一種用于制備肝細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)遞小干擾rna的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于制備肝細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)遞小干擾RNA的方法。本發(fā)明公開了一種用于制備肝細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)遞小干擾RNA的方法，反應(yīng)底物包括乳糖酸或半乳糖衍生物、末端氨基修飾RNAi多核苷酸和EDC，其中，乳糖酸或半乳糖衍生物作為耦合反應(yīng)的羧基供體和靶向耦合物的半乳糖基供體，末端氨基標(biāo)記RNAi多核苷酸作為耦合反應(yīng)的伯氨基供體，EDC作為零長度交聯(lián)劑。本發(fā)明所公開的方法操作簡便、產(chǎn)率高、活性好，實(shí)現(xiàn)了小干擾RNA與肝細(xì)胞特異性配基―半乳糖基的共價(jià)耦合，耦合物被肝細(xì)胞特異性攝取后，表現(xiàn)出針對目標(biāo)基因的沉默活性。
【專利說明】-種用于制備肝細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)遞小干擾RNA的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于制備肝細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)遞小干擾RNA的 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] RNA干擾（RNAi)為由一類小干擾RNA分子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，廣泛應(yīng)用 于基因功能鑒定和基因治療研究領(lǐng)域。小干擾RNA分子通常是由19?23對堿基構(gòu)成的雙 鏈結(jié)構(gòu)，分子量13?15kd，攜帶38?40個(gè)凈負(fù)電荷，因此小干擾RNA裸分子自身無法穿越 負(fù)電荷細(xì)胞膜，常需要陽性脂質(zhì)體包裹攜帶轉(zhuǎn)染細(xì)胞。此外，小干擾RNA系統(tǒng)使用時(shí)，其生 物分布十分廣泛，在肝、腎、心、脾、腸等多臟器廣泛分布，造成靶組織內(nèi)RNAi活性不足，補(bǔ) 償性加量后易出現(xiàn)靶外基因沉默、免疫刺激和miRNA競爭抑制等副作用。因此，小干擾RNA 藥物轉(zhuǎn)化的主要障礙在于缺乏理想的高效細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)遞手段。
[0003] 肝臟作為人體的重要代謝器官，易受病毒感染、代謝性疾病、腫瘤等的侵害。提高 小干擾RNA裸分子靶向進(jìn)入肝細(xì)胞是加快RNAi治療肝疾時(shí)藥物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。目前，協(xié)助小 干擾RNA肝細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)遞媒介物大體可分為病毒載體和非病毒載體兩類。前者轉(zhuǎn)染效率 高，其靶向性的實(shí)現(xiàn)可通過肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子獲得，但免疫排斥反應(yīng)和基因重組風(fēng)險(xiǎn)限 制其臨床轉(zhuǎn)化。非載體類靶向轉(zhuǎn)遞可以借助陽離子復(fù)合物（脂質(zhì)體或多聚體）或化學(xué)修飾 等手段，將有肝細(xì)胞特異識別能力的配基以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的方式與小干擾RNA結(jié)合得 以實(shí)現(xiàn)。其中，非共價(jià)鍵結(jié)合是小干擾RNA肝細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)遞研究的常見技術(shù)。
[0004] 非共價(jià)鍵結(jié)合小干擾RNA靶向復(fù)合物優(yōu)勢在于方法靈活多樣，不改變小干擾RNA 分子結(jié)構(gòu)，體外研究結(jié)果較為理想。如Oishi (2007年）將半乳糖化聚乙二醇和多聚賴氨酸 形成非共價(jià)鍵復(fù)合體，依靠靜電攜帶小干擾RNA(顆粒直徑llOnm)。體外示蹤表明復(fù)合物順 利地轉(zhuǎn)入了 Huh7細(xì)胞。再如，Kim(2007年）將脂質(zhì)體、膽固醇、載脂蛋白apoA- I靜電結(jié) 合小干擾RNA，形成小干擾RNA非共價(jià)鍵復(fù)合物，體外轉(zhuǎn)遞肝細(xì)胞，其攝取量是無 apoA- I的 3倍。Sato (2007年）利用半乳糖化膽固醇衍生物（C4-chol)與中性脂質(zhì)體DOPE及小干擾 RNA非共價(jià)鍵結(jié)合成75. 3 ± 5. 8nm的復(fù)合物顆粒，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明約80 %的小干擾RNA復(fù)合 物分布于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
[0005] 非共價(jià)靶向小干擾RNA復(fù)合物不足在于非共價(jià)鍵導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易降解；直徑 過大（> 50nm)，難以通過毛細(xì)血管壁，容易被肝Kupffer細(xì)胞清除；激活補(bǔ)體系統(tǒng)，易被網(wǎng) 狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除；藥代指標(biāo)不理想，藥物轉(zhuǎn)化空間不大。
[0006] 配基與小干擾RNA依靠共價(jià)鍵結(jié)合后肝細(xì)胞轉(zhuǎn)遞的優(yōu)勢明顯，形成的耦合物分子 均質(zhì)，可控性好，容易純化。配基化小干擾RNA單分子直徑小，容易通過肝血竇毛細(xì)血管壁， 藥代學(xué)指標(biāo)清晰。如，利用膽固醇主要在肝臟代謝的特點(diǎn)，Lorenz和Soutschek(2004年） 將膽固醇與小干擾RNA正義鏈5'端共價(jià)稱合后發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性明顯提高（半衰期95min，血楽 清除率0. 5mL/min)。雖然其在心、肺、脂肪等多組織器官均有分布，但以肝臟和空腸攝取最 多。再如，Rozema (2007年）以半乳糖胺為配基，將丁基-氨基-乙烯醚聚合物通過側(cè)鏈羧 基二甲基酐鍵與聚乙二醇和N-乙酰半乳糖胺共價(jià)連接后，與小干擾RNA5'端二硫鍵共價(jià)結(jié) 合，形成大小為lOmii的單分子化合物。體外轉(zhuǎn)染證實(shí)其具有與陽性脂質(zhì)體siQUEST相同的 肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，可降低目標(biāo)基因表達(dá)80%。體內(nèi)主要分布在肝細(xì)胞，只少量被肝竇非實(shí)質(zhì) 細(xì)胞和腎、脾攝取。
[0007] 配基與小干擾RNA共價(jià)鍵結(jié)合相關(guān)技術(shù)較少見諸報(bào)道，主要障礙在于耦聯(lián)反應(yīng)條 件要求較高，需要設(shè)計(jì)更為簡便、巧妙的中間橋聯(lián)分子。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種用于制備肝細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)遞小干擾RNA的方法，該方法可 以實(shí)現(xiàn)小干擾RNA與肝細(xì)胞特異性半乳糖配基的共價(jià)連接，利用該方法合成的半乳糖化小 干擾RNA耦合物具有不依賴于脂質(zhì)體的靶向轉(zhuǎn)遞肝細(xì)胞特性。
[0009] 為此，本發(fā)明公開了一種用于制備肝細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)遞小干擾RNA的方法，反應(yīng)底物 包括乳糖酸或半乳糖衍生物、末端氨基修飾RNAi多核苷酸和1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙 基]碳化二亞胺（EDC)，其中，乳糖酸或半乳糖衍生物作為耦合反應(yīng)的羧基供體和靶向耦合 物的半乳糖基供體，末端氨基標(biāo)記RNAi多核苷酸作為耦合反應(yīng)的伯氨基供體，EDC作為零 長度交聯(lián)劑。
[0010] 所述方法包括下列步驟：〇. 05M?0. 1M2-嗎啉乙磺酸鈉（MES)緩沖液pH4. 5中進(jìn) 行，乳糖酸與末端氨基標(biāo)記RNAi多核苷酸摩爾比例為1 :1?2000 :1，EDC與乳糖酸摩爾比 例為1 :1?100 :1。
[0011] 在一實(shí)施例中，所述方法為25mM乳糖酸、12. 5 μ Μ末端氨基標(biāo)記RNAi多核苷酸與 0. 1M EDC三者混合于0. 1M MES pH4. 5緩沖液中，短暫振蕩后離心，于25°C反應(yīng)2h或4°C過 夜，使羧基與伯氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，形成半乳糖化RNAi多核苷酸共價(jià)耦合物。
[0012] 本發(fā)明所公開的方法實(shí)現(xiàn)了小干擾RNA與肝細(xì)胞特異性配基一一半乳糖基的共價(jià) 耦合，在肝細(xì)胞膜表面去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)下，在體外細(xì)胞水平表現(xiàn)出不依賴于陽性 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的特異性肝細(xì)胞攝取。轉(zhuǎn)遞后，半乳糖化小干擾RNA耦合物能夠表現(xiàn)出針 對目標(biāo)基因的沉默活性?；谕瑯蛹夹g(shù)，本發(fā)明所建立的肝細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)遞小干擾RNA技術(shù) 還可用于其它核酸分子的肝細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)遞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖 lM:5bp DNA Marker ;1、裸 NH2-siRNA，4yg/100yL;2、半乳糖化小干擾 RNA， 1. 5 μ g/100 μ L
[0014] 圖2Huh7肝細(xì)胞攝取半乳糖化小干擾RNA共價(jià)耦合物
[0015] 半乳糖化小干擾 RNA濃度分別為 1 :0μΜ;2 :1μΜ;3 :2μΜ;4:4μΜ;5 :0. 2μΜ 的 裸 siRNA 和 X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent ;Α :Huh7 細(xì)胞，Β :MDA 細(xì)胞。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 術(shù)語"RNA干擾（RNAi)多核苷酸"是能誘導(dǎo)RNA干擾的分子，其通過與哺乳動(dòng)物細(xì) 胞的RNA干擾通路組成部分相互作用以序列特異方式降解或抑制轉(zhuǎn)基因的信使RNA(mRNA) 轉(zhuǎn)錄本翻譯。兩種主要RNAi多核苷酸是小（或短）干擾RNA (siRNA)和微RNA (miRNA)。RNAi 多核苷酸可選自下組：siRNA、微RNA、雙鏈RNA (dsRNA)、短發(fā)夾RNA (shRNA)和編碼能誘導(dǎo) RNA干擾的表達(dá)盒。siRNA包括的雙鏈結(jié)構(gòu)通常含15-50個(gè)堿基對，優(yōu)選21-25個(gè)堿基對，并 具有與細(xì)胞內(nèi)所表達(dá)靶基因或RNA中編碼序列相同（完美互補(bǔ)的）或幾乎相同（部分互補(bǔ) 的）的核苷酸序列。siRNA還具有3'雙核苷酸突出。siRNA可由形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩個(gè)退火 多核苷酸或單核苷酸組成。本發(fā)明的siRNA分子包含有義區(qū)域和反義區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方 式中，偶聯(lián)物的siRNA從兩種寡核苷酸片段中組裝，其中一種片段包含所述siRNA分子反義 鏈的核苷酸序列，且第二片段包含所述siRNA分子有義鏈的核苷酸序列。在另一實(shí)施方式 中，有義鏈通過接頭分子如多核苷酸接頭或非核苷酸接頭連接反義鏈。微RNA(miRNA)是約 22個(gè)核苷酸長度的非編碼小RNA基因產(chǎn)物，指導(dǎo)其mRNA靶標(biāo)的破壞或翻譯抑制。若miRNA 和靶mRNA之間是部分互補(bǔ)，則所述靶mRNA的翻譯被抑制。若廣泛互補(bǔ)，則所述靶mRNA被切 害I]。對于miRNA，所述復(fù)合物結(jié)合通常位于mRNA3 ! UTR的靶位點(diǎn)，其通常僅與所述miRNA 部分同源。"種子區(qū)域"為miRNA5'末端的一段約七（7)個(gè)連續(xù)核苷酸，與其靶標(biāo)形成完美 堿基配對-在miRNA特異性中起關(guān)鍵作用。RISC/miRNA復(fù)合物與mRNA的結(jié)合可導(dǎo)致蛋白 翻譯抑制或mRNA的切割和降解。近期數(shù)據(jù)表明若沿著全長miRNA和其靶標(biāo)有完美同源性 而不是僅在種子區(qū)域顯示完美堿基配對，則mRNA切割優(yōu)選發(fā)生（Pillai等，2007)。
[0017] RNAi多核苷酸表達(dá)盒可在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生小發(fā)夾RNA，其能作為siRNA、分離的有 義和反義鏈線性siRNA或miRNA行使功能。RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄的DNA含有選自下表的啟 動(dòng)子：U6啟動(dòng)子、H1啟動(dòng)子和tRNA啟動(dòng)子。RNA聚合酶II啟動(dòng)子包括U1、U2、U4和U5啟 動(dòng)子、snRNA啟動(dòng)子、微RNA啟動(dòng)子和mRNA啟動(dòng)子。
[0018] 已知miRNA序列的列表可在研究組織維護(hù)的數(shù)據(jù)庫中找到，如維爾康姆基金會 桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute)、賓州生物信息中心（Penn Center forBioinformatics)、斯隆凱特林癌癥紀(jì)念紀(jì)念中心（Memorial Sloan Kettering CancerCenter)和歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室等。已知的有效siRNA序列和關(guān)聯(lián)結(jié)合位點(diǎn)也在相 關(guān)文獻(xiàn)中充分記述。RNAi分子容易用本領(lǐng)域已知的技術(shù)設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。此外，計(jì)算工具可 用于增加發(fā)現(xiàn)有效和特異性序列基序的可能性（Pei等2006, Reynolds等2004, Khvorova 等 2003, Schwarz 等 2003, Ul-Tei 等 2004, Heale 等 2005, Chalk 等 2004, Amarzguioui 等 2004)。
[0019] 本發(fā)明的RNAi多核苷酸可被化學(xué)修飾。該化學(xué)修飾的非限制性示例包括：硫代 磷酸酯核苷酸間連接、2' -0-甲基核糖核苷酸、2' -脫氧-2' -氟核糖核苷酸、2' -脫氧核糖核 苷酸、"通用堿基"核苷酸、5-C-甲基核苷酸、和倒置脫氧脫堿基殘基摻入。用于各種多核苷 酸結(jié)構(gòu)時(shí)，這些化學(xué)修飾顯示在細(xì)胞中保持多核苷酸活性，同時(shí)增加這些化合物的血清穩(wěn) 定性。化學(xué)修飾的siRNA還可使人中干擾素活性激活的可能性最小化。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的化學(xué)修飾RNAi多核苷酸包括具有兩條鏈的雙鏈體， 其一或二者可化學(xué)修飾，其中各鏈為約19?約29核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的 RNAi多核苷酸包括一種或多種修飾的核苷酸，同時(shí)保持在細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)RNAi或在體外系統(tǒng) 中重建的能力。RNAi多核苷酸可經(jīng)修飾，其中化學(xué)修飾包括一個(gè)或多個(gè)（例如約1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10或更多）核苷酸。本發(fā)明的RNAi多核苷酸可包括修飾的核苷酸，其占 RNAi多 核苷酸中所存在核苷酸總數(shù)的某一百分比。同樣，本發(fā)明的RNAi多核苷酸通?？稍诩s5? 約 100% (如 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或100 %的核苷酸位置）的核苷酸位置上包括修飾的核 苷酸。給定RNAi多核苷酸中存在的修飾核苷酸的實(shí)際百分比取決于所述RNAi多核苷酸中 存在的核苷酸總數(shù)。若RNAi多核苷酸是單鏈，則修飾百分比可基于單鏈RNAi多核苷酸中存 在的核苷酸總數(shù)。同樣，若RNAi多核苷酸是雙鏈，則修飾百分比可基于有義鏈、反義鏈或有 義和反義鏈二者中存在的核苷酸總數(shù)。此外，給定RNAi多核苷酸中存在的修飾核苷酸的實(shí) 際百分比還可取決于所述RNAi多核苷酸中存在的嘌呤和嘧啶核苷酸總數(shù)。例如，其中RNAi 多核苷酸中存在的所有嘧啶核苷酸和/或所有嘌呤核苷酸經(jīng)過修飾。
[0021] RNAi多核苷酸調(diào)控基因編碼的RNA表達(dá)。由于多種基因可彼此共有一定程度的序 列同源性，所以RNAi多核苷酸可設(shè)計(jì)為靶向具有足夠序列同源性的一類基因。因此，RNAi 多核苷酸可包括與不同基因靶標(biāo)之間共有或?qū)μ禺惢虬袠?biāo)獨(dú)特的序列互補(bǔ)的序列。因 此，RNAi多核苷酸可設(shè)計(jì)為靶向具有數(shù)種基因之間同源性的RNA序列的保守區(qū)域，從而靶 向基因家族中的數(shù)種基因（如不同基因同種型、剪接變體、突變基因等）。在另一實(shí)施方式 中，RNAi多核苷酸可設(shè)計(jì)為靶向?qū)我换蛑刑禺怰NA序列獨(dú)特的序列。
[0022] 術(shù)語"互補(bǔ)"指多核苷酸與另一多核苷酸序列通過常規(guī)沃森克里克或其他非常規(guī) 類型形成氫鍵的能力。涉及本發(fā)明的多核苷酸分子時(shí)，多核苷酸分子與其靶標(biāo)（有效結(jié)合 位點(diǎn)）或互補(bǔ)序列的結(jié)合游離能量足以推進(jìn)所述多核苷酸的相關(guān)功能，如酶的mRNA切割或 翻譯抑制。核酸分子結(jié)合游離能量的測定為本領(lǐng)域熟知（Frier等1986, Turner等1987)。 互補(bǔ)百分比表示第一多核苷酸分子中毗連鏈的堿基百分比，所述分子可與第二多核苷酸序 列形成沃森-克里克堿基配對。完美互補(bǔ)表示多核苷酸序列的毗連鏈中所有堿基與第二多 核苷酸序列中相同數(shù)量的連續(xù)堿基形成氫鍵。
[0023] 抑制、下調(diào)或敲減基因表達(dá)表示如用所述基因轉(zhuǎn)錄的RNA水平或從所述RNA翻譯 的多肽、蛋白或蛋白亞基水平所測量，所述基因的表達(dá)低于沒有阻斷本發(fā)明多核苷酸偶聯(lián) 物時(shí)觀察到的水平。用本發(fā)明組合物所遞送多核苷酸進(jìn)行的基因表達(dá)抑制、下調(diào)或敲減，優(yōu) 選低于存在對照失活核酸（序列雜亂的核酸或鈍化錯(cuò)配的核酸）時(shí)或所述多核苷酸未偶聯(lián) 掩蔽聚合物時(shí)觀察到的水平。
[0024] RNAi多核苷酸偶聯(lián)物
[0025] RNAi多核苷酸偶聯(lián)物提供了改良的RNAi多核苷酸體內(nèi)遞送。功能性遞送表示所 述RNAi多核苷酸遞送到細(xì)胞并預(yù)期具有生物學(xué)活性、基因表達(dá)的序列特異性抑制。給予哺 乳動(dòng)物脈管系統(tǒng)的許多分子（包括多核苷酸）通常由肝臟從身體中清除。肝臟對多核苷酸 的清除中所述多核苷酸發(fā)生降解或另外加工以從身體中去除且其中所述多核苷酸沒有引 起基因表達(dá)的序列特異性抑制，所述清除不視作功能性遞送。
[0026] 通過共價(jià)連接所述RNAi多核苷酸和所述靶向配體部分形成RNAi多核苷酸偶聯(lián) 物?？梢院铣苫蛐揎椝龆嗪塑账崾蛊浜蟹磻?yīng)基團(tuán)A?？梢院铣苫蛐揎椝霭邢虿糠质?其含有反應(yīng)基團(tuán)B。選擇反應(yīng)基團(tuán)A和B，從而其能用本領(lǐng)域已知的方法通過共價(jià)鍵而連接。
[0027] 所述靶向部分連接所述RNAi多核苷酸的3'末端。對于siRNA多核苷酸，所述靶 向部分可連接有義鏈或反義鏈，盡管優(yōu)選有義鏈。在一些實(shí)施方式中，所述siRNA通過含有 反應(yīng)基團(tuán)A(例如伯胺基團(tuán)）的短烷基鏈連所述接靶向部分。然后，反應(yīng)基團(tuán)A偶聯(lián)靶向部 分上的反應(yīng)基團(tuán)B (例如羧基基團(tuán)）。
[0028] 為了靶向肝內(nèi)的肝細(xì)胞，優(yōu)選的靶向配體是半乳糖簇。半乳糖簇包含具有2?4 種末端半乳糖衍生物的分子。如本文所用，術(shù)語半乳糖衍生物包括半乳糖和對去唾液酸糖 蛋白受體的親和性等于或超過半乳糖的半乳糖衍生物。末端半乳糖衍生物通過其C-1碳連 接分子。去唾液酸糖蛋白受體（ASGPr)對肝細(xì)胞獨(dú)特并結(jié)合分支的半乳糖末端糖蛋白。優(yōu) 選的半乳糖簇具有各自對去唾液酸糖蛋白受體具有親和性的3種末端半乳糖胺或半乳糖 胺衍生物。更優(yōu)選的半乳糖簇具有3種末端N-乙酰-半乳糖胺。本領(lǐng)域其他常見術(shù)語包 括三觸角型（trl-antennary)半乳糖、三價(jià)半乳糖和半乳糖三聚體。已知三觸角型半乳糖 衍生物簇以比二觸角型或單觸角型半乳糖衍生物結(jié)構(gòu)更強(qiáng)的親和性結(jié)合ASGPr (Baenziger 和 Fiete, 1980, Cell, 22,611-620 ;ConnoIIy 等，1982, J. Biol. Chem.，257,939-945)。需要 多價(jià)以獲得nM親和性。與遞送聚合物共給予時(shí)，提高單半乳糖衍生物濃度可以模擬出多觸 角型半乳糖衍生物的受體親和活性。
[0029] 半乳糖簇含各自連接中央分支點(diǎn)的三種半乳糖衍生物。所述半乳糖衍生物通 過所述糖的C-1碳結(jié)合中央分支點(diǎn)。半乳糖衍生物優(yōu)選通過接頭或間隔子連接所述 分支點(diǎn)。優(yōu)選的間隔子是靈活的親水間隔子（美國專利5885968 ;BieSSen等J. Med. Chem. 1995Vol. 39 P . 1538-1546)。優(yōu)選的靈活親水間隔子是PEG間隔子。優(yōu)選的PEG間隔 子是PEG3間隔子。分支點(diǎn)可為任何小分子，其允許所述三種半乳糖衍生物結(jié)合，還允許所 述分支點(diǎn)結(jié)合RNAi多核苷酸。示例性分支點(diǎn)基團(tuán)是二賴氨酸。二賴氨酸分子含三種胺基 (可通過其結(jié)合三種半乳糖衍生物）和羧基反應(yīng)基團(tuán)（二賴氨酸可通過其結(jié)合RNAi多核 苷酸）。分支點(diǎn)與RNAi多核苷酸的結(jié)合可通過接頭或間隔子發(fā)生。優(yōu)選的間隔子是靈活 的親水間隔子。優(yōu)選的靈活親水間隔子是PEG間隔子。優(yōu)選的PEG間隔子是PEG3間隔子 (三個(gè)乙烯單元）。所述半乳糖簇還可用本領(lǐng)域已知方法連接所述RNAi多核苷酸的3'或 5'末端。對于具有2條鏈的RNAi多核苷酸，例如siRNA，所述半乳糖簇可連接除反義鏈5' 末端的其余任意末端。
[0030] 優(yōu)選的半乳糖衍生物是N-乙酰-半乳糖胺（GalNAc)。對去唾液酸糖蛋白受體具 有親和性的其他糖可選自含有以下的列表：半乳糖、半乳糖胺、N-甲?；肴樘前贰-乙酰 基半乳糖胺、N-丙?；肴樘前?、N-正丁?；肴樘前泛蚇-異丁?；肴樘前贰Ｒ蜒芯?大量半乳糖衍生物對去唾液酸糖蛋白受體的親和性（參見例如：lbst，S. T.和Drickamer， K.J.B.C. 1996, 271，6686)或其易用本領(lǐng)域一般方法確定。
[0031] 體內(nèi)給藥方式
[0032] 藥理學(xué)和毒理學(xué)中，給藥途徑是使藥物、液體、毒劑或其他物質(zhì)接觸身體的途徑。 通常，用于治療哺乳動(dòng)物的藥物和核酸給予方法為本領(lǐng)域熟知，且可用于給予本發(fā)明組合 物。本發(fā)明化合物可通過任何合適途徑在根據(jù)所述途徑適當(dāng)調(diào)整的制劑中應(yīng)用，最優(yōu)選腸 胃外。因此，可通過注射，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)注射給予本發(fā)明化合物。因 此，本發(fā)明還提供含有藥學(xué)上可接受載體或賦形劑的藥物組合物。
[0033] 給予的腸胃外途徑包括脈管內(nèi)（靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)）、肌肉內(nèi)、實(shí)質(zhì)內(nèi)、皮內(nèi)、真皮下 (subdermal)、皮下（subcutaneous)、腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜下、硬膜外和淋巴內(nèi)注射， 使用注射器和針或?qū)Ч?。本文所述脈管內(nèi)表示稱為脈管的管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，其連接體內(nèi)的組織 或器官。所述管狀結(jié)構(gòu)的腔內(nèi)，體液流向或流自身體部分。體液的示例包括血液、腦脊液 (CSF)、淋巴液或膽汁。脈管的示例包括冠狀動(dòng)脈、細(xì)動(dòng)脈、毛細(xì)管、小靜脈、竇狀小管、靜脈、 淋巴管、膽管和唾液腺管或其他外分泌腺管。脈管內(nèi)途徑包括通過諸如動(dòng)脈或靜脈等血管 的遞送。血液循環(huán)系統(tǒng)提供藥物的全身擴(kuò)散。
[0034] 所述RNAi多核苷酸靶向部分偶聯(lián)物在藥學(xué)上可接受載體溶液中注射。藥學(xué)上可 接受指藥理學(xué)/毒理學(xué)角度上哺乳動(dòng)物可以接受的那些特性和/或物質(zhì)。短語藥學(xué)上可接 受指給予哺乳動(dòng)物時(shí)生理上可耐受且通常不產(chǎn)生過敏或其他不利或毒性反應(yīng)的分子實(shí)體、 組合物和特性。本文所用術(shù)語"藥學(xué)上可接受"優(yōu)選指被SFDA批準(zhǔn)，或中國藥典或其它公 認(rèn)藥典所列用于動(dòng)物應(yīng)用，更具體用于人。
[0035] 治療效果
[0036] RNAi多核苷酸靶向部分偶聯(lián)物用于研究目的或用于在治療細(xì)胞中產(chǎn)生變化。RNAi 多核苷酸靶向部分偶聯(lián)物用于研究試劑和各種治療、診斷、靶標(biāo)確認(rèn)、基因組開發(fā)、基因工 程改造和藥物基因組應(yīng)用。
[0037] 肝臟是基因治療最重要的靶組織，因?yàn)槠湓诖x（如各種血膽脂醇過多中的脂蛋 白代謝）和循環(huán)蛋白（如血友病中的凝結(jié)因子）分泌中起關(guān)鍵作用。此外，常見獲得性疾 病如慢性肝炎和硬化且也可能用基于多核苷酸的肝臟療法治療。影響或被肝臟影響的許多 疾病或病癥可通過敲減（抑制）肝臟中基因表達(dá)來治療。該肝臟疾病和病癥可選自含有以 下的列表：肝癌（包括肝細(xì)胞癌，HCC)、病毒感染（包括肝炎）、代謝紊亂（包括高脂血癥 和糖尿?。⒗w維癥和急性肝損傷。
[0038] 待給予的RNAi多核苷酸偶聯(lián)物的量（劑量）可憑經(jīng)驗(yàn)確定。用0. 1?10mg/kg動(dòng) 物體重的siRNA-偶聯(lián)物和5?60mg/kg動(dòng)物體重的遞送聚合物能有效敲減基因表達(dá)。小 鼠中的優(yōu)選量為〇. 25?2. 5mg/kg siRNA-偶聯(lián)物。RNAi多核苷酸偶聯(lián)物的量容易提高，因 為其通常在大劑量下無毒。
[0039] 本發(fā)明選擇人磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH)基因?yàn)槟繕?biāo)，觀察半乳糖化小干擾RNA 共價(jià)耦合物對肝細(xì)胞株Huh7的靶向轉(zhuǎn)遞能力，以及針對目標(biāo)基因的RNAi沉默效應(yīng)。下面 結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0040] 實(shí)施例1乳糖酸與末端氨基標(biāo)記小干擾RNA耦合反應(yīng)
[0041] 配制SI :0. 4M EDC于0. 2M MES緩沖液，pH4. 5，-20°C保存，使用前平衡至室溫；配 制S2 :0. 1M乳糖酸溶液于0. 2M MES緩沖液pH4. 5，-20°C保存，使用前平衡至室溫；配制S3 : 20D末端氨基標(biāo)記小干擾RNA (6nmol，80 μ g)溶于DEPC處理的Rnase滅活水中，-80°C保存， 使用前平衡至室溫。1〇〇 □ μ 1 S1、100 □ μ 1 S2與200 □ μ 1 S3混合，稍離心，各組分于 400 □ μ 1反應(yīng)總體積中的終濃度分別為0. 1Μ EDC，25mM乳糖酸，12. 5 □ μ Μ末端氨基標(biāo) 記小干擾 RNA (正義鏈：guaugacaacagccucaagt_NH2 ;反義鏈：cuugaggcuguugucauactt),反 應(yīng)體系為〇. 1M MES緩沖液，pH4. 5。反應(yīng)液于25°C反應(yīng)2h。用miRNAOUT柱脫鹽，重回收總 小干擾RNA。半乳糖化小干擾RNA共價(jià)耦合物連接產(chǎn)物經(jīng)脫鹽處理后，行長距離20 %聚丙 烯酰胺凝膠電泳鑒定。圖1顯示，泳道1之RNA分子量較泳道2氨基標(biāo)記小干擾RNA多出 約1個(gè)堿基大小，表明半乳糖化小干擾RNA共價(jià)耦合物正確合成。
[0042] 相較于文獻(xiàn)報(bào)道，本發(fā)明所合成的半乳糖化小干擾RNA耦合物采用一步法完成， 得率高（>90% )，見表1。小干擾RNA正義鏈3'端連接半乳糖配基導(dǎo)致該端解鏈溫度降低， 根據(jù)Schwarz法則，其干擾活性得到提高。
[0043] 表1三種糖氨耦合反應(yīng)比較
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于制備肝細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)遞小干擾RNA的方法，反應(yīng)底物包括乳糖酸或半乳糖衍 生物、末端氨基修飾RNAi多核苷酸和EDC，其中，乳糖酸或半乳糖衍生物作為耦合反應(yīng)的羧 基供體和靶向耦合物的半乳糖基供體，末端氨基標(biāo)記RNAi多核苷酸作為耦合反應(yīng)的伯氨 基供體，EDC作為零長度交聯(lián)劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法在0. 05M?0. 1M MES緩沖液pH4. 5 中進(jìn)行，乳糖酸與末端氨基標(biāo)記RNAi多核苷酸摩爾比例為1 : 1?2000 : 1，EDC與乳糖 酸摩爾比例為1 : 1?100 : 1。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法為25mM乳糖酸、12. 5 μ Μ末端氨基 標(biāo)記RNAi多核苷酸與0. 1Μ EDC三者混合于0. 1Μ MES ρΗ4. 5緩沖液中，短暫振蕩后離心， 于25°C反應(yīng)2h或4°C過夜，使羧基與伯氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，形成半乳糖化RNAi多核苷酸共 價(jià)耦合物。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述RNAi多核苷酸為siRNA、微RNA、雙鏈 RNA、短發(fā)夾RNA或編碼能誘導(dǎo)RNA干擾的表達(dá)盒。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述RNAi多核苷酸可被化學(xué)修飾，該化學(xué)修 飾包括：硫代磷酸酯核苷酸間連接、2' -0-甲基核糖核苷酸、2' -脫氧-2' -氟核糖核苷酸、 2' -脫氧核糖核苷酸、5-C-甲基核苷酸、或倒置脫氧脫堿基殘基摻入。
【文檔編號】C12N15/113GK104087574SQ201410283413
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】武文斌, 巴劍波, 陳雙紅, 郝蕙玲, 孫錦程, 徐雄利, 呂鴻雁 申請人:中國人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所