Beclin1蛋白乙酰化和突變的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生理學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了Beclin1乙?；膽?yīng)用。用去乙?；敢种苿┛梢允笲eclin1發(fā)生乙酰化，從而增加Beclin1的表達(dá)量，提高自噬水平。采用點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)Beclin1K416位點(diǎn)進(jìn)行了負(fù)義突變，構(gòu)建K416R突變型質(zhì)粒。將該突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，其乙?；接胁糠纸档?，但依然存在較明顯的乙酰化條帶。即使如此，Beclin1的表達(dá)及LC3的表達(dá)顯著降低，從而抑制了自噬的發(fā)生。
【專利說明】Beclinl蛋白乙?；屯蛔兊膽?yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生理學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體為Beclinl乙?；膽?yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)翻譯后修飾十分重要，通過亞基的加減改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，從而影響 其功能和相互作用，甚至影響蛋白質(zhì)本身的穩(wěn)定性。常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括磷酸化、 泛素化、乙?；⑻腔鹊?，這些修飾決定著一些重要蛋白的活性，在多數(shù)生理代謝通路 中起著分子開關(guān)的作用。乙?；侵冈诘鞍踪|(zhì)翻譯完成后，通過乙?；D(zhuǎn)移酶在蛋白質(zhì)N 端殘基上增加乙?；男揎?。乙?；诘鞍踪|(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性中起著重要的作用。組 蛋白、p53、tubulin等蛋白均存在乙醜化狀態(tài)，在其乙醜化狀態(tài)，染色質(zhì)蛋白和代謝相關(guān)酶 高度集中，提示乙?；揎棇?duì)基因表達(dá)和代謝具有相當(dāng)大的作用。在細(xì)菌中，和中心代謝有 關(guān)的蛋白質(zhì)90%以上是被乙?；模崾疽阴；揎椀姆秶謴V泛。乙?；揎椧话惆l(fā) 生在賴氨酸（K)，而在電荷狀態(tài)上來看，精氨酸（R)和去乙?；陌被嵯嗨?，因此，常用賴 氨酸一精氨酸突變（KR突變）來模擬去乙?；癄顟B(tài)。通常情況下，乙酰化反應(yīng)和去乙?；?反應(yīng)是由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT)和去乙?；福℉DAC)催化的，雖然HAT和HDAC被稱為 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；?，但實(shí)際上他們也可以對(duì)非組蛋白進(jìn)行乙酰化和去 乙?；男揎?。
[0003] 自噬（Autophagy)是存在于真核生物中的普遍生命現(xiàn)象，是機(jī)體適應(yīng)外界環(huán)境改 變、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要途徑?；A(chǔ)研究表明，自噬有可能和糖尿病、肥胖等內(nèi)分泌代謝 疾病之間存在聯(lián)系。作為自噬相關(guān)基因之一，Beclinl在自噬的發(fā)生中扮演著重要的角色， 廣泛參與組織細(xì)胞的生理代謝過程。
[0004] 盡管Beclinl在自噬中的作用至關(guān)重要，其翻譯后修飾也在近年來備受關(guān)注，但 截至目前，關(guān)于Beclinl翻譯后修飾的研究并不多。相對(duì)來講研究最多的是Beclinl的 憐酸化修飾，有報(bào)道稱死亡相關(guān)蛋白death-associatedproteinkinase(DAPK)可憐酸化 Beclinl蛋白BH3域中的Thrll9位點(diǎn)，促使Beclinl與BCL2/BCL-XL解離，游離狀態(tài)的 Beclinl增多，自噬過程激活。
[0005] 除了磷酸化，Beclinl的泛素化也被確定報(bào)道過。Beclinl的泛素化修飾是通過 泛素K63標(biāo)記的，TRAF6是Beclinl的泛素化修飾酶并鑒定出2個(gè)Beclinl的TRAF結(jié)合 結(jié)構(gòu)域，位于Beclinl蛋白BH3結(jié)構(gòu)域中的K117位點(diǎn)是K63的主要泛素化結(jié)合位點(diǎn)，即是 Beclinl最主要的泛素化位點(diǎn)。在巨噬細(xì)胞給予炎癥因子刺激或氨基酸剝奪，可通過TRAF6 介導(dǎo)促使Beclinl泛素化，而后與Bcl-2解離，激活自噬途徑，而去泛素化酶A20可有效拮 抗TRAF6的自噬激活作用。抑制泛素特異性肽酶USP10和USP13對(duì)Beclinl的去泛素化作 用，可以促使Beclinl和Vps34復(fù)合物降解，從而抑制自噬發(fā)生。
[0006] 從現(xiàn)有報(bào)道看，Beclinl存在磷酸化和泛素化修飾，且這兩種修飾均直接影響了 Beclinl介導(dǎo)的自噬過程。然而，Beclinl是否可以被乙?；胁磺宄?。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在用乙?；{(diào)控Beclinl蛋白的表達(dá)，以及調(diào)控Beclinl蛋白所介導(dǎo)的 自噬。
[0008] 用去乙酰化酶抑制劑可以使Beclinl發(fā)生乙?；?，從而增加 Beclinl的表達(dá)量，提 高自噬水平。
[0009] BeclinlK416位點(diǎn)可以被乙?；母怕史浅Ｖ?，采用點(diǎn)突變技術(shù)對(duì) BeclinlK416位點(diǎn)進(jìn)行了負(fù)義突變，即由賴氨酸突變?yōu)榫彼幔↘R突變），從而構(gòu)建了 K416R 突變型質(zhì)粒。將該突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，其乙?；接胁糠纸档?，但依然存在較 明顯的乙?；瘲l帶。即使如此，Beclinl的表達(dá)及LC3的表達(dá)顯著降低，從而抑制了自噬的 發(fā)生。
[0010] 本發(fā)明確定了 Beclinl可以被乙?；?。結(jié)果顯示，ACE-Beclinl處條帶明顯存在， 且隨著去乙?；敢种苿㎞AM+TSA(NT)的作用時(shí)間延長(zhǎng)不斷加深，約在6小時(shí)處條帶最為 明顯。由此，Beclinl存在乙酰化狀態(tài)，可以被乙?；?。
[0011] Beclinl主要包括BH3、CC、ECD這3個(gè)結(jié)構(gòu)域。BH3結(jié)構(gòu)域包含105-125氨基酸 位點(diǎn)，是Beclinl和BCL2/BCL-XL家族結(jié)合的主要部位，通過與這些抗凋亡抗自噬蛋白的 結(jié)合調(diào)節(jié)自噬和凋亡過程的發(fā)生。CC結(jié)構(gòu)域參與了 Beclinl與UVRAG、ATG14/Barkor等形 成二聚體，這些復(fù)合物在自噬的發(fā)生中起著重要的作用。E⑶占據(jù)了 BeclinlC端約一半的 氨基酸，該結(jié)構(gòu)域和目前已知的所有其他蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域均不具有同源性，但幾乎參與了 Beclinl所有的功能，因此E⑶機(jī)構(gòu)可能是破譯Beclinl新功能的一個(gè)突破口。狹義的EOT 結(jié)構(gòu)域包含244-337氨基酸位點(diǎn)，而廣義的E⑶結(jié)構(gòu)域則包括整個(gè)1/2的BeclinlC端氨基 酸。按照后者的定義，本發(fā)明涉及的K416位點(diǎn)即位于Beclinl的ECD結(jié)構(gòu)域，有可能承擔(dān) 著新的功能。K416R突變雖然并未完全阻斷Beclinl的乙?；?，但卻對(duì)Beclinl的蛋白量和 自噬的發(fā)生產(chǎn)生了較大的影響。和野生型（WT)的Beclinl相比，K416R突變的Beclinl蛋 白表達(dá)顯著下降。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為去乙酰化酶抑制劑NT作用下Beclinl的乙?；瘯r(shí)效
[0013] 圖2為K416R突變對(duì)Beclinl乙酰化的影響
[0014] 圖3為293T細(xì)胞未轉(zhuǎn)染（C0N)、轉(zhuǎn)染野生型（WT)和突變型（K416R)Beclinl質(zhì)粒 后Beclinl的蛋白表達(dá)情況
[0015] 圖4為用防線菌酮（CHX)作用后觀察到的Beclinl的蛋白降解
[0016] 圖5為轉(zhuǎn)染K416RBeclinl質(zhì)粒的細(xì)胞LC3的表達(dá)變化
[0017] 圖 6 為 P300/PCAF/SIRT1-7 對(duì) Beclinl 蛋白量的影響

【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)施例1
[0019] 因?yàn)锽eclinl的乙酰化尚未有明確報(bào)道，因此Beclinl也不存在商業(yè)化的乙?；?抗體。我們采用IP的方法檢測(cè)Beclinl的乙?；Ｓ萌ヒ阴；敢种苿㎞T (NAM+TSA)作用 293T細(xì)胞，我們觀察到了 Beclinl的乙酰化，隨著NT的作用時(shí)間延長(zhǎng)至6個(gè)小時(shí)，Beclinl 的乙?；揭苍诓粩嘣黾印T作用下Beclinl的乙?；瘯r(shí)效如圖1。
[0020] Beclinl的表達(dá)量明顯上調(diào)，提示可能是Beclinl的乙酰化影響了其蛋白本身的 穩(wěn)定性。
[0021] 實(shí)施例2
[0022] 在采用去乙酰化酶抑制劑隱11煙酰胺和了54曲古抑菌素4(階')作用2931'細(xì)胞后， Beclinl的表達(dá)量明顯上調(diào)，提示可能是Beclinl的乙?；绊懥似涞鞍妆旧淼姆€(wěn)定性。通 過免疫沉淀（IP)的方法進(jìn)一步確定Beclinl的乙?；癄顟B(tài)，并通過KR點(diǎn)突變的方法研究 其乙?；稽c(diǎn)。
[0023] 采用由北京大學(xué)創(chuàng)辦的ASEB乙?；稽c(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)Beclinl的乙?；稽c(diǎn)進(jìn)行 預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，BeclinlK416位點(diǎn)可以被乙?；母怕史浅Ｖ?。因此，我們采用點(diǎn) 突變技術(shù)對(duì)BeclinlK416位點(diǎn)進(jìn)行了負(fù)義突變，即由賴氨酸突變?yōu)榫彼幔↘R突變），從而 構(gòu)建了 K416R突變型質(zhì)粒。將該突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后使用IP技術(shù)檢測(cè)其乙酰化水 平，發(fā)現(xiàn)和野生型（WT)質(zhì)粒相比，K416R突變型質(zhì)粒的乙?；接胁糠纸档停廊淮嬖?較明顯的乙?；瘲l帶，這說明K416R可能是Beclinl的乙?；稽c(diǎn)之一，但不一定是其最主 要的乙?；稽c(diǎn)。
[0024] 盡管K416并未完全阻斷Belicnl的乙酰化，不過，產(chǎn)生很有趣的現(xiàn)象，K416R突變 型質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞后，可檢測(cè)到的Beclinl的表達(dá)及LC3的表達(dá)顯著降低，如圖2,即該 位點(diǎn)的突變可能影響了 Beclinl的穩(wěn)定性，從而進(jìn)一步影響到了自噬的發(fā)生。圖3所示為 293T細(xì)胞未轉(zhuǎn)染（C0N)、轉(zhuǎn)染野生型（WT)和突變型（K416R)Beclinl質(zhì)粒后Beclinl的蛋 白表達(dá)情況，可見6小時(shí)K416RBeclinl的表達(dá)即明顯低于WTBeclinl，而在8小時(shí)低得更為 明顯。
[0025] 圖4為用防線菌酮（CHX)作用后觀察到的Beclinl的蛋白降解，可見 K416RBeclinl的半衰期明顯低于WTBeclinl。圖5可見在轉(zhuǎn)染K416RBeclinl質(zhì)粒的細(xì)胞 中，與野生型（WT)相比，LC3的表達(dá)明顯降低，自噬過程受到抑制。
[0026] 實(shí)施例3
[0027] SIRTUIN家族是一類去乙?；?，目前發(fā)現(xiàn)的主要包括SIRT1-7。P300和PCAF是 常見的乙酰化酶。我們?cè)?93T細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT1-7、P300、PCAF后，通過WesternBlot檢測(cè) Beclinl的蛋白量，以觀察其是否對(duì)Beclinl的表達(dá)量產(chǎn)生影響。初步的結(jié)果顯示，P300和 PCAF轉(zhuǎn)染后，未觀察到Beclinl的明顯變化，而SIRT6轉(zhuǎn)染后，Beclinl的表達(dá)量明顯降低， 其他SIRTUIN家族成員對(duì)Beclinl的表達(dá)量沒有影響。
[0028] 圖6顯示，多次轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)各個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后相應(yīng)蛋白的表達(dá)量并不一致，這可能 和不同質(zhì)粒的純度、目的片段的大小等有關(guān)，有可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。可見去乙酰 化酶，尤其是SIRT6,能夠影響B(tài)eclinl的乙?；瑥亩种谱允?。
[0029] 本發(fā)明先采用IP的方法確定了 Beclinl是否可以被乙?；＝Y(jié)果顯示， ACE-Beclinl處條帶明顯存在，且隨著去乙酰化酶抑制劑NAM+TSA(NT)的作用時(shí)間延長(zhǎng)不 斷加深，約在6小時(shí)處條帶最為明顯。由此，Beclinl存在乙?；癄顟B(tài)，可以被乙?；?。確定 Beclinl可以被乙酰化后，我們繼而尋找Beclinl的乙酰化位點(diǎn)。乙?；稽c(diǎn)的預(yù)測(cè)有多種 方法，LC/LC-MS/MS質(zhì)譜分析是比較常用的方法，但花費(fèi)較高，實(shí)際操作有一定的難度。使 用軟件或網(wǎng)站預(yù)測(cè)比較簡(jiǎn)單易行，但是假陽(yáng)性率較高。在位點(diǎn)突變后進(jìn)一步進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)分 析，才能確定該位點(diǎn)是否為乙?；稽c(diǎn)。在預(yù)測(cè)Beclinl的乙?；稽c(diǎn)時(shí)，采用了北京大學(xué) 團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建的ASEB網(wǎng)站，預(yù)測(cè)到BeclinlK416位點(diǎn)被乙?；母怕瘦^高，于是采用定點(diǎn)點(diǎn)突 變的方法對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行了 KR負(fù)義突變，試圖模擬Beclinl的去乙?；癄顟B(tài)。結(jié)果顯示，該位 點(diǎn)突變后Beclinl的乙?；癄顟B(tài)略有降低，但不十分明顯，說明該位點(diǎn)可能參與了 Beclinl 的乙?；揎?，但不是主要位點(diǎn)。盡管如此，該位點(diǎn)突變可使Beclinl蛋白表達(dá)顯著下降。
【權(quán)利要求】
1. Beclinl蛋白的乙?；糜谝种谱允?。 2. Beclinl蛋白的K416R位點(diǎn)突變用于抑制自噬。 3. SIRT6乙?；赣糜谝种艬eclinl蛋白介導(dǎo)的自噬。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104120108SQ201410286505
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】寧光, 呂鵬飛, 楊穎 , 楊鍵, 張志國(guó) 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院