組蛋白去乙?；敢种苿┰谥苽溲涝葱愿杉?xì)胞的成骨分化制劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種組蛋白去乙?；敢种苿┰谥苽溲涝葱愿杉?xì)胞的成骨分化制劑中的應(yīng)用，本發(fā)明對于組蛋白去乙酰化酶抑制劑改變間充質(zhì)干細(xì)胞的乙?；?，應(yīng)用于藥物改變細(xì)胞表觀遺傳學(xué)治療牙周炎及種植體周圍炎等疾病，促進(jìn)骨組織再生有十分重要和深遠(yuǎn)的意義。本發(fā)明提供的兩種組蛋白去乙酰化酶抑制劑能夠促進(jìn)牙周炎、骨組織缺損、種植體周圍炎患者骨組織的再生，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)的治療方法如牙周引導(dǎo)組織再生術(shù)(Guide?Tissue?Regeration,GTR)、牙齒根尖周搔刮術(shù)、骨替代品應(yīng)用、牽張成骨術(shù)等骨組織再生的不足。
【專利說明】組蛋白去乙酰化酶抑制劑在制備牙源性干細(xì)胞的成骨分化 制劑中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于牙科制劑領(lǐng)域，涉及一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑在制備牙源性干細(xì) 胞的成骨分化制劑中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 牙周炎是一種常見而且多發(fā)的牙周組織慢性感染性疾病，是造成成年人牙齒缺失 的主要原因。雖然對牙周病病因的研究在不斷深入，但是牙周炎的發(fā)病機(jī)制仍未完全解決， 目前認(rèn)為菌斑微生物和宿主的免疫炎癥反應(yīng)是主要原因。通過機(jī)械清除牙菌斑等牙周基礎(chǔ) 治療是目前治療牙周炎的主要措施，機(jī)械治療可以有效控制牙周炎癥，但是單純應(yīng)用不能 取得明顯組織再生療效。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells, MSC)是具有自我更新， 克隆形成和多向分化潛能的早期未分化細(xì)胞?？谇活M面部中存在著大量的間充質(zhì)干細(xì)胞， 如牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓、根尖牙乳頭等干細(xì)胞，可多向分化，促進(jìn)成骨。在牙周炎、種植 體周圍炎等炎癥微環(huán)境下，牙齦組織和牙周膜中是否存在干細(xì)胞，其功能是否發(fā)生改變，這 些問題都尚不清楚。
[0003] 表觀遺傳學(xué)（印igenetics)是不涉及DNA序列改變的可遺傳的基因表達(dá)變化的研 究。在其諸多的形式中，以組蛋白的共價修飾占有重要地位，其與基因的表達(dá)及調(diào)控密切 相關(guān)聯(lián)，包括磷酸化、乙?；⒓谆?、泛素化修飾等。其中組蛋白乙?；叭ヒ阴；揎?是最重要的方式，是基因表達(dá)調(diào)控最主要的驅(qū)動力，此可逆的動態(tài)修飾由組蛋白乙?；D(zhuǎn) 移酶（histone acetyltransferases，HAT)和組蛋白去乙醜化酶（histone deacetylases, HDAC)共同催化，共同控制染色質(zhì)各區(qū)域中核心組蛋白的乙?；潭?。
[0004] 組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、分化和抑制增殖的活性， 目前其研究涉及眾多腫瘤領(lǐng)域，包括血液系統(tǒng)腫瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、前列腺 癌、肺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌等，其并對腫瘤細(xì)胞具有高選擇性和低毒的優(yōu)點(diǎn)具有非常廣闊的 應(yīng)用前景。HDACi通過在轉(zhuǎn)錄后修飾組蛋白來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)裝配，從而成為了某些 疾病治療的新靶點(diǎn)。雖然HDACi介導(dǎo)免疫反應(yīng)的潛在分子機(jī)制有待于進(jìn)一步探索，但是其 強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)活性為治療炎癥免疫性疾病帶來了希望。HDACi也被證明能夠誘導(dǎo)細(xì)胞 終末分化，體外研究已經(jīng)證實(shí)多種HDACi能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞或前體細(xì)胞骨向或神經(jīng)向分化。
[0005] 因此，本研究通過使用組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA及LBH589,促進(jìn)炎癥及正常 間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，利于組織再生，對牙周炎造成的骨組織缺損以及種植體周圍炎 的骨組織修復(fù)有一定作用，利于臨床應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種組蛋白去乙?；敢种苿┰谥苽溲涝葱愿杉?xì)胞的成 骨分化制劑中的應(yīng)用，提供的組蛋白去乙?；敢种苿┠軌蛟鰪?qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化 能力，所述的組蛋白去乙?；敢种苿榍乓志鼗蚺帘人舅?。
[0007] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：
[0008] -種組蛋白去乙?；敢种苿┰谥苽溲涝葱愿杉?xì)胞的成骨分化制劑中的應(yīng)用，所 述組蛋白去乙?；敢种苿榍乓志?A或帕比司他。
[0009] 而且，所述牙源性干細(xì)胞為牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞或根尖牙乳頭干細(xì)胞。
[0010] 而且，所述曲古抑菌素 A的濃度為ΙΟΟηΜ。
[0011] 而且，所述帕比司他的濃度為20nM、50nM或ΙΟΟηΜ。
[0012] 一種組蛋白去乙?；敢种苿┐龠M(jìn)牙源性干細(xì)胞的成骨分化的方法，步驟如下
[0013] 取第三代的正常和炎癥牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞，以2X 103/cm2的密度接種于6孔板，待 細(xì)胞融合達(dá)80%后，更換培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)液，加入TSA使終濃度為ΙΟΟηΜ，對照組加入等 量DMS0, 2天換液一次，每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及礦化結(jié)節(jié)形成情況。
[0014] 一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑促進(jìn)牙源性干細(xì)胞的成骨分化的方法，步驟如下
[0015] 將生長狀況良好的純化的第三代根尖牙乳頭干細(xì)胞以2X103/cm2的密度接種于 6孔板，待細(xì)胞融合達(dá)80%后，更換培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)液，加如梯度濃度為為20nM、50nM或 100nM的帕比司他，2天換液一次，每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及礦化結(jié)節(jié)形成情況。
[0016] 一種制備促進(jìn)牙源性干細(xì)胞成分分化TSA殼聚糖緩釋藥物的方法，包括如下步 驟：
[0017] ⑴殼聚糖溫敏體系的制備：稱取2g殼聚糖粉末溶解在100mL濃度1 %醋酸溶 液中，配制成2%殼聚糖溶液，移取一定體積的2%殼聚糖溶液于試管中，按比例逐滴加入 58% β -甘油磷酸鈉溶液，振蕩混勻后，以少量NaOH稀溶液調(diào)節(jié)混合液的pH = 5 ;
[0018] (2)了54的01^0溶液制備：稱取了54粉末0.111^溶解于11^01^0中，配制成10(^ 8/ L溶液；
[0019] ⑶TSA殼聚糖緩釋系統(tǒng)制備：將100 μ g/L的TSA DMS0溶液溶液加入殼聚糖溫敏 體系中，攪拌均勻，最終達(dá)到10 μ g/L濃度，常溫保存。
[0020] 本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是：
[0021] 1、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志?(Trichostatin A, TSA)或帕比司他（Panobinostat，LBH589)能夠促進(jìn)正?；蜓装Y狀態(tài)下 的間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力。
[0022] 2、本發(fā)明提供的兩種組蛋白去乙?；敢种苿┠軌虼龠M(jìn)牙周炎、骨組織缺損、 種植體周圍炎患者骨組織的再生，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)的治療方法如牙周引導(dǎo)組織再生術(shù)（Guide Tissue Regeration，GTR)、牙齒根尖周搔刮術(shù)、骨替代品應(yīng)用、牽張成骨術(shù)等骨組織再生的 不足。
[0023] 3、本發(fā)明從堿磷酶及茜素紅染色水平，發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；敢种苿┐龠M(jìn)炎癥及 健康狀態(tài)下的間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化；從基因水平檢測證明，間充質(zhì)干細(xì)胞成骨相關(guān)基 因0CN和RUNX2表達(dá)增高。表觀遺傳學(xué)中證明，炎癥牙周炎患者牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞中組蛋 白去乙?；窰DAC1、3、6的表達(dá)增高，加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑后發(fā)現(xiàn)炎癥狀態(tài)下的 HDAC1、3、6表達(dá)有所下降，可能與成骨相關(guān)基因的表達(dá)增加相關(guān)，通過建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周 炎動物模型，通過牙齦局部注曲古抑菌素 A (TSA)殼聚糖緩釋藥物，觀測組織學(xué)、影像學(xué)及 臨床指標(biāo)檢測，證實(shí)了曲古抑菌素 A殼聚糖藥物緩釋系統(tǒng)對大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎炎癥反應(yīng)和 牙周骨組織再生的治療作用，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和說明見實(shí)施例部分。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為成骨誘導(dǎo)下，正常及炎癥狀態(tài)下的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞在TSA作用下的堿性 磷酸酶染色及堿性磷酸酶活性檢測；圖1-1為GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下的堿性磷酸 酶染色，其中圖 1-1A、圖 1-1B、圖 1-1C 為 GMSC-H，圖 1-1D、圖 1-1E、圖 1-1F 為 GMSC-I,圖 1-1A與圖1-1D為空白組，圖1-1B與圖1-1E為加入成骨誘導(dǎo)液和DMS0,圖1-1C與圖1-1F 為加入成骨誘導(dǎo)液和TSA。
[0025] 圖1-2為GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下鏡下堿性磷酸酶染色，其中圖1-2A、圖 1- 2B、圖 1-2C 為 GMSC-H，圖 1-2D、圖 1-2E、圖 1-2F 為 GMSC-I,圖 1-2A 與圖 1-2D 為空白組， 圖1-2B與圖1-2E為加入成骨誘導(dǎo)液和DMS0,圖1-2C與圖1-2F為加入成骨誘導(dǎo)液和TSA。
[0026] 圖1-3GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下堿性磷酸酶活性檢測。
[0027] 圖2為成骨誘導(dǎo)下，正常及炎癥狀態(tài)下的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞在TSA作用下的茜素 紅染色及礦化結(jié)節(jié)的定量分析；
[0028] 圖2-1為GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下茜素紅染色，其中圖2-1A、圖2-1B、圖 2- 1C 為 GMSC-H，圖 2-1D、圖 2-1E、圖 2-1F 為 GMSC-I,圖 2-1A 與圖 2-1D 為空白，圖 2-1B 與 圖2-1E為加入成骨誘導(dǎo)液和DMS0,圖2-1C與圖2-1F為加入成骨誘導(dǎo)液和TSA。
[0029] 圖2-2為GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下鏡下茜素紅染色，其中圖2-2A、圖2-2B、 圖 2-2C 為 GMSC-H，圖 2-2D、圖 2-2E、圖 2-2F 為 GMSC-I,圖 2-2A 與圖 2-2D 為空白，圖 2-2B 與圖2-2E為加入成骨誘導(dǎo)液和DMS0,圖2-2C與圖2-2F為加入成骨誘導(dǎo)液和TSA。
[0030] 圖2-3為GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下成骨礦化結(jié)節(jié)的定量分析。
[0031] 圖3為正常及炎癥狀態(tài)下的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞在TSA作用下0CN和RUNX2的表達(dá) 升1? ;
[0032] 圖3-1為RT-PCR檢測GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下0CN和RUNX2的表達(dá)；
[0033] 圖3-2為GMSC-H和GMSC-I在TSA作用下0CN和RUNX2的相對灰度值分析；
[0034] 圖4為成骨誘導(dǎo)下，不同濃度的LBH589對根尖乳頭干細(xì)胞的堿磷酶染色；
[0035] 圖5為成骨誘導(dǎo)下，不同濃度的LBH589對根尖乳頭干細(xì)胞的茜素紅染色及鈣離子 濃度分析
[0036] 圖5-1為不同濃度的LBH589對根尖乳頭干細(xì)胞的茜素紅染色；
[0037] 圖5-2為不同濃度的LBH589對根尖乳頭干細(xì)胞作用下鈣離子濃度分析；
[0038] 上述附圖4、5說明附圖涉及字母A、B、C、D、E、F的分別表示如下含義：空白組（A)， 加入成骨誘導(dǎo)液（B)、成骨誘導(dǎo)液加入DMSO(C)、成骨誘導(dǎo)液加入LBH589 20nM(D)、成骨誘 導(dǎo)液加入LBH589 50nM(E)、成骨誘導(dǎo)液加入LBH589100nM(F)。
[0039] 圖6為大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎動物模型的建立；
[0040] 圖7為應(yīng)用TSA殼聚糖緩釋系統(tǒng)后，牙周炎大鼠牙周骨喪失（PBL)的狀況及統(tǒng)計 學(xué)分析；
[0041] 圖7-1為應(yīng)用TSA殼聚糖緩釋系統(tǒng)后，牙周炎大鼠牙周骨喪失（PBL)的狀況，其中 從左到右依次為A空白組，B鹽水組，C殼聚糖組，DTSA組；
[0042] 圖7-2為應(yīng)用TSA殼聚糖緩釋系統(tǒng)后，牙周炎大鼠牙周骨喪失（PBL)的狀況的統(tǒng) 計分析；
[0043] 圖8為應(yīng)用TSA殼聚糖緩釋系統(tǒng)后，牙周炎大鼠牙周袋深度的狀況；
[0044] 圖9為應(yīng)用TSA殼聚糖緩釋系統(tǒng)后，各組大鼠上頜骨做MicroCT掃描后，牙周炎大 鼠牙周骨支持率（PBS)的狀況；
[0045] 圖9-1為牙周骨支持率PBS測量示意圖，在X線片上先取各點(diǎn)，A為根尖點(diǎn)，C為牙 尖高點(diǎn)，B為AC連線與牙槽嵴頂線的交點(diǎn)。PBS = AB/ACX 100% ;
[0046] 圖9-2為各組大鼠牙槽骨（PBS)MicroCT圖像，其中A空白組，B鹽水組，C殼聚糖 組，D TSA組；
[0047] 圖9-3為各組大鼠牙槽骨PBS值的統(tǒng)計分析，其中A空白組，B鹽水組，C殼聚糖 組，D TSA組。
[0048] 上述【專利附圖】

【附圖說明】附圖涉及字母A、B、C、D、E、F的分別表示如下含義：空白組（A)，加 入成骨誘導(dǎo)液（B)、成骨誘導(dǎo)液加入DMSO(C)、成骨誘導(dǎo)液加入LBH58920nM(D)、成骨誘導(dǎo)液 加入 LBH589 50nM(E)、成骨誘導(dǎo)液加入 LBH589 100nM(F)。

【具體實(shí)施方式】
[0049] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0050] 本【具體實(shí)施方式】中所使用的健康及炎癥牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞和根尖乳頭干細(xì)胞，均 來自天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院門診病人的組織所獲得，并均獲得患者的同意，符合口腔治療 程序和倫理委員會要求。健康牙齦組織取自20-55歲牙周健康患者，探診深度（PD) < 3mm， 無附著喪失，無牙齦出血及紅腫，無系統(tǒng)性疾病，不吸煙需要拔除第三磨牙或做冠延長手術(shù) 者；炎癥牙齦組織選擇20-55歲慢性牙周炎患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①探診深度（PD)> = 5mm，臨床 附著水平（CAL)彡5mm，X線片顯示牙槽骨吸收至少至根長的1/2;②牙齒松動> = ΙΓ，需 要拔除患牙并需要牙齦修整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①藥物、妊娠等導(dǎo)致的牙齦增生；②患有糖尿病等 系統(tǒng)性疾??；③吸煙者。根尖牙乳頭干細(xì)胞來自于根尖未閉合正畸牙的根尖牙乳頭，對以上 組織進(jìn)行分離、培養(yǎng)、純化獲得。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測牙齦組織及根尖乳頭細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記 物，證明具有干細(xì)胞的特性。
[0051] 一、實(shí)施健康和炎癥牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞以及根尖牙乳頭干細(xì)胞的制備
[0052] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0053] 炎癥和健康的牙齦組織以及根尖乳頭組織通過上述途徑獲，并通過以下培養(yǎng)方法 獲取干細(xì)胞：將患者的牙齦或或拔出的正畸牙放入無菌裝有預(yù)冷PBS的離心管，4小時內(nèi) 于無菌超凈工作臺中將牙齦組織或帶有根尖牙乳頭組織的牙齒取出，并用無菌刀片切取根 尖牙乳頭組織，在含濃度梯度雙抗的無菌PBS反復(fù)沖洗牙齦組織。于預(yù)加不完全培養(yǎng)液的 無菌玻璃培養(yǎng)皿中用眼科剪剪碎牙銀至1. 0_Χ 1. 0_Χ 1. 0mm的小塊，收集于無菌離心管 中，加入3mg/ml I型膠原酶和4mg/ml II型dispase酶各lml (相當(dāng)于牙銀組織體積的10 倍以上），混合均勻置于37°C恒溫水浴箱中消化40?60分鐘，每隔5-10分鐘搖晃一次，直 至牙齦組織變?yōu)樯⒃诘男鯛?，用含?0%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。經(jīng)l〇〇〇r/min 離心10min，棄掉上清，加入DMEM培養(yǎng)基吹打并且混合均勻，使用70 μ m篩孔內(nèi)徑的細(xì)胞篩 過濾，獲得單細(xì)胞懸液。血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，以IX l〇5/ml的密度接種于25cm2的培 養(yǎng)瓶中，加入含20% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液3ml，在37°C、5% C02、飽和濕度孵箱標(biāo)準(zhǔn)條件 下培養(yǎng)。3天后半量換液，之后每2-3天換液一次，逐日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀 況，當(dāng)細(xì)胞生長至80%匯合狀態(tài)下，用0. 25%胰蛋白酶按1:2消化傳代。
[0054] 2、組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA和LBH589的濃度確定
[0055] 首先，通過MTT方法確定TSA和LBH589的濃度。收集對數(shù)期健康的牙齦間充質(zhì) 干細(xì)胞或根尖牙乳頭干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于96孔板，每孔100 μ 1，8000個/孔。 置37°C、5% C02溫箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)12小時。加入濃度為0、20、50、100、200、400ηΜ 的TSA或濃度為0、10、20、50、100、200、500ηΜ的LBH589,繼續(xù)培養(yǎng)48h，每組設(shè)定3個復(fù)孔。 小心吸去上清，加入90 μ 1新鮮培養(yǎng)液，再加入lOulMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸去上清，每 孔加入llOul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀 測量各孔490nm的吸光度值（0D)。我們選取了最佳的濃度TSA(lOOnM)和LBH589(20、50、 100nM)。
[0056] 3、炎癥和健康的間充質(zhì)干細(xì)胞在組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA作用下的ALP染色 及堿磷酶活性檢測
[0057] 將生長狀況良好的純化的第三代GMSC-H和GMSC-I以2 X 103/cm2的密度接種于6 孔板，待細(xì)胞融合達(dá)80%后，更換培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)液。實(shí)驗(yàn)組加入TSA使終濃度為ΙΟΟηΜ， 對照組加入等量DMS0。2天換液一次，每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及礦化結(jié)節(jié)形成情 況。7d后行堿性磷酸酶染色及堿性磷酸酶活性檢測，如圖1所示，加入了 TSA后，發(fā)現(xiàn)健康 和炎癥的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的ALP染色和ALP活性提高，說明其成骨能力增強(qiáng)。
[0058] 4、炎癥和健康的間充質(zhì)干細(xì)胞在組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA作用下的茜素紅 染色和礦化結(jié)節(jié)分析
[0059] 將生長狀況良好的純化的第三代GMSC-H和GMSC-I以2 X 103/cm2的密度接種于6 孔板，待細(xì)胞融合達(dá)80%后，更換培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)液。實(shí)驗(yàn)組加入TSA使終濃度為ΙΟΟηΜ， 對照組加入等量DMS0。2天換液一次，每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及礦化結(jié)節(jié)形成情 況，28天后行茜素紅染色并進(jìn)行定量分析。如圖2所示，加入了 TSA后，發(fā)現(xiàn)健康和炎癥的 牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的茜素紅染色及礦化鈣結(jié)節(jié)增多，說明其成骨能力增強(qiáng)。
[0060] 5、RT-PCR檢測TSA作用下的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨相關(guān)基因 CON、RUNX2的表 達(dá)
[0061] 將生長狀況良好的純化的第三代GMSC-H和GMSC-I以2X 103/cm2的密度接種于6 孔板，待細(xì)胞融合達(dá)80%后，更換培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)液。實(shí)驗(yàn)組加入TSA使終濃度為ΙΟΟηΜ， 對照組加入等量DMS0。2天換液一次，每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及礦化結(jié)節(jié)形成情 況，21天后裂解細(xì)胞進(jìn)行0CN和RUNX2表達(dá)的檢測；如圖3所示，加入了 TSA后，發(fā)現(xiàn)健康 和炎癥的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨基因0CN和RUNX2提高。
[0062] 本研究所用引物：
[0063] GAPDH 上游 5, -GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3，
[0064] 下游 5, -AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3'
[0065] 產(chǎn)物長度413bp
[0066] RUNX-2 上游 5, -ACCAGATGGGACTGTGGTTACT-3'
[0067] 下游 5, -GGATTAAAAGGACTTGGTGCAG-3'
[0068] 產(chǎn)物長度393bp
[0069] 0CN 上游 5, -CATGAGAGCCCTCACA-3'
[0070] 下游 5, -AGAGCGACACCCTAGAC-3'
[0071] 產(chǎn)物長度283bp
[0072] 提取經(jīng)過TSA藥物處理過的健康和炎癥的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞總RNA，合成第一鏈 cDNA。取(λ 5mlPCR管，依次加入下列試劑：
[0073] cDXA 2 μ 1 Forward Primer (10 μ VI) 1 p 1 Reverse Primer (10 μ M) 1 μ 1 2 X TransTaq1'-] li Fi PCR Supcril i x 11 12, 5 μ 1 ddliO to 2δ μ I
[0074] PCR循環(huán)反應(yīng)條件 預(yù)變性 94°C δ min 變性 9^0 SOisec 退火 58°C 30 sec 35 cycles
[0075] GAPDH 的擴(kuò)增： J 延仲 72 °C 1 min 終未延伸 72Γ 10 min r增產(chǎn)物保# 4*C 預(yù)變性 94°C 5 min 變性 94 ? 30)sec 退火 56°C 30 fee 35 cycles
[0076] RUNX-2 的擴(kuò)增： 一 延伸 72°C 1 min 終末延沖 72? 10 min 擴(kuò)培產(chǎn)物fti# rc
[0077] 0CN的擴(kuò)增：預(yù)變性 94V 5 min
[0078] 變n 9>rc 3(kscc jy火 WTC 30 pc 35 cycles 延伸 72? 1 rain 終未延仲 72Γ 10 min 忙始產(chǎn)物保# ++rc
[0079] 瓊脂糖凝膠電泳成像分析，并檢測擴(kuò)增條帶的產(chǎn)物含量，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。如圖 3所示，經(jīng)過組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA藥物處理過的健康及炎癥牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞表 明，成骨相關(guān)基因 OCN和RUNX2明顯增高，說明TSA可以促進(jìn)牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨。
[0080] 二、LBH589促進(jìn)根尖牙乳頭干細(xì)胞的成骨分化
[0081] 1、LBH589促進(jìn)根尖牙乳頭干細(xì)胞的成骨分化。
[0082] 將生長狀況良好的純化的第三代根尖牙乳頭干細(xì)胞以2X103/cm2的密度接種于 6孔板，待細(xì)胞融合達(dá)80%后，更換培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)液，設(shè)置未加入成骨誘導(dǎo)液的空白組 (A)，加入成骨誘導(dǎo)液DMSO(B)、成骨誘導(dǎo)加入DMSO(C)、成骨誘導(dǎo)加入LBH589 20nM(D)、成 骨誘導(dǎo)加入LBH58950nM(E)、成骨誘導(dǎo)加入LBH589 100nM(F)。2天換液一次，每天倒置顯微 鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及礦化結(jié)節(jié)形成情況。7d后行堿性磷酸酶染色及堿性磷酸酶活性檢測， 如圖4所示，經(jīng)不同濃度的LBH589作用后，較未加入藥物干細(xì)胞成骨，明顯增加；28天后進(jìn) 行茜素紅染色并進(jìn)行定量分析，如圖5所示經(jīng)不同濃度的LBH589作用后，茜素紅染色深，促 進(jìn)成骨分化。
[0083] 2、實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎模型的建立
[0084] 選用8周齡健康雄性SD大鼠，并只采用正畸Φ0. 20mm結(jié)扎圓絲結(jié)扎上頜第一磨 牙并及給予高糖飲食的方法建立大鼠牙周炎模型。如圖6所示，為隨機(jī)抽取的實(shí)驗(yàn)動物，處 死，通過觀察可見牙槽骨明顯吸收，成功的建立了大鼠牙周炎模型。
[0085] 3、體內(nèi)牙齦注射曲古抑菌素 A (TSA)-殼聚糖緩釋藥物，可明顯治療大鼠牙周炎。
[0086] 三、TSA殼聚糖緩釋系統(tǒng)制備：
[0087] 殼聚糖溫敏體系的制備：稱取2g殼聚糖粉末溶解在100mL濃度1 %醋酸溶液中， 配制成2 %殼聚糖溶液，移取一定體積的2 %殼聚糖溶液于試管中，按比例逐滴加入58 % β -甘油磷酸鈉溶液，振蕩混勻后，以少量NaOH稀溶液調(diào)節(jié)混合液的pH = 5。
[0088] TSA的DMS0溶液制備：稱取TSA粉末0· lmg溶解于1L DMS0中，配制成100 μ g/L 溶液。
[0089] TSA殼聚糖緩釋系統(tǒng)制備：將100 μ g/L的TSADMS0溶液溶液加入殼聚糖溫敏體系 中，攪拌均勻，最終達(dá)到10 μ g/L濃度，常溫保存。
[0090] 將32只大鼠分為4組：①空白對照組（blank組），未結(jié)扎的8只正常大鼠，以后 實(shí)驗(yàn)中不做處理；②鹽水組（C0NT組），隨機(jī)選取24只建模成功的大鼠中的8只，在以后實(shí) 驗(yàn)中注射生理鹽水；③殼聚糖組（CHIT組），隨機(jī)選取24只建模成功的大鼠中的8只，以后 實(shí)驗(yàn)中注射殼聚糖；④實(shí)驗(yàn)組（TSA組），隨機(jī)選取24只建模成功的大鼠中的8只，實(shí)驗(yàn)中 注射曲古抑菌素 A-殼聚糖緩釋藥物系統(tǒng)。C0NT組、CHIT組、TSA組分別在建模成功后lw、 3w、5w通過口腔局部齦下注射給予不同的實(shí)驗(yàn)藥物，給藥后7w處死4組實(shí)驗(yàn)動物。
[0091] 治療后各組大鼠牙槽骨情況如圖7所示，A圖為正常大鼠牙槽骨狀況，沒有牙周骨 喪失；B -D圖各有不同程度的骨喪失；其中B、C兩圖顯不骨喪失較明顯，而D圖顯不骨喪失 較B、C明顯輕微；統(tǒng)計學(xué)分析后顯示TSA組與鹽水組之間有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P < 0. 01)。
[0092] 給藥后各組大鼠牙周袋探診深度及變化情況，如圖8所示，注射鹽水組和殼聚糖 組與TSA組有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，TSA可以減小牙周炎大鼠的牙周袋深度。
[0093] 牙周骨支持率（PBS)的檢測，如圖9-1所示，將各組大鼠上頜骨做MicroCT掃描， 在X線片上先取各點(diǎn)，A為根尖點(diǎn)，C為牙尖高點(diǎn)，B為AC連線與牙槽嵴頂線的交點(diǎn)。PBS =AB/ACX 100%。各組大鼠牙槽骨MicroCT圖像顯示如圖9,表示TSA組與鹽水組之間有 明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P< 0.01)。
[0094] 結(jié)果分析
[0095] 1、組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA或LBH589促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化
[0096] 本發(fā)明中，利用組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA和LBH589促進(jìn)正常及炎癥間充質(zhì)干 細(xì)胞的成骨分化，增強(qiáng)相關(guān)成骨基因〇CN、RUNX2的表達(dá)。我們首先利用牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞 和根尖牙乳頭干細(xì)胞，通過MTT細(xì)胞增殖及毒性試驗(yàn)摸索在培養(yǎng)基中加入TSA和LBH589的 適宜濃度，并通過堿磷酶染色及堿磷酶活性檢測，茜素紅染色及礦結(jié)節(jié)分析，RT-PCR檢測相 關(guān)成骨基因〇CN、RUNX2的表達(dá)，說明組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA和LBH589都能明顯的促 進(jìn)骨分化，利于骨組織再生。我們通過建立實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎動物模型，并體內(nèi)注射曲古抑 菌素 A (TSA)-殼聚糖緩釋系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)該藥物體內(nèi)可降低牙周袋深度，增加骨支持率，促進(jìn)骨 組織再生。
[0097] 本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用前景
[0098] 組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、分化和抑制增殖的活性， 目前其研究涉及眾多腫瘤領(lǐng)域，包括血液系統(tǒng)腫瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、前列腺 癌、肺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌等，其并對腫瘤細(xì)胞具有高選擇性和低毒的優(yōu)點(diǎn)具有非常廣闊的 應(yīng)用前景。除了明確的抗腫瘤活性，HDACi還顯示出免疫調(diào)節(jié)活性，體外實(shí)驗(yàn)表明HDACi可 抑制T淋巴細(xì)胞的活化、增殖及分泌細(xì)胞因子的能力，利用炎癥性自身免疫性疾病動物模 型進(jìn)行的研究也證實(shí)了其免疫抑制活性，但其潛在的機(jī)制有待進(jìn)一步探索。HDACi通過在 轉(zhuǎn)錄后修飾組蛋白來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)裝配，從而成為了某些疾病治療的新靶點(diǎn)。雖 然HDACi介導(dǎo)免疫反應(yīng)的潛在分子機(jī)制有待于進(jìn)一步探索，但是其強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)活性 為治療炎癥免疫性疾病帶來了希望。HDACi也被證明能夠誘導(dǎo)細(xì)胞終末分化，體外研究已經(jīng) 證實(shí)多種HDACi能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞或前體細(xì)胞骨向或神經(jīng)向分化。
[0099] 組蛋白去乙?；敢种苿┲饕ㄟ^抑制組蛋白去乙酰化酶的活性從而使組蛋白 乙?；潭壬撸M(jìn)而引起染色質(zhì)重組DNA轉(zhuǎn)錄活化或抑制，細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞分化及細(xì) 胞凋亡等一系列生物學(xué)效應(yīng)。局部應(yīng)用組蛋白去乙酰化抑制劑可能會為牙周炎治療開辟一 條新途徑。HDACi也被證明能夠誘導(dǎo)細(xì)胞終末分化，體外研究已經(jīng)證實(shí)多種HDACi能夠誘導(dǎo) 干細(xì)胞或前體細(xì)胞骨向或神經(jīng)向分化。最近研究證明，HDACi通過提高成骨相關(guān)蛋白（如骨 橋蛋白、堿性磷酸酶、骨涎蛋白和骨涎蛋白等）的水平從而促進(jìn)成骨。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去 乙?；敢种苿?VPA可以促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。組蛋白去乙?；?TSA 能夠調(diào)節(jié)人脂肪干細(xì)胞（hASCs)中轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的乙酰化作用，從而提高其成骨分化。組 蛋白去乙酰化酶抑制劑能用于牙周炎，種植體周圍炎等疾病，促進(jìn)骨組織再生。
【權(quán)利要求】
1. 一種組蛋白去乙?；敢种苿┰谥苽溲涝葱愿杉?xì)胞的成骨分化制劑中的應(yīng)用，所述 組蛋白去乙?；敢种苿榍乓志?A或帕比司他。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述牙源性干細(xì)胞為牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞 或根尖牙乳頭干細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述曲古抑菌素 A的濃度為ΙΟΟηΜ。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述帕比司他的濃度為20nM、50nM或 ΙΟΟηΜ。
5. -種組蛋白去乙酰化酶抑制劑促進(jìn)牙源性干細(xì)胞的成骨分化的方法，其特征在于， 步驟如下 取第三代的正常和炎癥牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞，以2X103/cm2的密度接種于6孔板，待細(xì) 胞融合達(dá)80%后，更換培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)液，加入TSA使終濃度為ΙΟΟηΜ，對照組加入等量 DMS0, 2天換液一次，每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及礦化結(jié)節(jié)形成情況。
6. -種組蛋白去乙?；敢种苿┐龠M(jìn)牙源性干細(xì)胞的成骨分化的方法，其特征在于， 步驟如下 將生長狀況良好的純化的第三代根尖牙乳頭干細(xì)胞以2X 103/Cm2的密度接種于6孔 板，待細(xì)胞融合達(dá)80 %后，更換培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)液，加如梯度濃度為為20nM、50nM或 ΙΟΟηΜ的帕比司他，2天換液一次，每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及礦化結(jié)節(jié)形成情況。
7. -種制備促進(jìn)牙源性干細(xì)胞成分分化TSA殼聚糖緩釋藥物的方法，其特征在于：包 括如下步驟： ⑴殼聚糖溫敏體系的制備：稱取2g殼聚糖粉末溶解在100mL濃度1 %醋酸溶液中， 配制成2%殼聚糖溶液，移取一定體積的2%殼聚糖溶液于試管中，按比例逐滴加入58% β -甘油磷酸鈉溶液，振蕩混勻后，以少量NaOH稀溶液調(diào)節(jié)混合液的pH = 5 ; (2) TSA的DMS0溶液制備：稱取TSA粉末0. lmg溶解于1L DMS0中，配制成100 μ g/L溶 液； (3) TSA殼聚糖緩釋系統(tǒng)制備：將100 μ g/L的TSA DMS0溶液溶液加入殼聚糖溫敏體系 中，攪拌均勻，最終達(dá)到10 μ g/L濃度，常溫保存。
【文檔編號】C12N5/0775GK104152407SQ201410287427
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】劉大勇, 高平, 賈智, 張旭, 肖蕊, 馮春月, 王月君 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院