一種鑒別半夏品種資源的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒別半夏品種資源的方法，包括基因組DNA提取、PCR擴增18SrDNA序列和序列測定與分析的步驟，其中半夏基因組DNA的提取采用將一定量待測半夏樣品的新鮮葉片組織放入離心管中，再加入溫水預(yù)熱后的適當(dāng)體積配比的SDS與CTAB混合抽提液，混搖5min，用移液槍的槍頭伸入上述離心管底部，緩慢順時針旋轉(zhuǎn)挑取絲狀粘稠物質(zhì)，獲得基因組DNA，然后采用植物18SPCR引物18SF和18SR進行18SrDNA序列PCR擴增，隨后測序，在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中比對分析，從而判斷其進化關(guān)系與種屬來源。本發(fā)明的方法快速有效、簡單便捷、可操作性強，能夠準確鑒定半夏種屬來源，確定道地半夏藥材資源，為保護半夏種質(zhì)多樣性奠定理論基礎(chǔ)，具有較大的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種鑒別半夏品種資源的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及中藥材半夏通過分子生物學(xué)鑒定確定其品種資源的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]半夏屬天南星科草本植物，其塊莖入藥，是我國大宗傳統(tǒng)中藥材之一，用藥歷史悠久。據(jù)報道，半夏具有降逆去燥、止咳化痰、抗腫瘤、抗早孕等多種藥理作用。近年來，市場對半夏需求的不斷加大，野生半夏資源的馴化和人工栽培應(yīng)運而生。由于半夏繁殖率低，人工種植的半夏主產(chǎn)區(qū)種子供不應(yīng)求，使得各地藥農(nóng)不得不到外地引種，種質(zhì)資源交流頻繁，造成道地藥材資源消失殆盡。
[0003]半夏的生產(chǎn)正如許多中藥材一樣，種莖的特性千差萬別，有的是不同物種(如掌葉半夏和水半夏)，它們屬于偽品，不符合現(xiàn)代藥材深加工對原材料的要求，對實施現(xiàn)代化中成藥生產(chǎn)極為不利。品種混雜，品質(zhì)不均是目前半夏產(chǎn)業(yè)面臨的主要問題。然而，迄今為止，還沒有成熟的鑒別半夏品種資源的技術(shù)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種半夏品種資源的鑒定方法，該方法快速有效、簡單便捷、可操作性強，能夠準確鑒定半夏種屬來源。
[0005]具體來說，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
一種鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
(1)半夏基因組DNA的提取:選取一定量的待測半夏樣品的新鮮葉片組織，放入離心管中；按每克葉片組織2000 μ L的比例加入溫水預(yù)熱后的適當(dāng)體積配比的SDS與CTAB混合抽提液，混搖5min ;用移液槍的槍頭伸入上述離心管底部，緩慢順時針旋轉(zhuǎn)挑取絲狀粘稠物質(zhì)，獲得基因組DNA，將其溶于水中；取溶解后溶液適量，進行1%_2%瓊脂糖電泳檢測；
(2)18SrDNA序列PCR擴增:將上述所得DNA溶液稀釋50-100倍；準備植物18SPCR引物18SF和18SR ;如下建立PCR擴增體系共50-100 μ L:水20-500 μ L,緩沖液1-5 μ L, 18SF引物1-5μ L，18SR引物1-5 μ L，上述稀釋后的DNA溶液作為模板1-5 μ L, dNTP 1_5μ L，MgC121-5 μ L，rTaq酶1-5 μ L ;將上述體系中的材料依次加入PCR管中，放入PCR儀中，設(shè)置PCR反應(yīng)條件，開始反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，得到所需的18SrDNA序列；
(3)序列測定與分析:將上述所得的序列進行測序，得到序列信息；在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載用于比對和進化樹分析的天南星科半夏屬植物的ISSrDNA序列，運用分子信息分析軟件對所得半夏樣品ISSrDNA序列和網(wǎng)上報道的序列進行比對分析，從而判斷其進化關(guān)系與種屬來源。
[0006]優(yōu)選地，步驟(1)的SDS與CTAB混合抽提液中SDS與CTAB的體積配比為1_10:1，更優(yōu)選為2:1或3:1或4:1。
[0007]優(yōu)選地，步驟(1)的“溫水預(yù)熱”是指在30-100°C的水溫下預(yù)熱Ι-lOOmin，更優(yōu)選為在60-70°C的水溫下預(yù)熱30-40min。
[0008]優(yōu)選地，步驟(2)的“引物18SF”的序列是指5' -CCTGGTTGATCCTGCCAG-3';“引物 18SR” 的序列是指 5' -TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3'。
[0009]優(yōu)選地，步驟(2)的PCR反應(yīng)條件是指每個循環(huán)條件如下:94°C:l_5min ；55°C:IO-1OOs ；72°C:l-10min ;共 10-100 個循環(huán)。
[0010]優(yōu)選地，步驟(3)的“天南星科半夏屬植物”是指以下植物:滴水珠(Pinellia.cordata)、石蜘蛛(P.1ntegrifolia)、掌葉半夏(P.pedatisecta)、盾葉半夏(P.peltata)、半夏(P.ternata)、大半夏(P.polyghylla)、鷂落坪半夏(P.yaoluopingensis)、三裂葉半夏(P.tripartita)。
[0011]有益效果:本發(fā)明的方法具有快速有效、簡單便捷、可操作性強等優(yōu)點，能夠準確鑒定半夏種屬來源，對指導(dǎo)藥農(nóng)種植《中國藥典》規(guī)定的半夏類藥材具有重要意義。此外，通過確定道地半夏藥材資源，為保護半夏種質(zhì)多樣性奠定理論基礎(chǔ)，具有較大的應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是實施例1中所鑒別的兩種湖北荊州半夏的型態(tài)特征。
[0013]圖2是實施例2中所鑒別的兩種南京半夏的型態(tài)特征。
【具體實施方式】
[0014]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種半夏品種資源的鑒定方法，從而準確鑒定半夏種屬來源，指導(dǎo)藥農(nóng)種植《中國藥典》規(guī)定的半夏類藥材。
[0015]在一個實施方案中，本發(fā)明提供的方法可以如下實施:
(O半夏基因組DNA的提取:選取0.5g待測半夏樣品的新鮮葉片組織，放入商用EP管(規(guī)格1.5mL或2mL)中；加入溫水預(yù)熱后的適當(dāng)體積配比的SDS與CTAB混合抽提液1000 μ L，混搖5min ;用移液槍的槍頭(規(guī)格200 μ L或1000 μ L)伸入上述EP管底部，緩慢順時針旋轉(zhuǎn)挑取絲狀粘稠物質(zhì)，即所得基因組DNA，將其溶于50 μ L純水中；取溶解后溶液3-5 UL,進行1%-2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0016](2) 18SrDNA序列PCR擴增:將上述所得DNA溶液稀釋50-100倍；準備植物18SPCR引物18SF和18SR ;建立PCR擴增體系共50-100 μ L，如下:純水20-500 μ L，商用緩沖液l_5yL，18SF引物l_5yL，18SR引物1-5 μ L，上述稀釋后的DNA溶液作為模板1-5 μ L，商用dNTP 1-5 μ L,商用MgC12 1-5 μ L,商用rTaq酶1_5 μ L ;將上述體系中的材料依次加入商用PCR管(規(guī)格0.2mL或0.5mL)中，放入PCR儀中，設(shè)置PCR反應(yīng)條件，開始反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，得到所需的18S rDNA序列。
[0017](3)序列測定與分析:將上述所得的序列送至測序公司測序，得到序列信息；在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載用于比對和進化樹分析的天南星科半夏屬植物的18SrDNA序列，運用MEGA等分子信息分析軟件對所得半夏樣品18S rDNA序列和網(wǎng)上報道的序列進行比對分析，從而判斷其進化關(guān)系與種屬來源。
[0018]所述步驟(1)的“SDS與CTAB混合抽提液”是指SDS與CTAB的體積配比為1_10:
I;優(yōu)選2:1或3:1或4:1。所述步驟(1)的“溫水”是指30-100°C的水溫，優(yōu)選60-70°C。所述步驟(1)的“預(yù)熱”時間為Ι-lOOmin,優(yōu)選30_40min。[0019]所述步驟(2)的“引物18SF”的序列是指5' -CCTGGTTGATCCTGCCAG-3';所述步驟(2)的“引物 18SR” 的序列是指 5' -TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3'。
[0020]所述步驟(2)的“設(shè)置PCR反應(yīng)條件”是指每個循環(huán)條件如下:94°C:l-5min ；55°C:IO-1OOs ；72°C:l-10min ;共 10-100 個循環(huán)。
[0021]所述步驟(3)的“天南星科半夏屬植物”是指以下植物:滴水珠(Pinellia.cordata)、石蜘蛛(P.1ntegrifolia)、掌葉半夏(P.pedatisecta)、盾葉半夏(P.peltata)、半夏(P.ternata)、大半夏(P.polyghylla)、鷂落坪半夏(P.yaoluopingensis)、三裂葉半夏(P.tripartita)。
[0022]本發(fā)明的方法具有快速有效、簡單便捷、可操作性強等優(yōu)點，能夠準確鑒定半夏種屬來源，對指導(dǎo)藥農(nóng)種植《中國藥典》規(guī)定的半夏類藥材具有重要意義。此外，通過確定道地半夏藥材資源，為保護半夏種質(zhì)多樣性奠定理論基礎(chǔ)，具有較大的應(yīng)用價值。
[0023]下面將結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的描述。
[0024]實施例1:
選取兩種湖北荊州地區(qū)的半夏HBB-01和HBD-02，如圖1。分別取0.5g兩種待測半夏樣品的新鮮葉片組織，放入商用EP管(規(guī)格1.5mL)中；加入65°C溫水預(yù)熱后的體積配比為
2:1的SDS與CTAB混合抽提液1000 μ L，混搖5min ;用移液槍的槍頭(規(guī)格200 μ L)伸入上述EP管底部，緩慢順時針旋轉(zhuǎn)挑取絲狀粘稠物質(zhì)，即所得基因組DNA，將其溶于50 μ L純水中；取溶解后溶液3 μ L，進行1%瓊脂糖電泳檢測。建立PCR擴增體系共50 μ L，如下:純水35 μ L，商用緩沖液5 μ L，18SF引物I μ L，18SR引物I μ L，上述所得DNA溶液稀釋100倍作為模板2 μ L,商用dNTP 4 μ L,商用MgC12 1.5 μ L,商用rTaq酶0.5μ L。將上述體系中的材料依次加入商用PCR管(規(guī)格0.2mL)中，放入PCR儀中，設(shè)置PCR反應(yīng)條件，每個循環(huán)條件如下:94°C:4min ；55°C:30s ；72°C:2min ;共35個循環(huán)，進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，得到所需的ISSrDNA序列片段。將上述所得的序列送至測序公司測序，得到序列信息；在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載用于比對和進化樹分析的天南星科半夏屬植物的18SrDNA序列,運用MEGA等分子信息分析軟件對所得半夏樣品ISSrDNA序列和網(wǎng)上報道的序列進行比對分析，得出如下結(jié)論:HBB_01為半夏(Pinellia ternata),為《中國藥典》中規(guī)定的半夏類藥材品種；HBD-02為三裂葉半夏(P.tripartita)，為藥用半夏的混淆品。
[0025]實施例2:
選取兩種江蘇南京地區(qū)的半夏NJ-01和NJ-02，如圖2。分別取0.5g兩種待測半夏樣品的新鮮葉片組織，放入商用EP管(規(guī)格1.5mL)中；加入65°C溫水預(yù)熱后的體積配比為
3:1的SDS與CTAB混合抽提液1000 μ L，混搖5min ;用移液槍的槍頭(規(guī)格200 μ L)伸入上述EP管底部，緩慢順時針旋轉(zhuǎn)挑取絲狀粘稠物質(zhì)，即所得基因組DNA，將其溶于50 μ L純水中；取溶解后溶液3 μ L，進行1%瓊脂糖電泳檢測。建立PCR擴增體系共100 μ L，如下:純水60 μ L，商用緩沖液10 μ L，18SF引物5 μ L，18SR引物5 μ L，上述所得DNA溶液稀釋100倍作為模板5 μ L,商用dNTP 10 μ L,商用MgC12 3 μ L,商用rTaq酶2μ L。將上述體系中的材料依次加入商用PCR管(規(guī)格0.2mL)中，放入PCR儀中，設(shè)置PCR反應(yīng)條件，每個循環(huán)條件如下:94°C:4min ；55°C:30s ；72°C:2min ;共35個循環(huán)，進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，得到所需的ISSrDNA序列片段。將上述所得的序列送至測序公司測序，得到序列信息；在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載用于比對和進化樹分析的天南星科半夏屬植物的18SrDNA序列，運用MEGA等分子信息分析軟件對所得半夏樣品ISSrDNA序列和網(wǎng)上報道的序列進行比對分析，得出如下結(jié)論:NJ-01為半夏(Pinellia ternata),為《中國藥典》中規(guī)定的半夏類藥材品種；NJ_02為掌葉半夏(P.pedatisecta)，為藥用半夏的偽品。
[0026]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
[0027]上面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的實施方式作了詳細的說明，但是本發(fā)明不限于上述實施方式，在所屬【技術(shù)領(lǐng)域】普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下做出各種變化。
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)半夏基因組DNA的提取:選取一定量的待測半夏樣品的新鮮葉片組織，放入離心管中；按每克葉片組織2000 μ L的比例加入溫水預(yù)熱后的適當(dāng)體積配比的SDS與CTAB混合抽提液，混搖5min ;用移液槍的槍頭伸入上述離心管底部，緩慢順時針旋轉(zhuǎn)挑取絲狀粘稠物質(zhì)，獲得基因組DNA，將其溶于水中；取溶解后溶液適量，進行1%_2%瓊脂糖電泳檢測； (2)18SrDNA序列PCR擴增:將上述所得DNA溶液稀釋50-100倍；準備植物18SPCR引物18SF和18SR ;如下建立PCR擴增體系共50-100 μ L:水20-500 μ L,緩沖液1-5 μ L, 18SF引物l-5yL，18SR引物1-5 μ L，上述稀釋后的DNA溶液作為模板1-5μ L,dNTP 1-5μ L,MgC121-5 μ L，rTaq酶1-5 μ L ;將上述體系中的材料依次加入PCR管中，放入PCR儀中，設(shè)置PCR反應(yīng)條件，開始反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，得到所需的18SrDNA序列； (3)序列測定與分析:將上述所得的序列進行測序，得到序列信息；在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載用于比對和進化樹分析的天南星科半夏屬植物的ISSrDNA序列，運用分子信息分析軟件對所得半夏樣品ISSrDNA序列和網(wǎng)上報道的序列進行比對分析，從而判斷其進化關(guān)系與種屬來源。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(1)的SDS與CTAB混合抽提液中SDS與CTAB的體積配比為1_10:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(1)的SDS與CTAB混合抽提液中SDS與CTAB的體積配比為2:1或3:1或4:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(1)的“溫水預(yù)熱”是指在30-100°C的水溫下預(yù)熱l-100min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(1)的“溫水預(yù)熱”是指在60-70°C的水溫下預(yù)熱30-40min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(2)的“引物18SF”的序列是指5 ' -CCTGGTTGATCCTGCCAG-3 ';“引物18SR”的序列是指5' -TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3'。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(2)的PCR反應(yīng)條件是指每個循環(huán)條件如下:94°C:l-5min ；55°C:10-100s ；72°C =1-1Omin ;共10-100個循環(huán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別半夏品種資源的方法，其特征在于，步驟(3)的“天南星科半夏屬植物”是指以下植物:滴水珠(Pinellia.cordata)、石蜘蛛(P.1ntegrifolia)、掌葉半夏(P.pedatisecta)、盾葉半夏(P.peltata)、半夏(P.ternata)、大半夏(P.polyghylla)、鷂落坪半夏(P.yaoluopingensis)、三裂葉半夏(P.tripartita)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104017892SQ201410280668
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】張文濤, 陳集雙, 喻靜, 蔣海俠, 宋蓮, 張本厚 申請人:南京工業(yè)大學(xué)大豐海洋產(chǎn)業(yè)研究院