攜帶eb病毒核抗原1的重組腺病毒疫苗及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于疫苗制備領(lǐng)域，公開了一種攜帶EB核抗原1基因片段的重組腺病毒疫苗，該重組腺病毒疫苗是由EB核抗原1基因片段插入到腺病毒載體構(gòu)建而成；該EB核抗原1基因片段編碼EB核抗原1的C端氨基酸序列。本發(fā)明的疫苗可用于癌癥的預(yù)防和治療。
【專利說明】攜帶EB病毒核抗原1的重組腺病毒疫苗及其應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及疫苗制備領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及攜帶攜帶EB病毒核抗原I疫苗。更具體地說，本發(fā)明涉及經(jīng)所述的攜帶EB病毒核抗原I的重組腺病毒疫苗以及與其他疫苗聯(lián)合應(yīng)用。
[0003]

【背景技術(shù)】
[0004]世界衛(wèi)生組織下屬的國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)提供的新數(shù)據(jù)顯示，2012年全球新增約1410萬例惡性腫瘤病例，死亡人數(shù)達(dá)820萬。鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)在各種惡性腫瘤中具有獨(dú)特的流行病學(xué)特征，在世界上大多數(shù)國(guó)家很罕見，發(fā)病率在1/100000以下。而在我國(guó)南方很常見，嚴(yán)重危害人民的生命和健康，尤其是我國(guó)的廣東、廣西一些地區(qū)；大部分鼻咽癌發(fā)生在45?54歲年齡組，嚴(yán)重影響勞動(dòng)力健康。鼻咽癌發(fā)病率在腫瘤中位于第一、二位，被稱為“廣東癌”。
[0005]鼻咽癌是一種起源于鼻咽部上皮組織的常見惡性腫瘤。目前，放射治療是鼻咽癌首選的治療方案，按照分層綜合治療原則，多數(shù)早期病例采用單純放射治療，少數(shù)放射敏感性差的腫瘤和晚期病例可加輔助化療或增敏劑等，以提高療效。但中晚期鼻咽癌治療后常常復(fù)發(fā)或向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對(duì)于該類患者在臨床上尚無有效治療方案。
[0006]EB病毒和鼻咽癌密切相關(guān)，而且有一致性。EB病毒抗體，尤其是IgA/VCA抗體，在鼻咽癌患者中明顯高于對(duì)照組；腫瘤存在與消退與抗體滴度呈正相關(guān)，而與患者所在地理位置和種族差別無關(guān)；在未分化和高分化的鼻咽癌中能恒定地發(fā)現(xiàn)EB病毒基因組和EB病毒相關(guān)抗原；EB病毒含有能使B淋巴細(xì)胞、猴腎和人類上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化和不斷增殖的基因；咽部正常細(xì)胞膜和鼻咽癌細(xì)胞均有EB病毒受體的存在。雖然病毒能進(jìn)入咽部正常上皮細(xì)胞內(nèi)，而且腫瘤中也存在病毒基因組，但病毒在鼻咽癌發(fā)生中的作用機(jī)制還未被證實(shí)。
[0007]病毒在活體內(nèi)的感染是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括病毒的潛伏、活化、轉(zhuǎn)化復(fù)制等。鼻咽癌患者的腫瘤組織以及外周血淋巴細(xì)胞中存在著EB病毒潛伏感染。在已分化和未分化上皮細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)EB病毒基因組和潛伏基因產(chǎn)物；所有鼻咽癌都表達(dá)EB病毒編碼的潛伏蛋白和EBNAl。EB病毒所表達(dá)的潛伏抗原中，LMPl被認(rèn)為在鼻咽癌發(fā)生中起關(guān)鍵性作用，它可以誘發(fā)細(xì)胞增生并影響細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，被認(rèn)為是EB病毒的一個(gè)致癌基因。NPC患者的血清中存在EBV特異性的IgA/VCA抗體，在NPC組織中存在EBV核酸和基因的表達(dá)。在NPC患者血清中發(fā)現(xiàn)了 EBV DNA的增殖。這些結(jié)果引導(dǎo)人們將EB病毒基因作為EBV相關(guān)腫瘤的特異性免疫靶抗原。
[0008]EB病毒主要通過唾液傳播，世界上大多數(shù)人都感染了 EB病毒，一旦感染終身攜帶。但多數(shù)人安然無恙，僅有少數(shù)個(gè)體發(fā)展成為NPC，顯然EBV特異性細(xì)胞免疫在控制病毒、防止腫瘤發(fā)生中起到了重要的作用。同時(shí)有特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic Tlymphocyte, CTL),它控制EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞，這種特異性的細(xì)胞免疫是受HLA所限制的。并發(fā)現(xiàn)具有這種特異活性的T細(xì)胞識(shí)別表位。近年來，經(jīng)過研究和詳細(xì)分析已證明LMPULMP2均能誘發(fā)特異性CTL反應(yīng)。細(xì)胞免疫在對(duì)病毒活化的“監(jiān)視”和清除轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞中起著關(guān)鍵性作用。
[0009]NPC細(xì)胞的EBV抗原表達(dá)主要局限在EBNAl和LMP1、LMP2上。LMPl作為EBV重要的致瘤蛋白，在許多EBV相關(guān)疾病中扮演重要的角色，是EB病毒細(xì)胞免疫反應(yīng)的刺激劑和靶抗原，尤其是N段的蛋白區(qū)域，提供了 EB病毒誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞毒性殺傷反應(yīng)的靶抗原，在早前就有證實(shí)LMPl蛋白序列中有特異性CTL識(shí)別表位，具有激發(fā)細(xì)胞免疫的能力，但該基因具有潛在的致癌性。LMP2也是在NPC等EBV相關(guān)腫瘤中持續(xù)表達(dá)的病毒蛋白之一。LMP2不引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，無致癌性。并且LMP2蛋白序列中存在多個(gè)可被人CTL識(shí)別的抗原表位，不同的人HLA分型識(shí)別不同的抗原表位，而且LMP2也能刺激轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞系的CTL反應(yīng)。國(guó)際上已經(jīng)用LMP2作為治療性疫苗，用于NPC的臨床試驗(yàn)。我們科室構(gòu)建的包含該基因的重組腺病毒疫苗已經(jīng)完成臨床I期試驗(yàn)，并申報(bào)臨床I1、111期試驗(yàn)。構(gòu)建的痘苗病毒疫苗，正處于臨床前的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)階段。
[0010]EBNAl蛋白中包含一段甘氨酸-丙氨酸重復(fù)區(qū)(Gly-Ala repeat reg1n),具有阻止EBNAl全長(zhǎng)蛋白的降解，抑制其遞呈給CD8+T細(xì)胞的作用，這種潛在的免疫抑制作用限制了其在EBV相關(guān)腫瘤免疫治療中的應(yīng)用，尤其限制了伯爾基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma,BL)的CTL治療。
[0011]EBV核抗原I (EB nuclear antigenl, EBNA1)是在NPC組織細(xì)胞中有限表達(dá)的幾種抗原之一，也是唯一在EBV潛伏感染和活化狀態(tài)中均表達(dá)的抗原。早期研究顯示=EBNAl表達(dá)產(chǎn)物為DNA結(jié)合蛋白，是EB病毒在腫瘤細(xì)胞中維持潛伏感染狀態(tài)及DNA復(fù)制的關(guān)鍵因子，是重要的致細(xì)胞轉(zhuǎn)化蛋白，同時(shí)，可以誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，在NPC病人中可以檢測(cè)到IgG/ENBAl和IgA/EBNAl抗體。近年研究發(fā)現(xiàn)EBNAl蛋白序列中含有的⑶4+ T細(xì)胞表位，在特異性的CD4 +T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用。
[0012]EBNAl由EBV BamHIK基因編碼，長(zhǎng)1923bp，無內(nèi)含子，編碼641個(gè)氨基酸。依據(jù)EBNAl氨基酸序列特點(diǎn)將其分成3部分，N端(1-89):由89個(gè)氨基酸組成；G_Ar重復(fù)序列(90-327):由多個(gè)“甘氨酸和丙氨酸”組成的重復(fù)序列;C端(328-641):含有多個(gè)⑶4T細(xì)胞識(shí)別表位。其中1-89位和322-379位氨基酸殘基，互相協(xié)調(diào)共同介導(dǎo)病毒基因組以附加體的形式連接細(xì)胞染色體上并持續(xù)存在。
[0013]近年研究發(fā)現(xiàn)EBNAl C-末端(380-641位氨基酸)具有明顯特異性⑶4 + T細(xì)胞表位，對(duì)比而言很少能看到針對(duì)于潛伏膜蛋白(LMP1、2)表位的反應(yīng)(EBNA1、EBNA3C>>LMP1和LMP2)。在我國(guó)鼻咽癌高危人群中EBNAl多肽表位明顯集中在EBNAl的C-末端區(qū)域，包括DP5-限制性多肽表位，被近一半的檢測(cè)志愿者所識(shí)別，引起DP5-陽性靶細(xì)胞對(duì)EBNAl的識(shí)別[27]。文獻(xiàn)報(bào)道，在EBNAl中可能有28條⑶4 T細(xì)胞識(shí)別表位，而目前能夠確定的只有10條(DP3, DP5, DQ2, DQ7, DRl, DR7, DR11，DR14，DR15, DR103)。CD4 + T 細(xì)胞主要分為兩個(gè)亞群輔助性T細(xì)胞(Thl和Th2)，是抗病毒抗體和CTL產(chǎn)生過程中所必需的輔助細(xì)胞，同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞因子如IFN-Y和TNF等直接發(fā)揮抗病毒作用，參與機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。有研究表明，EBNAl的51個(gè)重疊多肽(aa400-641)刺激⑶4+特異性記憶T細(xì)胞和IFN- Y的釋放，單獨(dú)的EBNAl多肽不能檢測(cè)到CTL應(yīng)答，但對(duì)包含有EBNAl (aa73_487)或EBNAl(aa494-508)的多聚抗原表位卻呈現(xiàn)較強(qiáng)的應(yīng)答反應(yīng)。在14例EBV陽性淋巴組織增生性疾病患者中有9例患者可成功產(chǎn)生EBNAl特異性⑶8+效應(yīng)T細(xì)胞[28]。健康人體優(yōu)先識(shí)別EBNAlC-末端部分區(qū)域(aa452-548)，患者的CD4+T細(xì)胞對(duì)整個(gè)C-末端區(qū)域(aa400_641)有較廣泛的識(shí)別作用，人類白細(xì)胞DR限制性EBNAl (aa481-500)表位形成部分C-末端螺旋區(qū)域。EBNAl (aa458 - 641)可被CD4-T細(xì)胞表位識(shí)別，EBNAl (aa401_641)表位的形成也已被[29]報(bào)道。人類白細(xì)胞DR限制性EBNAl(aa514-527)表位來自EBV游離體，該表位形成部分β_片層結(jié)構(gòu)。EBNAl (aa561-573)對(duì)特異性CD4+T細(xì)胞同時(shí)具有很高的親和力，因此該多肽可用于T細(xì)胞識(shí)別強(qiáng)有力的刺激物并可被HLA-DRl1、-DRl2或-DR13分子遞呈。數(shù)據(jù)顯示，該多肽優(yōu)先誘導(dǎo)⑶4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，EBNAl (aa518-530)多肽優(yōu)先誘導(dǎo)⑶4+效應(yīng)T細(xì)胞；605-641位氨基酸殘基的肽段存在一個(gè)酸性激活的結(jié)構(gòu)域，該羧基末端具有較強(qiáng)的免疫原性:EBNA1 (aa607-619)特異性⑶4+T細(xì)胞對(duì)MHC-1類多肽具有很強(qiáng)的親和力，可被常見的HLA-DQ2分子遞呈。
[0014]EBNAl在特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答中起重要的作用。在EB病毒感染導(dǎo)致的伯爾基特淋巴瘤細(xì)胞中，EBNAl在以附加體形式存在的細(xì)胞中呈現(xiàn)明顯負(fù)調(diào)控效應(yīng)。EBNAl特異性⑶4 + T細(xì)胞系，包括⑶4+輔助T細(xì)胞和調(diào)節(jié)T細(xì)胞，具有雙重效應(yīng)，既可刺激新生⑶4+和CD8+T細(xì)胞的增殖反應(yīng)，也可誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫抑制。在器官移植者中，循環(huán)中的EBV特異性的⑶8 + T細(xì)胞功能和數(shù)量依賴于⑶4 + T細(xì)胞的數(shù)量。絕對(duì)低的⑶4 + T細(xì)胞數(shù)量，大大增加了移植后淋巴細(xì)胞增生性疾病風(fēng)險(xiǎn)。一些報(bào)道稱EBNAl特異性的⑶4T細(xì)胞在體外能抑制EBV感染的B細(xì)胞生長(zhǎng)，EBV特異性的⑶4+T細(xì)胞在T細(xì)胞基礎(chǔ)上的治療可能發(fā)揮重要的作用。在EBV相關(guān)腫瘤中和細(xì)胞系中，EBNAl在細(xì)胞核中的定位影響CD4+T細(xì)胞表位的展示，其轉(zhuǎn)錄與表達(dá)決定EBV陽性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，EBNAl特異性的CD4+T細(xì)胞識(shí)別EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞系，翻譯效率影響CD8+T細(xì)胞識(shí)別表位的抗原提呈。對(duì)NPC的研究，由于NPC細(xì)胞僅選擇性的穩(wěn)定表達(dá)EBNAl和LMP1、2，因而EBNAl可能在特異性的⑶4 + T介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用。
[0015]鑒于EBNAl在特異性的⑶4 + T介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)中起重要的作用，目前已經(jīng)有把EBNAl作為治療NPC疫苗的報(bào)導(dǎo)。Taylor等將EBV的EBNAl的CD4細(xì)胞識(shí)別表位集中區(qū)域(363-641位氨基酸)基因和LMP2全長(zhǎng)的全長(zhǎng)基因連接起來創(chuàng)建了 EL融合基因，構(gòu)建了重組安卡拉痘苗病毒疫苗人(rMVA-EL)，表達(dá)嵌合抗原，以此激活特異性的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。結(jié)果表明在EBV陽性的白人和華人中，rMVA-EL可以激活記憶性CD4+和⑶8+T免疫應(yīng)答。并且，高的免疫劑量激發(fā)更強(qiáng)程度的EBNA1/LMP2應(yīng)答水平。目前rMVA-EL已經(jīng)在英國(guó)和香港完成了 I期臨床試驗(yàn)，正在進(jìn)行II期臨床試驗(yàn)。Lutzky VP等利用非復(fù)制型的腺病毒5/F35載體(Ad5F35)將LMP1、LMP2和EBNAl氨基酸序列以30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度為一個(gè)肽段依次進(jìn)行分割，相鄰肽段之間有15個(gè)氨基酸重疊，然后利用計(jì)算機(jī)軟件將各肽段隨機(jī)串聯(lián)，拼接成一個(gè)全新的蛋白序列，其中LMPl去除11個(gè)氨基酸共5個(gè)拷貝的重復(fù)區(qū)，EBNAl去除283個(gè)甘氨酸一丙氨酸重復(fù)區(qū)。然后，根據(jù)新蛋白序列合成的6869bp的cDNA，依據(jù)密碼子偏愛性選擇第一或第二密碼子，避免重疊氨基酸的編碼相同，插入到Ad5F35載體中構(gòu)建一個(gè)新的抗原拼接疫苗(Ad-SAVINE)。實(shí)驗(yàn)表明構(gòu)建的Ad-SAVINE可以激活健康人和鼻咽癌患者的LMP特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。Smith等用Ad-SAVINE疫苗對(duì)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的NPC患者進(jìn)行正規(guī)臨床試驗(yàn)效果評(píng)估。在24個(gè)參加試驗(yàn)的病人中，16個(gè)病人EBV特異性的CTL水平明顯升高(72.7%)，6個(gè)僅有微小或沒有增加。在過繼性免疫治療后，EBNAl和LMPl、LMP2特異性CTL增加的NPC患者出現(xiàn)一度流感樣癥狀或輕微不適。NPC的生存期38?420d，均值136d，同沒有接受T細(xì)胞的比較，平均生存期從22(T523d。結(jié)果表明Ad-SAVINE疫苗進(jìn)行過繼性免疫治療安全性和耐受性良好，可以使NPC患者臨床受益。盡管如此，EBNAl對(duì)于具有CD8+T細(xì)胞識(shí)別表位的LMP2特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響，還不清明確。因此，根據(jù)EBNAl本身的特性構(gòu)建質(zhì)粒，以EBNAl作為一種T細(xì)胞治療腫瘤的有限靶抗原，也是目前研究的新熱點(diǎn)，將為EB病毒相關(guān)腫瘤的靶向性基因治療提供一個(gè)更新、更有效的途徑。
[0016]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]基于本科室在EB病毒相關(guān)重組疫苗的研究基礎(chǔ)，依據(jù)EBNAl基因特異性及腺病毒的廣泛應(yīng)用，我們將構(gòu)建EBNAl蛋白羧基末端序列939bp重組腺病毒pDC316_EBNAl質(zhì)粒，使用AdMax包裝系統(tǒng):其包裝系統(tǒng)包括pBHG骨架質(zhì)粒，穿梭質(zhì)粒，HEK293細(xì)胞，通過Cre/LoxP獲得重組病毒，這個(gè)過程發(fā)生在293細(xì)胞中，得到的重組病毒是El缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒，病毒在不能夠提供El區(qū)的細(xì)胞中只能實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)而本身不具備增殖能力。具體而言，本發(fā)明涉及經(jīng)所述的攜帶EB病毒核抗原I的重組腺病毒疫苗和與其疫苗聯(lián)合的疫苗。本發(fā)明還提供了攜帶EB病毒核抗原I的重組腺病毒疫苗的制備方法。
[0018]EB病毒與許多人類腫瘤相關(guān),其中EBV核抗原I (EB nuclear antigenl,EBNA1)是在NPC組織細(xì)胞中有限表達(dá)的幾種抗原之一，也是唯一在EBV潛伏感染和活化狀態(tài)中均表達(dá)的抗原。EBNAl蛋白中含有⑶4+T細(xì)胞識(shí)別表位，但其中也中包含一段甘氨酸-丙氨酸重復(fù)區(qū)(Gly-Ala repeat reg1n),具有阻止EBNAl全長(zhǎng)蛋白的降解,抑制其遞呈給⑶8+T細(xì)胞的作用，這種潛在的免疫抑制作用限制了其在EBV相關(guān)腫瘤免疫治療中的應(yīng)用，因此，結(jié)合我們?cè)贓BV疫苗研究方面的工作，通過基因工程手段改造的EBNA1(去除重復(fù)序列)，同時(shí)攜帶該基因的疫苗對(duì)其他攜帶EBV相關(guān)基因疫苗細(xì)胞免疫應(yīng)答的起促進(jìn)作用的部分。
[0019]本發(fā)明的發(fā)明人成功構(gòu)建了一種復(fù)制缺陷型的重組腺病毒，該病毒攜帶外源基因，所述的外源基因編碼的蛋白是一種能夠很好的引發(fā)CTL反應(yīng)和增強(qiáng)其他特異性的CTL反應(yīng)的抗原。本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述的外源基因?yàn)镋B病毒核抗原I編碼的基因(EBNA1)，這種攜帶有EB病毒核抗原I編碼的基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒簡(jiǎn)稱^rAd-EBNAl或含有EBNAl基因的重組腺病毒。所述的rAd-EBNAl滴度不小于IX 101° VP/mL，可在體內(nèi)誘導(dǎo)EBNAl特異性的抗體生成反應(yīng)和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該重組病毒的滴度為IXlO13 VP/mL.本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的rAd-EBNAl是利用Admax系統(tǒng)構(gòu)建的。
[0020]簡(jiǎn)而言之，為了得到本發(fā)明所述的rAd-EBNAl，我們首先PCR法擴(kuò)增B95-8細(xì)胞株中EBV ebnal基因的C-端部分片段，經(jīng)I和汝^ II酶切位點(diǎn)插入pDC316穿梭質(zhì)粒。測(cè)序比對(duì)正確后，與腺病毒骨架質(zhì)粒PBHG共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。收集病變后細(xì)胞，獲得的重組病毒顆粒。并進(jìn)一步在293細(xì)胞擴(kuò)增和純化，獲得高純度病毒。
[0021]PCR擴(kuò)增獲得939 bp 基因片段，通過I和及^7 II酶切位點(diǎn)插入，獲得重組穿梭質(zhì)粒PDC316-EBNA1，測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)株序列一致。pDC316_EBNAl和骨架質(zhì)粒pBHG共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)病變，獲得含EBV 基因片段的重組腺病毒(rAd-EBNAl)。流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，EBNAl在293細(xì)胞中表達(dá)，電鏡下觀察到典型的腺病毒顆粒，病毒二代滴度可達(dá)18 TCID5(l/mL。進(jìn)一步擴(kuò)增可獲得重組病毒的滴度為I X 113 VP/mL.另一方面，本發(fā)明提供了攜帶EBNAl基因的rAd-EBNAl。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)本發(fā)明所述的rAd-EBNAl。本發(fā)明中所述的重組腺病毒是E1、E3基因缺失的非復(fù)制型腺病毒5型載體系統(tǒng)一AdMax?系統(tǒng)。腺病毒載體是基因治療中發(fā)展最為成熟的載體系統(tǒng)。具有安全性高、穩(wěn)定性好、宿主細(xì)胞范圍廣泛、對(duì)人致病性低、規(guī)?；蜕虡I(yè)化程度高、同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因等優(yōu)點(diǎn)。因而已在基因工程疫苗研制和基因治療中顯示出巨大的應(yīng)用前景。AdMax?腺病毒系統(tǒng)是由腺病毒載體鼻祖Dr.Frank Graham在1999年創(chuàng)建的一套重組腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)，該系統(tǒng)基本原理是通過Cre-1oxP重組酶，使共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中的腺病毒載體穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒在重組酶的作用下產(chǎn)生重組腺病毒，得到的重組病毒是E1/E3缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒。與其他腺病毒包裝系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，具有出毒速度快(7-10d)、效率高(高約100倍)、可信度高(序列<7-8kb，外源蛋白對(duì)腺病毒沒有毒性，可以完全表達(dá))、過程簡(jiǎn)單(僅需構(gòu)建穿梭質(zhì)粒和共轉(zhuǎn)染兩步)優(yōu)勢(shì)。
[0022]本文中所述的含EBV EBNAl基因片段的rAd-EBNAl疫苗，表達(dá)外源基因編碼的蛋白抗原。其中所述的外源基因?yàn)镋BNAl蛋白基因。
[0023]本文中所述的rAd-EBNAl，表達(dá)外源基因編碼蛋白復(fù)制缺陷型rAd-EBNAl疫苗。
[0024]另一方面本發(fā)明提供的一種制備rAd-EBNAl疫苗的方法包括:
Cl) 本實(shí)驗(yàn)成功從B95-8細(xì)胞中獲取EBV EBNAl基因片段；
(2)構(gòu)建了重組穿梭質(zhì)粒PDC316-EBNA1 ;
(3)在293細(xì)胞內(nèi)包裝出重組腺病毒rAd-EBNAl，并表達(dá)了 EBNAl蛋白。
[0025](4) 用如上方法的到rAd-EBNAl疫苗。
[0026]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，其中所述的腺病毒穿梭質(zhì)粒是PDC316。
[0027]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，其中所述的腺病毒骨架質(zhì)粒是pBHG。
[0028]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，其中所述的腺病毒包裝細(xì)胞是293細(xì)胞。
[0029]試驗(yàn)證明本發(fā)明所述的rAd-EBNAl能夠在體外激發(fā)EBNAl特異性的CTL，同時(shí)對(duì)LMP2特異性CTL反應(yīng)起增強(qiáng)作用。
[0030]本發(fā)明所述的rAd-EBNAl疫苗，用于治療和預(yù)防EBV相關(guān)腫瘤的疫苗和藥物用途。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中所述的疫苗為rAd-EBNAl疫苗，所述的腫瘤為鼻咽癌。
[0031]根據(jù)給藥的途徑不同，可將本發(fā)明的疫苗組合配置成靜脈、肌肉內(nèi)、體腔內(nèi)、組織內(nèi)、皮內(nèi)或皮下給藥的可注射溶液或分散劑。
[0032]為了制備注射溶劑，例如可以使用無菌蒸餾水、注射用水、磷酸緩沖液、以及含有乙醇、多元醇的溶劑或分散介質(zhì)作為載體或稀釋劑。在任何情況下，所述的可注射制劑均應(yīng)是無菌和可流動(dòng)并適合于通過注射器注射給藥的。
[0033]也可用于制藥工業(yè)中已知的方法和輔助成分，將本發(fā)明的疫苗組合制成包裹劑。
[0034]另一方面，本發(fā)明提供了所述的疫苗制備用于預(yù)防和治療EB病毒相關(guān)腫瘤，特別是鼻咽癌的疫苗或藥物應(yīng)用。
[0035]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1:ebnal基因片段擴(kuò)增及回收電泳圖；
圖2:pDC316-EBNAl雙酶切、單酶切、pDC316單酶切鑒定；
圖3:質(zhì)粒在293細(xì)胞內(nèi)的重組不意圖；
圖4:感染rAd-EBNAl后293細(xì)胞出現(xiàn)的典型病變(200 X)；
圖5:rAd-EBNAl顆粒電鏡負(fù)染結(jié)果(X97 000)；
圖 6:ffestern blot 鑒定 EBNAl 表達(dá)；
圖?:流式細(xì)胞儀檢測(cè)EBNAl在細(xì)胞中表達(dá)；
圖8:ELISP0T法檢測(cè)小鼠EBNAl特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)；
A:免疫后I周EBNAl特異性細(xì)胞免疫反應(yīng) B:免疫后2周EBNAl特異性細(xì)胞免疫反應(yīng) C:免疫后4周EBNAl特異性細(xì)胞免疫反應(yīng) D:免疫后8周EBNAl特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)圖9 =EBNAl CD4+T特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答持續(xù)時(shí)間。
[0037]

【具體實(shí)施方式】
實(shí)施例
[0038]在本申請(qǐng)中，如無特殊說明，本發(fā)明的實(shí)施都使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)常規(guī)，技術(shù)，這些技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握。
[0039]實(shí)驗(yàn)材料和方法
大腸桿菌DH5a、質(zhì)粒PDC316、pBHG、B95_8、293細(xì)胞細(xì)胞株為中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所曾毅院士實(shí)驗(yàn)室保存。培養(yǎng)條件為含10% FBS、1%青鏈霉素、1%谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液。其中FBS購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司、DMEM購(gòu)自Hyclone公司，其他培養(yǎng)液均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所配液室提供。
[0040]質(zhì)粒大量提取試劑盒QIAGEN Plasmidega Kits購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；常用限制性內(nèi)切酶l、bgl I1、核酸凝膠純化試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司；真核轉(zhuǎn)染試劑FuGene HD購(gòu)自美國(guó)Promega公司；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和無菌PBS購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；PVDF膜MultiScreenHTS購(gòu)自瑞典MABTECH公司；Tris堿(SERVA公司)，硼酸(上海云嶺化工廠，AR)，EDTA (Sigma原裝)，胰蛋白胨(0X0ID公司)，酵母提取物(0X0ID公司)，山羊抗小鼠EBNAl單抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz B1technology公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、流式抗體購(gòu)自中衫金橋生物技術(shù)有限公司。其他分析純化學(xué)試劑由中國(guó)疾控中心病毒病所提供。
[0041]實(shí)施例1
1.1.ebnal基因片段的獲取
EBV ebnal片段的PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)及合成用Primer5.0、DNAstar軟件配合設(shè)計(jì)，由B95-8標(biāo)準(zhǔn)株為模板擴(kuò)增939 bp (108937-109875) (aa329_aa641)的ebnal基因，具體序列見 SEQ NO:1 ；
c gaggaggcag tggaggccgg
108961 ggtcgaggag gtagtggagg ccggggtcga ggaggtagtg gaggccgccg gggtagagga
109021 cgtgaaagag ccaggggggg aagtcgtgaa agagccaggg ggagaggtcg tggacgtgga
109081 gaaaagaggc ccaggagtcc cagtagtcag tcatcatcat ccgggtctcc accgcgcagg
109141 ccccctccag gtagaaggcc atttttccac cctgtagggg aagccgatta ttttgaatac
109201 caccaagaag gtggcccaga tggtgagcct gacgtgcccc cgggagcgat agagcagggc
109261 cccgcagatg acccaggaga aggcccaagc actggacccc ggggtcaggg tgatggaggc
109321 aggcgcaaaa aaggagggtg gtttggaaag catcgtggtc aaggaggttc caacccgaaa
109381 tttgagaaca ttgcagaagg tttaagagct ctcctggcta ggagtcacgt agaaaggact
109441 accgacgaag gaacttgggt cgccggtgtg ttcgtatatg gaggtagtaa gacctccctt
109501 tacaacctaa ggcgaggaac tgcccttgct attccacaat gtcgtcttac accattgagt
109561 cgtctcccct ttggaatggc ccctggaccc ggcccacaac ctggcccgct aagggagtcc
109621 attgtctgtt atttcatggt ctttttacaa actcatatat ttgctgaggt tttgaaggat
109681 gcgattaagg accttgttat gacaaagccc gctcctacct gcaatatcag ggtgactgtg
109741 tgcagctttg acgatggagt agatttgcct ccctggtttc cacctatggt ggaaggggct
109801 gccgcggagg gtgatgacgg agatgacgga gatgaaggag gtgatggaga tgagggtgag
109861 gaagggcagg agtga
在引物上下游分別插入EcoR 1、Bgl II酶切位點(diǎn)，以便于克隆基因插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC316中。(引物序列如下:上游5 ’ CGGAATTCATGCGAGGAGGCAGTG3，下游5’GAAGATCTTCACTCCTGCCCTT3’其中斜體部分分別為EcoR 1、Bgl II酶切位點(diǎn)。)PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下:10 X PCR buff er2.5 μ L, dNTP(10 mmol) 2 yL，上下游引物20 μ M各 0.5 yL，Taq 酶 0.5 yL，模板 I μ L，ddH2018 yL，共計(jì) 25 μ L 反應(yīng)體系。95°C X4min, (94 °C X 30 s,56°C X 30 s,72°C Xl min) X 30Cycles, 72°C 8 min，4°C 儲(chǔ)存。同時(shí)做陰性對(duì)照(陰性模板為高壓滅菌水)。
[0042]1.2.ebnal基因片段切膠回收
將PCR產(chǎn)物10 μ L上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳，充分分離后在紫外燈照射下觀察是否出現(xiàn)目的條帶，切下目的條帶，做切膠回收(用試劑盒)。方法如下:按照0.1 g膠加入300μ L QG 的比例，50°C 10 min,間斷混勻 2-3 次；上清轉(zhuǎn)入 QIA quick spin column, 12 000rpm 離心 I min JPAPE Buffer 700 μ L, 12 000 rpm 離心 I min ; 12 000 rpm 再次離心I min ;加15 μ L ddH20于純化柱介質(zhì)上,靜置I min ; 12 000 rpm離心I min,收集DNA溶液；3 yL上樣，在110 V電壓下1%瓊脂糖凝膠觀察擴(kuò)增產(chǎn)物回收的情況，結(jié)果見圖1。
[0043]1.3.ebnal基因片段及穿梭質(zhì)粒pDC316雙酶切及回收
參照限制性內(nèi)切酶雙酶切使用表用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Bgl II分別雙酶切PDC316、EBV-ebnal PCR擴(kuò)增后膠回收片段。雙酶切體系是20 yL(DNA/質(zhì)粒2 yL ；NEBufferf μ L ；EcoR I 0.5 μ L ；Bgl II 0.5 μ L, ddH20 14 μ L)，在建議最適溫度 37°C培養(yǎng)箱中酶切過夜。將酶切產(chǎn)物10 μ L上樣，在110 V電壓下1%瓊脂糖凝膠電泳，充分分離后在紫外燈照射下觀察是否出現(xiàn)目的條帶，在紫外燈下切膠并使用Qiagen公司的切膠回收試劑盒回收目的片段，具體操作參見相關(guān)說明書。3 UL上樣，在110 V電壓下1%瓊脂糖凝膠觀察酶切產(chǎn)物回收的情況。
[0044]1.4.ebnal片段和穿梭質(zhì)粒pDC316的連接
回收產(chǎn)物測(cè)濃度，連接比例按照載體:目的片段=1:3飛(摩爾比)的比例進(jìn)行連接。連接體系如下(20 yL):pDC316 9 μ L ；EBV-ebnal 4 μ L ;連接酶 I μ L ;Buffer 2 μ L ；Η204 yL，16°C連接過夜。
[0045]1.5.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α
將連接產(chǎn)物加入200 μ L DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的Eppendorf管中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min。將管移入預(yù)熱的42°C水浴箱中水浴90 S，然后迅速將試管轉(zhuǎn)移到冰上，使細(xì)菌冷卻2^3 min。每管加入800 μ L不含抗生素的LB培養(yǎng)基，移至37°C搖床上，溫育45 min (轉(zhuǎn)速<150 rpm)。取50 μ L已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，用一支無菌的彎頭玻棒輕輕涂到含AMP (100μ g/mL)的瓊脂平板表面，將平板平置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12?16 h(同時(shí)做陰性對(duì)照)。
[0046]1.6.pDC316-EBNAl 的提取及鑒定
挑瓊脂平板上的3個(gè)單菌落分別于5 mL含Amp(100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 °C，220rpm搖床過夜。用無菌吸頭吸取5 μ L做PCR反應(yīng)模板，反應(yīng)體系與反應(yīng)條件同目的片段的獲取。將PCR鑒定正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒的小量制備(用Qiagen質(zhì)粒提取Kit)，具體步驟參考試劑盒說明書。對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行濃度測(cè)定及單、雙酶切鑒定，體系10 μ L(質(zhì)粒3μ L ；NEBuffer I μ L ；EcoR I 0.5 μ L ；Bgl II 0.5 μ L ；ddH20 5 μ L)，37°C水浴 / 孵育箱4 h，將酶切產(chǎn)物3 μ L上樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。初步鑒定正確后取5 μ L送由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序，用以確定擴(kuò)增過程中是否出現(xiàn)堿基錯(cuò)配以及讀框正確。將測(cè)序鑒定正確的質(zhì)粒命名為PDC316-EBNA1。
[0047]實(shí)施例2
2.1.穿梭質(zhì)粒及骨架質(zhì)粒的提取
包裝腺病毒所用質(zhì)粒的質(zhì)量與包裝的成功率有密切的關(guān)系，為此在包裝前用EndoFreePlasmid Maxi Kit提取所需的骨架質(zhì)粒pBHGLox Δ El.3Cre,制備方法依試劑盒的操作說明所述。穿梭質(zhì)粒為上述構(gòu)建的PDC316-EBNA1。將制備好的質(zhì)粒溶于試劑盒附帶的無菌TE溶液中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm/280 nm的OD值，計(jì)算核酸純度(要求0D260/0D280>1.8)及核酸含量，分裝保存于_20°C備用。
[0048]2.2.重組腺病毒rAd-EBNAl的包裝
本部分研究采用真核表達(dá)系統(tǒng)，將B95-8標(biāo)準(zhǔn)株中的基因與腺病毒穿梭質(zhì)粒載體PDC316連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，與骨架質(zhì)粒pBHG共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝重組腺病毒，具體方法參考真核轉(zhuǎn)染試劑說明書。用FuGene HD將質(zhì)粒pDC316_EBNAl與pBHG共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，見圖3。具體方法為:按照4X 15細(xì)胞/孔的量接293細(xì)胞到六孔板中，每孔用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。次日細(xì)胞達(dá)到80°/Γ90%匯合度，按說明書將構(gòu)建好的骨架質(zhì)粒與穿梭質(zhì)粒按照1:3的比例加入100 uL的無抗生素DMEM中，渦旋混勻后靜置5 min，再加入6 μ LHD轉(zhuǎn)染試劑注意轉(zhuǎn)染試劑在液面下緩慢加入，吹打混勻f 2次，室溫靜置25 min。再將轉(zhuǎn)染混合物分散緩慢地滴加到待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞孔中，邊加邊搖晃，并做一陰性對(duì)照。將板子放于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中孵育7-14 d，注意每天觀察細(xì)胞的變化，看有無病變或者細(xì)菌污染的情況發(fā)生，培養(yǎng)基不足時(shí)注意補(bǔ)加，此時(shí)期是雙質(zhì)粒在293細(xì)胞內(nèi)重組成腺病毒的過程。
[0049]2.3.原代病毒的收獲及擴(kuò)增
大約7 d后，加入質(zhì)粒的細(xì)胞開始出現(xiàn)病變(CPE)，再觀察1-2 d，待細(xì)胞病變明顯時(shí)，開始收獲病毒。將細(xì)胞用I mL無菌Tip頭吹下,連同培養(yǎng)基一起移入15 mL Eppendorf管中，用洗液洗細(xì)胞兩次。注意細(xì)胞吹打后不能脫落要加入2 mL胰酶消化， 2 min后棄胰酶，輕敲培養(yǎng)瓶側(cè)壁使細(xì)胞脫落。在_80°C和37°C (水浴)反復(fù)凍融3次(使細(xì)胞破碎，釋放病毒)；3 000 rpm離心10 min,吸取上清，即為原代病毒,命名為rAd-EBNAl,于_80°C保存。取原代病毒2 mL再次感染T75培養(yǎng)瓶中的293細(xì)胞，37°C、5%的C02培養(yǎng)箱中孵育2h，后補(bǔ)加8 mL新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，代細(xì)胞完全病變后，收獲病毒，在-80°C和37°C (水浴)反復(fù)凍融3次，此為rAd-EBNAl第一代病毒，于-80°C保存。
[0050]2.4.rAd-EBNAl DNA和形態(tài)鑒定及滴度測(cè)定
PCR鑒定在200 UL病毒上清中加入20 μ L蛋白酶K(20 mg/mL)，56°C消化蛋白I h，煮沸10 min，使蛋白酶K失活，10 000 rpm離心5 min，除去蛋白，此為病毒DNA模板。PCR引物采用構(gòu)建PDC316-EBNA1的引物，反應(yīng)體系及程序同目的片段的獲取。取5 μ L PCR產(chǎn)物加上I μ L的6Χ加樣緩沖液，進(jìn)行110 V恒壓電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。形態(tài)觀察收集的病毒上清液，磷鎢酸負(fù)染后于電鏡下觀察重組腺病毒形態(tài)。
[0051]50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)方法測(cè)定rAd-EBNAl的滴度TCID50實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)是應(yīng)用極限稀釋法使293細(xì)胞出現(xiàn)病變從而估計(jì)滴度。本項(xiàng)檢測(cè)須做兩組重復(fù)試驗(yàn)，兩組試驗(yàn)可在同一天進(jìn)行，也可在不同天進(jìn)行。細(xì)胞的準(zhǔn)備:取用DMEM+5%FBS預(yù)培養(yǎng)的293細(xì)胞I個(gè)75 cm2方瓶，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%，收集細(xì)胞并用胰酶消化計(jì)數(shù)。用5%FBS的DMEM制備細(xì)胞懸液，每板需要10 mL濃度為I X 105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，后按每孔100 μ L (即I X 104個(gè)細(xì)胞)加入2個(gè)96孔板。
[0052]制備感染樣品:10-5開始連續(xù)8個(gè)稀釋梯度，稀釋液用5%FBS的DMEM。按表2_1接種樣品:各加100 μ L梯度稀釋好的樣品溶液，蓋上第I個(gè)板并在37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。同步驟操作感染第2板。從第3 d到第10 d觀察細(xì)胞狀況，第10 d分析、記錄CPE結(jié)果:CPE應(yīng)在10 d之間出現(xiàn)。第10 d在顯微鏡下觀察每孔CPE情況，并與陰性對(duì)照的一排對(duì)比，記錄每排樣品的陽性孔數(shù)。(如有一個(gè)板被污染，試驗(yàn)必須重做)
表1 TCID5tl法檢測(cè)重組腺病毒滴度

【權(quán)利要求】
1.一種攜帶EB核抗原I基因片段的重組腺病毒疫苗，其特征在于，所述重組腺病毒疫苗是由EB核抗原I基因片段插入到腺病毒載體構(gòu)建而成。
2.如權(quán)利要求1所述重組腺病毒疫苗，其特征在于，所述EB核抗原I基因片段編碼EB核抗原I的C端氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1-2任其一所述重組腺病毒疫苗，其特征在于，所述EB核抗原I基因片段的核苷酸序列為939bp。
4.如權(quán)利要求1-3任其一所述重組腺病毒疫苗，其特征在于，所述EB核抗原I基因片段的核苷酸序列如序列I所示。
5.如權(quán)利要求1-4任其一所述重組腺病毒疫苗，其特征在于，所述腺病毒載體為復(fù)制缺陷型。
6.如權(quán)利要求5所述重組腺病毒疫苗，其特征在于，所述腺病毒載體是利用Admax系統(tǒng)構(gòu)建。
7.權(quán)利要求1-6所述的重組腺病毒疫苗在制備治療或預(yù)防EBV相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用；所述EBV相關(guān)疾病優(yōu)選鼻咽癌。
8.一種組合物，其中含有權(quán)利要求1-6任其一所述的重組腺病毒疫苗和一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體、佐劑和/或賦形劑。
9.一種活化的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，該細(xì)胞是利用權(quán)利要求1-6任其一所述的重組腺病毒疫苗刺激細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞使其活化得到的。
10.權(quán)利要求9所述的活化的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在制備用于過繼性治療藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N7/01GK104162153SQ201410285165
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】曾毅, 杜海軍, 仝艷艷, 周玲, 王湛, 張麗霞 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所