按照NanoDrop2000儀器使用說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。利用純dsDNA的A260/A280和A260/A230比值，評(píng)估提取DNA的純度，以及按照dsDNA的換算公式:DNA含量(μ g/mL 全血)=A260 X 50 μ g/ml X 10 (稀釋倍數(shù))X 50 (50 μ I DNA 溶液)/1000 (用于DNA提取的全血量為ΙΟΟΟμ 1)，計(jì)算提取的DNA含量，本發(fā)明的試劑盒及其方法提取得到的gDNA純度和含量測(cè)定見表一。
[0116]表一:
[0117]
【權(quán)利要求】
1.一種用于從血液中提取高純度全基因組DNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括紅細(xì)胞裂解液、白細(xì)胞洗滌液、消化液、蛋白酶K、純化液、gDNA鹽析液、gDNA洗滌液及gDNA洗脫液；采用所述試劑盒提取血液中全基因組DNA時(shí)，不用事先對(duì)血液中進(jìn)行血漿和血清分離，只需取新鮮或冰凍的抗凝全血。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，各組成分別為: 1)紅細(xì)胞裂解液:滅菌的去離子超純水，400ml/瓶； 2)白細(xì)胞洗滌液:體積比為0.1 %的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-XlOO)，300ml/瓶； 3)消化液:含lmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.2mol/L NaCl，質(zhì)量體積比為10g/ml的十二烷基硫酸(SDS)，40ml/支； 4)蛋白酶K:為20mg/ml的蛋白酶K, Iml/支； 5)純化液:為5-7.5mol/L的氯化鋰(LiCl)，40ml/瓶；
6)gDNA鹽析液:無(wú)水乙醇，500ml/瓶； 7)gDNA洗滌液:體積比為80%的乙醇，40ml/瓶；
8)gDNA 洗脫液:含 lmol/L Tris-HCl, 0.5mol/L EDTA，10ml/支。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述gDNA提取試劑盒組份可用于Iml血量的50次血液中全基因組DNA提取，并可組成100次、200次和500次gDNA提取試劑盒，含使用說(shuō)明書一份，試劑盒保存在4°C冰箱。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述純化液優(yōu)選地為7.5mol/L的氯化鋰(LiCl)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，將提取得到的所述gDNA采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，該瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為單一條帶，無(wú)拖尾和雜帶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，將提取得到的所述gDNA采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為A260/A280比值大于1.8，無(wú)蛋白和酚類物質(zhì)污染；A260/A230的比值大于2.0，無(wú)碳水化合物、鹽類或有機(jī)溶劑污染。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，將提取得到的所述gDNA采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)Iml血量提取的gDNA效率達(dá)到20μ g/ml以上；滿足所有基因研究和檢測(cè)的樣品要求。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述滅菌的去離子超純水的電阻率大于18ΜΩ*αιι;所述Tris-HCl、EDTA的pH值均為8.0。
9.一種采用權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的試劑盒從血液中提取高純度全基因組DNA的方法，其特征在于，其包括以下步驟: 1)血液紅細(xì)胞裂解:先向每個(gè)15ml離心管中加入等于血液樣本8倍體積的紅細(xì)胞裂解液，將血液樣本加入該離心管中，手動(dòng)振蕩混勻，4°C放置20~30min后2000rpm低速離心15min ;離心結(jié)束后，將上清液棄之； 2)白細(xì)胞洗滌:向含白細(xì)胞沉淀的15ml離心管中加入2~3ml的白細(xì)胞洗滌液，混勻后放入低速水平離心機(jī),2000rpm低速離心15min，將上清液小心棄之，重復(fù)洗滌一次； 3)白細(xì)胞消化裂解:取0.2ml蛋白酶K加入到消化液中混勻，向每一份白細(xì)胞沉淀中加入700 μ I消化液與蛋白酶K的混合溶液，吹打混勻后，轉(zhuǎn)移至2.0ml離心管中，56°C水浴2_3h，沉淀消失后37°C水浴過(guò)夜；4)細(xì)胞雜質(zhì)沉淀:向水浴過(guò)夜后的混合液中分別加入800μ I純化液，振蕩混勻，放入-20°C冰箱30min-lh ;然后13000rpm高速離心10min,將離心后的上清液倒入新的2.0ml離心管中； 5)gDNA析出:將上述離心后的上清液快速充分震蕩混勻，并迅速倒入裝有13ml預(yù)冷無(wú)水乙醇的15ml離心管中；待gDNA逐漸析出，用移液器將肉眼可見的絮狀漂浮物挑起，轉(zhuǎn)移至加有800 μ I gDNA洗滌液的1.5ml離心管中； 6)gDNA洗滌:收集完析出的gDNA后15000rpm高速離心10min，棄上清，可重復(fù)洗滌一次；洗滌完畢的gDNA敞口在超凈臺(tái)中開風(fēng)機(jī)放置，至gDNA洗滌液完全揮發(fā)； 7)gDNA洗脫:向揮發(fā)干的gDNA中加入100-200 μ I的gDNA洗脫液，震蕩混勻，在4°C冰箱中至gDNA完全溶解，即得到高純度全基因組DNA，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述試劑盒在基因表達(dá)、基因測(cè)序、全基因組測(cè)序、外顯子組測(cè)序、基因突變或單核苷 酸多態(tài)性分析上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104017800SQ201410276330
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】曾沃坦, 黃啟明, 梁辰, 陳建勛, 鄭英海 申請(qǐng)人:益百尚(北京)生物技術(shù)有限責(zé)任公司