一種體外誘導(dǎo)記憶性b細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞的制備方法
【專利摘要】一種體外誘導(dǎo)記憶性B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞的制備方法,本發(fā)明是利用含CpG2006、IL-2、IL-10、B95-8細(xì)胞培養(yǎng)上清及胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，誘導(dǎo)從血液中分離的記憶性B細(xì)胞分化成為漿細(xì)胞，從而分泌出RSV特異性抗體的方法，這些抗體包括過去感染過RSV，但隨著時(shí)間衰減而血清學(xué)監(jiān)測不到的抗體。本發(fā)明相較于其他B細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)，本發(fā)明需要細(xì)胞數(shù)量少，誘導(dǎo)效率高，針對(duì)性強(qiáng)。
【專利說明】一種體外誘導(dǎo)記憶性B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種體外誘導(dǎo)記憶性B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]記憶B細(xì)胞是在初次免疫反應(yīng)后，產(chǎn)生IgM抗體的B細(xì)胞轉(zhuǎn)為產(chǎn)生IgG的一種B細(xì)胞。記憶B細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在體液免疫中扮演著十分重要的角色，對(duì)漿細(xì)胞的產(chǎn)生、抗體的生成以及持久的免疫保護(hù)起關(guān)鍵的作用。
[0003]記憶性B細(xì)胞在接種牛疫疫苗后能持續(xù)50年，而體液中抗體通常會(huì)在抗原清除后衰減。大多數(shù)的乙肝疫苗接種者在接種后的幾年內(nèi)都會(huì)失去保護(hù)性抗體，但乙肝病毒特異性的記憶性B細(xì)胞可以持續(xù)存在，在乙肝病毒或疫苗再次暴露的情況下，能夠提供快速保護(hù)性抗體反應(yīng)。
[0004]因此，記憶性B細(xì)胞的分析可以用來鑒定特定已知抗原的過去抗體反應(yīng)，從而對(duì)針對(duì)特定病原體或抗原的抗體特異性和保護(hù)免疫相關(guān)聯(lián)的血清學(xué)研究形成補(bǔ)充。此外，記憶性B細(xì)胞的分析不僅可以鑒定出新的治療用抗體，還開發(fā)出了一種無需使用雜交瘤細(xì)胞融合、噬菌體展示或EBV轉(zhuǎn)化就可制備特異性結(jié)合已知抗原的完全人單克隆抗體的新方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)血清學(xué)分析抗體表達(dá)譜的不足，提供一種體外誘導(dǎo)記憶性B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞的制備方法。
[0006]本發(fā)明是利用含CpG2006、IL_2、IL-10, B95-8細(xì)胞培養(yǎng)上清及胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，誘導(dǎo)從血液中分離的記憶性B細(xì)胞分化成為漿細(xì)胞，從而分泌出RSV特異性抗體的方法，這些抗體包括過去感染過RSV，但隨著時(shí)間衰減而血清學(xué)監(jiān)測不到的抗體。
[0007]本發(fā)明所述制備方法包括下列步驟:
1.飼養(yǎng)細(xì)胞的制備與保存:采集人的新鮮抗凝血，用淋巴細(xì)胞分離液分離出人的外周血淋巴細(xì)胞，經(jīng)過6ciCo輻照后使人外周血淋巴細(xì)胞喪失增殖能力，從而作為人記憶性B細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞；
2.誘導(dǎo)液的配置:按加入成分占終產(chǎn)物的質(zhì)量體積比或體積百分比加入如下成分:2.5 μ g/mL 的 CpG2006,10ng/mL 的 IL-2,10ng/mL 的 IL-10,體積百分比 25% 的 B95-8 細(xì)胞培養(yǎng)上清，體積百分比10%的胎牛血清，將以上成分加入到RPM1-1640培養(yǎng)基中，混勻；
3.記憶性B細(xì)胞的誘導(dǎo):將新鮮肝素鈉抗凝全血樣本用人淋巴細(xì)胞分離液分離，獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞，再用人記憶性B細(xì)胞磁珠分選試劑盒分離獲得記憶性B細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，按照200細(xì)胞/孔的密度接種到96孔U型底培養(yǎng)板，每孔加入200mL的培養(yǎng)液和50000個(gè)飼養(yǎng)細(xì)胞，在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)兩周，讓記憶性B細(xì)胞活化成為漿細(xì)胞；
4.漿細(xì)胞陽性孔的篩選:收集步驟(3)中的細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用呼吸道合胞病毒抗原G蛋白和F蛋白包被的酶標(biāo)板，采用酶聯(lián)免疫吸附測定方法檢測B細(xì)胞上清特異性，看是否分泌所需蛋白。
[0008]本發(fā)明的有益效果:相較于血漿抗體的分析，本發(fā)明采用體外誘導(dǎo)記憶性B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，從而分泌出RSV特異性抗體，這些抗體包括過去感染過RSV，但隨著時(shí)間衰減而血清學(xué)監(jiān)測不到的抗體。
[0009]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)數(shù)目；
圖2為B淋巴細(xì)胞數(shù)目；
圖3為記憶性B淋巴細(xì)胞數(shù)目；
圖4是7號(hào)陽性孔篩選結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0011]1、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備與保存:采集人的新鮮抗凝血，用淋巴細(xì)胞分離液分離出人的外周血淋巴細(xì)胞,經(jīng)過6ciCo輻照后的人的外周血淋巴細(xì)胞喪失增殖能力，可以作為人記憶性B細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，于液氮罐凍存。
[0012]2、體外誘導(dǎo) 記憶性B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液的制備:按加入成分占終產(chǎn)物的質(zhì)量體積比或體積百分比加入如下成分:2.5 μ g/mL的CpG2006,10ng/mL的IL-2，10ng/mL的IL-10，25%的B95-8細(xì)胞培養(yǎng)上清，10%的胎牛血清，將以上成分加入到RPM1-1640培養(yǎng)基中，混勻。
[0013]3、PBMCs的分離及記憶性B細(xì)胞的分選、活化培養(yǎng):將新鮮肝素鈉抗凝全血樣本用人淋巴細(xì)胞分離液分離，獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞(periphery blood mononuclear cell,PBMC)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，如圖1人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)數(shù)目；再用人記憶性B細(xì)胞磁珠分選試劑盒先分離出B細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),如圖2是B淋巴細(xì)胞數(shù)目；再從B細(xì)胞中分離獲得記憶性B細(xì)胞，再進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，如圖3是記憶性B淋巴細(xì)胞數(shù)目。按照200細(xì)胞/孔的密度接種到96孔U型底培養(yǎng)板，每孔加入200mL的培養(yǎng)液和50000個(gè)飼養(yǎng)細(xì)胞，在370C，5%C02條件下培養(yǎng)兩周，讓記憶性B細(xì)胞活化成為漿細(xì)胞。
[0014]實(shí)施例2:漿細(xì)胞陽性孔的篩選
使用酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法檢測細(xì)胞上清。首先將針對(duì)Rsv的不同抗原混合檢測，具體操作如下:
1、包板:用10ng/孔的GL和10ng/孔的FL包被酶標(biāo)板，4°C過夜。洗板機(jī)洗板5遍。洗液為含0.05% Tween的PBS。
[0015]2、封閉:用5%脫脂奶200 μ L /孔，37°C封閉2h，洗板5遍。
[0016]3、加入一抗:加入適當(dāng)稀釋的Rsv標(biāo)準(zhǔn)抗體和活化培養(yǎng)的記憶性B細(xì)胞的細(xì)胞上清，同時(shí)用水和1640培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，50 μ L /孔，37°C放置lh。洗板5遍。
[0017]4、加入二抗:加入1:1000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG，50 μ L/孔，37°C放置45min,洗板5遍。
[0018]5、顯色:加入TMB顯色液100 μ L/孔，室溫避光顯色20min，6、終止檢測:加入2Mol/L硫酸50 μ I/孔終止顯色反應(yīng)，檢測0D450nm，參考波長為630nmo
[0019] 其中樣本7 號(hào)的檢測結(jié)果如圖4所示。
【權(quán)利要求】
1.一種體外誘導(dǎo)記憶性B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞的制備方法，其特征是: (O飼養(yǎng)細(xì)胞的制備與保存:采集人的新鮮抗凝血，用淋巴細(xì)胞分離液分離出人的外周血淋巴細(xì)胞，經(jīng)過6tlCo輻照后使人外周血淋巴細(xì)胞喪失增殖能力，從而作為人記憶性B細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞； (2)誘導(dǎo)液的配置:按加入成分占終產(chǎn)物的質(zhì)量體積比或體積百分比加入如下成分:。2.5 μ g/mL 的 CpG2006,10ng/mL 的 IL-2，10ng/mL 的 IL-10,體積百分比 25% 的 B95-8 細(xì)胞培養(yǎng)上清，體積百分比10%的胎牛血清，將以上成分加入到RPM1-1640培養(yǎng)基中，混勻； (3)記憶性B細(xì)胞的誘導(dǎo):將新鮮肝素鈉抗凝全血樣本用人淋巴細(xì)胞分離液分離，獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞，再用人記憶性B細(xì)胞磁珠分選試劑盒分離獲得記憶性B細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，按照200細(xì)胞/孔的密度接種到96孔U型底培養(yǎng)板，每孔加入200mL的培養(yǎng)液和50000個(gè)飼養(yǎng)細(xì)胞，在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)兩周，讓記憶性B細(xì)胞活化成為漿細(xì)胞； (4.)漿細(xì)胞陽性孔的篩選:收集步驟(3)中的細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用呼吸道合胞病毒抗原G蛋白和F蛋白包被的酶標(biāo)板，采用酶聯(lián)免疫吸附測定方法檢測B細(xì)胞上清特異性，看是否分泌所需蛋 白。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104031880SQ201410284437
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】陳廷濤, 辛洪波, 魏強(qiáng) 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)