一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法
【專利摘要】一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法，它涉及一種制備正丁醇的方法。本發(fā)明要解決現(xiàn)有生物發(fā)酵生產正丁醇過程中底物成本高，木質纖維素水解過程中商品酶的應用造成成本上升，以及單一菌種纖維素酶系比例失衡造成的酶活降低等問題。方法：將預處理木質纖維素應用源于綠色木霉和黑曲霉纖維素酶混合粗酶液進行生物酶法水解，得到的糖液加入氮源、無機鹽和維生素后通入氮氣除氧，接種丙酮丁醇梭菌種子液進行厭氧發(fā)酵生產正丁醇。本發(fā)明提高了纖維素酶解過程中生物酶的活性，降低了生物發(fā)酵生產正丁醇過程中底物和酶法水解的成本消耗，減少了設備損耗和環(huán)境污染問題；本發(fā)明中混合粗酶液糖化水解效率達到75％。
【專利說明】一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵生產正丁醇的方法。
【背景技術】
[0002]目前，世界能源需求主要由化石燃料滿足。然而，化石燃料資源枯竭一直是困擾人類社會可持續(xù)發(fā)展的一大重要因素，隨著科技的發(fā)展，人類越來越依賴能源來開展生產生活活動，這種影響近年來尤為明顯，對有限的能源資源的需求與日俱增，因此，開發(fā)一種新型能源勢在必行。正丁醇作為一種新型能源載體，其與汽油互溶性好，并可直接應用于現(xiàn)有發(fā)動機，具有較高的能量密度，辛烷值接近汽油，且親水性較差，便于運輸?shù)葍?yōu)點，被稱為新一代生物能源。生產正丁醇的方法有很多種，石油加工法目前應用最廣、成本也較低，但是其受制于石油資源的枯竭具有不可持續(xù)性；而生物發(fā)酵法生產正丁醇技術以其可持續(xù)性和發(fā)酵過程節(jié)能環(huán)保，受到廣泛的關注。為了使生物發(fā)酵生產正丁醇更具經(jīng)濟競爭力，尋求一種可再生且廉價的基質是關鍵。木質纖維素原料，如農業(yè)廢棄物，是地球上最廉價、最豐富的可再生資源之一。亞洲國家具有巨大的利用農業(yè)廢棄物生物發(fā)酵生產正丁醇的潛力，僅我國每年農業(yè)廢棄物(玉米秸桿、稻草和麥秸等)的產量可達7億噸左右，能量相當于5億噸標煤。如果能將這些生物質資源有效利用起來，有目的性地降解，并進一步轉化為丁醇，這將極大的降低生產 丁醇的成本，使大規(guī)模并產業(yè)化生產燃油丁醇成為可能，這將在一定程度上緩解當前緊張的能源短缺局面。
[0003]由于秸桿表層蠟質的保護作用、木質素和半纖維素的空間障礙效應以及纖維素的高結晶度和聚合度影響秸桿的生物轉化效率。因此，要充分有效利用農作物秸桿資源，就必須對秸桿進行預處理，破壞秸桿的表層蠟質、木質素-半纖維素的共價結合、纖維素的結晶結構等，使纖維素與木質素及半纖維素相互分離，增加纖維素分子與微生物或酶的接觸概率，實現(xiàn)提高秸桿生物轉化效率的目的。生物酶法水解因其反應條件溫和、酶促反應的特異性與高效性受到青睞。但是在生物酶法水解的過程中所用的纖維素商品酶制備過程復雜、保存條件嚴格、價格較高，會進一步提高生物發(fā)酵生產正丁醇的成本。
[0004]生物酶法降解木質纖維素是一個酶系各組分相互協(xié)同作用最后達到降解效果的過程:內切葡聚糖酶能夠附著在纖維絲表面切斷纖維素的分子鏈，外切葡聚糖酶則在纖維素分子鏈兩端進行切割形成葡萄糖或纖維二糖，最后β -1, 4-葡萄糖苷酶能夠將纖維二糖分解形成葡萄糖。在這一過程中各種酶相互協(xié)調的效果取決于各組分的酶活力以及該組分在整體酶系中的比例。而由于不同菌種中纖維素酶系各組分表達的差異性，在纖維素酶系的生產過程中往往幾種酶的活力及產量配比是無法協(xié)調發(fā)揮最大效率的。如常見的纖維素酶生產菌株綠色木霉，其纖維素酶系中β -1, 4-葡萄糖苷酶活性較低，結果會造成在其纖維素水解產物中纖維二糖的大量積累，這不但會降低其纖維素的降解效率，更對接下來水解液的進一步發(fā)酵應用產生不利影響；再如另一常見纖維素降解真菌黑曲霉中，若僅僅β-1，4-葡萄糖苷酶具有較高酶活，但其內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活力不足以降解纖維素產生足夠的纖維二糖，對黑曲霉降解纖維素的整體效率沒有幫助。因此多種菌株纖維素酶的混合粗酶液水解纖維素能夠明顯改善整體纖維素酶系中各組分酶的協(xié)調比例，最終提高整體的纖維素降解能力，有利于降低纖維素發(fā)酵生產正丁醇的生產成本。但目前沒有一組有效的多種菌株有效生產正丁醇的方案。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明要解決現(xiàn)有生物發(fā)酵生產正丁醇過程中底物成本高，木質纖維素水解過程中商品酶的應用造成成本上升，以及單一菌種纖維素酶系比例失衡造成的酶活降低等問題。從而提供一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法。
[0006]本發(fā)明的一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法，是按以下步驟實現(xiàn):
[0007]—、對木質纖維素采用堿預處理:木質纖維素與質量百分含量為2%的氫氧化鈉溶液按質量比為1:9的比例混合，得混合溶液，將混合溶液在100°C條件下處理2h，然后將混合溶液經(jīng)蒸餾水洗滌至PH為中性并在105°C條件下烘干至恒重，得到的殘余固體即為預處理的木質纖維素；
[0008]二、混合粗酶液的獲得:將綠色木霉和黑曲霉分別在好氧條件下采用液體發(fā)酵的方法獲得綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液；然后將綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液按體積比為2~4:1的比例混合，得到混合纖維素酶粗酶液； [0009]其中，液體發(fā)酵的具體操作如下:分別綠色木霉孢子和黑曲霉孢子接種到綠色木霉的液體產酶培養(yǎng)基和黑曲霉的液體產酶培養(yǎng)基中，然后在好氧發(fā)酵溫度為28~32°C、轉速為80~120r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4~6d,發(fā)酵過程結束后發(fā)酵液分別以5000g離心15min，分別收集上清液，所得上清液分別為綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液；
[0010]三、將步驟一得到的預處理的木質纖維素按質量體積比為0.8~1.5g:1OmL的比例加入到步驟二得到的混合纖維素酶粗酶液中，在水解體系pH值4.0~5.5、溫度為50~600C的條件下對預處理的木質纖維素進行酶水解48~60h，然后經(jīng)5000g離心15min，取上清液后濃縮，再加入?yún)捬跖囵B(yǎng)基中并通入氮氣除氧，再接入丙酮丁醇梭菌種子液進行厭氧發(fā)酵96h，即完成利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇；
[0011]其中，步驟二中所述的所述綠色木霉的孢子接種量為IO8~IO9個/L，所述的綠色木霉的液體產酶培養(yǎng)基含有濃度為2.0g/L的KH2PO4溶液、濃度為1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、濃度為0.3g/L的MgSO4.7H20溶液、濃度為0.3g/L的CaCl2溶液、濃度為0.3g/L的尿素溶液、濃度為20g/L的麩皮溶液、濃度為8g/L的玉米秸桿溶液、濃度為5g/L的豆餅粉溶液以及微量金屬元素貯液lmL/L ;所述的微量金屬元素貯液母液含有濃度為5.0g/L的FeSO4.7H20溶液、濃度為1.6g/L的MgSO4溶液、濃度為1.4g/L的ZnSO4.7H20溶液以及濃度為2.0g/L的CoCl2溶液；
[0012]步驟二中所述的黑曲霉的孢子接種量為IO12~IO16個/L ;所述的黑曲霉的液體產酶培養(yǎng)基含有濃度為1.0g/L的麩皮溶液、濃度為1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、濃度為2.0g/L的KH2PO4溶液、濃度為0.3g/L的CaCl2溶液、濃度為0.3g/L的MgSO4溶液、濃度為1.6mg/L的FeSO4.7H20溶液、濃度為1.4mg/L的ZnSO4.7H20溶液和濃度為2.0mg/L的CoCl2溶液；
[0013]步驟三中所述的厭氧培養(yǎng)基中含有濃度為2.0g/L的酵母粉溶液、濃度為2.5g/L的KH2PO4溶液、濃度為3.0g/L的Na2HPO4溶液、濃度為1.0g/L的NH4Cl溶液、濃度為0.4g/L的MgSO4溶液、濃度為0.5g/L的半胱氨酸溶液、維生素儲液lmL/L、微量金屬元素儲液ImL/L以及濃度為0.05g/L的刃天青溶液；所述維生素貯液每IL是由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的煙酸、5.0mg的鹽酸硫胺素、50.0mg的對氨基苯甲酸、20.0mg的葉酸、50.0mg的泛酸鈣、1.0mg的維生素B12和100.0mg的鹽酸吡哆醇組成；所述微量金屬元素儲液每 IL 由 1.5g 的 FeCl2、70mg 的 ZnCl2、6mg 的硼酸 0.1g 的 MnCl2.4H20、2mg 的 CuCl2.2Η20、
0.19g 的 CoCl2 *6H20,24mg 的 NiCl2 *6H20,36mg 的 Na2MO4.H20、15mg 的 Na2WO4.2Η20 和 15mg的 Na2SeO4.5H20 組成；
[0014]步驟三中所述的丙酮丁醇梭菌，其種子液接種量是按體積百分含量為2%的生長至對數(shù)期、600nm條件下OD值為1.0的液體懸濁液。
[0015]本發(fā)明步驟三中丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824購買于中國普通微生物菌種保藏中心。
[0016]本發(fā)明中所用的綠色木霉為綠色木霉T.viride AS3.3711是具有較高的內切纖維素酶活力的菌株，購買自中國科學院微生物菌種保藏中心；本實施方式的黑曲霉為黑曲霉A.niger ATCC 16888菌株是具有較高β -1, 4-葡萄糖苷酶活性菌株并購買自中國普通微生物菌種保藏中心。
[0017]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0018](I)木質纖維素的水解采用纖維素酶混合粗酶液降解法，黑曲霉ATCC 16888菌株所具有的高β -1, 4-葡萄糖苷酶活力彌補了綠色木霉AS3.3711中相應酶活力較低的短板，改善了混合粗酶液中纖維素酶系中各種組分協(xié)調作用的效果，混合粗酶液對預處理后的纖維素進行水解糖化，糖化率(糖化率指水解產糖量與纖維素中纖維素與半纖維素質量的比值)可以達到75%，與綠色木霉以及黑曲霉各自粗酶液進行酶解反應的糖化率相比較提高幅度分別為25%和30% ;
[0019](2)采用粗酶液生物轉化法完成由木質纖維素到正丁醇的生產過程，降低設備損耗，減少了化學糖化過程中能源消耗和環(huán)境污染，降低了生物發(fā)酵生產正丁醇的成本，減少能源生產對化石燃料的依存度；
[0020](3)粗酶液降解木質纖維素的效率與商品酶比較后發(fā)現(xiàn)，前者能夠達到后者的90%，說明粗酶液可以很好地替代價格昂貴的商品化纖維素酶對纖維素進行處理，從而進一步降低了酶法水解過程中的成本；
[0021](4)本發(fā)明采用的濃縮水解糖液的方法解決了木質纖維素酶法糖化水解液中單糖初始含量較低的問題，同時未發(fā)現(xiàn)有厭氧發(fā)酵抑制物的產生，分步糖化發(fā)酵生產正丁醇具有相對較高且穩(wěn)定的產量，批式發(fā)酵生產正丁醇終濃度可達7.05g/L，正丁醇產率0.141g/gsubstrate。
【具體實施方式】
[0022]【具體實施方式】一:本實施方式應用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵生產正丁醇的方法按以下步驟實現(xiàn):[0023]一、對木質纖維素采用堿預處理:木質纖維素與質量百分含量為2%的氫氧化鈉溶液按質量比為1:9的比例混合，得混合溶液，將混合溶液在100°C條件下處理2h，然后將混合溶液經(jīng)蒸餾水洗滌至PH為中性并在105°C條件下烘干至恒重，得到的殘余固體即為預處理的木質纖維素；
[0024]二、混合粗酶液的獲得:將綠色木霉和黑曲霉分別在好氧條件下采用液體發(fā)酵的方法獲得綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液；然后將綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液按體積比為2~4:1的比例混合，得到混合纖維素酶粗酶液；
[0025]其中，液體發(fā)酵的具體操作如下:分別綠色木霉孢子和黑曲霉孢子接種到綠色木霉的液體產酶培養(yǎng)基和黑曲霉的液體產酶培養(yǎng)基中，然后在好氧發(fā)酵溫度為28~32°C、轉速為80~120r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4~6d,發(fā)酵過程結束后發(fā)酵液分別以5000g離心15min，分別收集上清液，所得上清液分別為綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液；
[0026]三、將步驟一得到的預處理的木質纖維素按質量體積比為0.8~1.5g:1OmL的比例加入到步驟二得到的混合纖維素酶粗酶液中，在水解體系pH值4.0~5.5、溫度為50~600C的條件下對預處理的木質纖維素進行酶水解48~60h，然后經(jīng)5000g離心15min，取上清液后濃縮，再加入?yún)捬跖囵B(yǎng)基中并通入氮氣除氧，再接入丙酮丁醇梭菌種子液進行厭氧發(fā)酵96h，即完成利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇；
[0027]其中，步驟二中所述的所述綠色木霉的孢子接種量為IO8~IO9個/L，所述的綠色木霉的液體產酶培養(yǎng)基含有濃度為2.0g/L的KH2PO4溶液、濃度為1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、濃度為0.3g/L 的MgSO4.7H20溶液、濃度為0.3g/L的CaCl2溶液、濃度為0.3g/L的尿素溶液、濃度為20g/L的麩皮溶液、濃度為8g/L的玉米秸桿溶液、濃度為5g/L的豆餅粉溶液以及微量金屬元素貯液lmL/L ;所述的微量金屬元素貯液母液含有濃度為5.0g/L的FeSO4.7H20溶液、濃度為1.6g/L的MgSO4溶液、濃度為1.4g/L的ZnSO4.7H20溶液以及濃度為2.0g/L的CoCl2溶液；
[0028]步驟二中所述的黑曲霉的孢子接種量為IO12~IO16個/L ;所述的黑曲霉的液體產酶培養(yǎng)基含有濃度為1.0g/L的麩皮溶液、濃度為1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、濃度為2.0g/L的KH2PO4溶液、濃度為0.3g/L的CaCl2溶液、濃度為0.3g/L的MgSO4溶液、濃度為1.6mg/L的FeSO4.7H20溶液、濃度為1.4mg/L的ZnSO4.7H20溶液和濃度為2.0mg/L的CoCl2溶液；
[0029]步驟三中所述的厭氧培養(yǎng)基中含有濃度為2.0g/L的酵母粉溶液、濃度為2.5g/L的KH2PO4溶液、濃度為3.0g/L的Na2HPO4溶液、濃度為1.0g/L的NH4Cl溶液、濃度為0.4g/L的MgSO4溶液、濃度為0.5g/L的半胱氨酸溶液、維生素儲液lmL/L、微量金屬元素儲液ImL/L以及濃度為0.05g/L的刃天青溶液；所述維生素貯液每IL是由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的煙酸、5.0mg的鹽酸硫胺素、50.0mg的對氨基苯甲酸、20.0mg的葉酸、50.0mg的泛酸鈣、1.0mg的維生素B12和100.0mg的鹽酸吡哆醇組成；所述微量金屬元素儲液每 IL 由 1.5g 的 FeCl2、70mg 的 ZnCl2、6mg 的硼酸 0.1g 的 MnCl2.4H20、2mg 的 CuCl2.2Η20、
0.19g 的 CoCl2 *6H20,24mg 的 NiCl2 *6H20,36mg 的 Na2MO4.H20、15mg 的 Na2WO4.2Η20 和 15mg的 Na2SeO4.5H20 組成；
[0030]步驟三中所述的丙酮丁醇梭菌，其種子液接種量是按體積百分含量為2%的生長至對數(shù)期、600nm條件下OD值為1.0的液體懸濁液。
[0031]本實施方式步驟三中丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824購買于中國普通微生物菌種保藏中心。
[0032]本實施方式的綠色木霉為綠色木霉T.viride AS3.3711是具有較高的內切纖維素酶活力的菌株，購買自中國科學院微生物菌種保藏中心；本實施方式的黑曲霉為黑曲霉A.niger ATCC 16888菌株是具有較高β -1, 4-葡萄糖苷酶活性菌株并購買自中國普通微生物囷種保減中心。
[0033]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟二中所述的將綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液按體積比為3:1的比例混合。其它與【具體實施方式】一相同。
[0034]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二不同的是:步驟三中所述的取上清液后濃縮是指采用減壓蒸餾的方法濃縮至上清液2~4倍濃度。其它與【具體實施方式】一或二相同。
[0035]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一至三之一不同的是:步驟二中所述的在好氧發(fā)酵溫度為28~32°C、轉速為100~120r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4d。其它與
【具體實施方式】一至三之一相同。 [0036]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一不同的是:步驟三中所述的在水解體系pH值4.0~5.5、溫度為55~60°C的條件下對預處理的木質纖維素進行酶水解48h。其它與【具體實施方式】一至四之一相同。
[0037]通過以下實驗驗證本發(fā)明的有益效果:
[0038]實驗I
[0039]本實施方式的一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法，是按以下步驟實現(xiàn):
[0040]一、對木質纖維素采用堿預處理:木質纖維素與質量百分含量為2%的氫氧化鈉溶液按質量比為l:9(w/w)的比例混合，得混合溶液，將混合溶液在100°C條件下處理2h，然后將混合溶液經(jīng)蒸餾水洗滌至PH為中性并在105°C條件下烘干至恒重，得到的殘余固體即為預處理的木質纖維素；
[0041]二、混合粗酶液的獲得:將綠色木霉(Trichoderma viride)AS3.3711和黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 16888分別在好氧條件下采用液體發(fā)酵的方法獲得綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液；然后將綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液按體積比為2~4:1的比例混合，得到混合纖維素酶粗酶液；
[0042]其中，液體發(fā)酵的具體操作如下:分別綠色木霉孢子和黑曲霉孢子接種到綠色木霉的液體產酶培養(yǎng)基和黑曲霉的液體產酶培養(yǎng)基中，然后在好氧發(fā)酵溫度為28~32°C、轉速為80~120r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4~6d,發(fā)酵過程結束后發(fā)酵液分別以5000g離心15min，分別收集上清液，所得上清液分別為綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液；
[0043]三、取32~60g步驟一預處理的木質纖維素加入到400mL步驟二得到的混合粗酶液中，在水解體系pH值4.0~5.5、溫度為50~60 °C的條件下對預處理的木質纖維素進行酶水解48h以上，之后經(jīng)5000g離心條件下離心15min取得上清水解液，并將該上清液濃縮，之后加入氮源及鹽溶液并通入氮氣除氧，再接入丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum) ATCC824種子液進行厭氧發(fā)酵96h生產正丁醇；
[0044]其中，步驟二中綠色木霉的液體產酶培養(yǎng)基中，所述綠色木霉的孢子接種量為IO8~IO9個/L ;綠色木霉T.viride AS3.3711購買自中國科學院微生物菌種保藏中心；所述的液體產酶培養(yǎng)基含有濃度為2.0g/L的KH2PO4溶液、濃度為1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、濃度為0.3g/L的MgSO4.7Η20溶液、濃度為0.3g/L的CaCl2溶液、濃度為0.3g/L的尿素溶液、濃度為20g/L的麩皮溶液、濃度為8g/L的玉米秸桿溶液、濃度為5g/L的豆餅粉溶液以及微量金屬元素貯液lmL/L ;所述的微量金屬元素貯液母液含有濃度為5.0g/L的FeSO4.7H20溶液、濃度為1.6g/L的MgSO4溶液、濃度為1.4g/L的ZnSO4.7H20溶液以及濃度為2.0g/L的CoCl2溶液；
[0045]步驟二中黑曲霉的液體產酶培養(yǎng)基中，所述黑曲霉的孢子接種量為IO12~IO16個/L ;黑曲霉A.niger ATCC 16888菌株是具有較高β _1，4-葡萄糖苷酶活性菌株并購買自中國普通微生物菌種保藏中心；所述的產酶培養(yǎng)基含有濃度為1.0g/L的麩皮溶液、濃度為
1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、濃度為2.0g/L的KH2PO4溶液、濃度為0.3g/L的CaCl2溶液、濃度為
0.3g/L 的 MgSO4 溶液、濃度為 1.6mg/L 的 FeSO4.7H20 溶液、濃度為 1.4mg/L 的 ZnSO4.7H20溶液和濃度為2.0mg/L的CoCl2溶液；
[0046]步驟三中所述的厭氧發(fā)酵體系中，含有濃度為2.0g/L的酵母粉溶液、濃度為
2.5g/L的KH2PO4溶液、濃度為3.0g/L的Na2HPO4溶液、濃度為1.0g/L的NH4Cl溶液、濃度為0.4g/L的MgSO4溶液 、濃度為0.5g/L的半胱氨酸溶液、維生素儲液lmL/L、微量金屬元素儲液lmL/L以及濃度為0.05g/L的刃天青溶液；所述維生素貯液每IL是由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的煙酸、5.0mg的鹽酸硫胺素、50.0mg的對氨基苯甲酸、20.0mg的葉酸、50.0mg的泛酸鈣、1.0mg的維生素B12和100.0mg的鹽酸吡卩多醇組成；所述微量金屬元素儲液每IL由1.5g的FeCl2、70mg的ZnCl2、6mg的硼酸0.1g的MnCl2.4H20、2mg 的 CuCl2.2Η20、0.19g 的 CoCl2.6H20、24mg 的 NiCl2.6H20、36mg 的 Na2MO4.H20,15mg 的Na2WO4.2H20 和 15mg 的 Na2SeO4.5H20 組成；
[0047]步驟三中所述的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824購買于中國普通微生物菌種保藏中心，其種子液接種量是2%的生長至對數(shù)期、600nm條件下OD值為1.0的液體懸濁液。
[0048]實驗結果:
[0049]步驟一中，經(jīng)過堿預處理的木質纖維素中，木質素含量顯著下降，半纖維素含量有所減少，進而纖維素相對含量有所上升。說明堿預處理能夠有效的打破木質素、半纖維素對纖維素的包裹和纏繞作用，有利于纖維素酶與纖維素分子的接觸，以達到提高纖維素酶水解效率的目的；
[0050]步驟二中，分別對綠色木霉粗酶液、黑曲霉粗酶液、混合纖維素酶粗酶液進行酶活力測定和比較，綠色木霉具有較高的內切葡聚糖酶活性(6.74U)及外切葡聚糖酶活性(5.47U)，但是其β_1，4-葡萄糖苷酶活性較低(0.25U)，造成纖維素水解過程中纖維二糖的大量積累，濾紙酶活較低(3.16U);相對應的黑曲霉纖維素酶系中內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性較綠色木霉低，濾紙酶活也僅為3.09U,但是其β -1, 4-葡萄糖苷酶活性相對于綠色木霉顯著提高(2.76U);兩者混合粗酶液其濾紙酶活能夠達到6.17U，相較于各自原始菌株均有很大程度的提升。對預處理的纖維素進行水解反應，得到糖含量超過17g/L的水解液，纖維素失重率超過85%，糖化效率達到75% ；
[0051]步驟三中厭氧發(fā)酵體系每6h取樣，經(jīng)過離心和濾膜過濾，對上清中的發(fā)酵液產物應用安捷倫6890N型高效液相色譜進行分析，發(fā)現(xiàn)步驟三從12h開始有丁醇產生，發(fā)酵持續(xù)60~96h結束， 最終的丁醇產量1.05g/L，產率為0.141g/g substrate。
【權利要求】
1.一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法，其特征在于，它是按以下步驟實現(xiàn): 一、對木質纖維素采用堿預處理:木質纖維素與質量百分含量為2%的氫氧化鈉溶液按質量比為1:9的比例混合，得混合溶液，將混合溶液在100°C條件下處理2h，然后將混合溶液經(jīng)蒸餾水洗滌至PH為中性并在105°C條件下烘干至恒重，得到的殘余固體即為預處理的木質纖維素； 二、混合粗酶液的獲得:將綠色木霉和黑曲霉分別在好氧條件下采用液體發(fā)酵的方法獲得綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液；然后將綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液按體積比為(2~4):1的比例混合，得到混合纖維素酶粗酶液； 其中，液體發(fā)酵的具體操作如下:分別綠色木霉孢子和黑曲霉孢子接種到綠色木霉的液體產酶培養(yǎng)基和黑曲霉的液體產酶培養(yǎng)基中，然后在好氧發(fā)酵溫度為28~32°C、轉速為80~120r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4~6d,發(fā)酵過程結束后發(fā)酵液分別以5000g離心15min,分別收集上清液，所得上清液分別為綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液； 三、將步驟一得到的預處理的木質纖維素按質量體積比為0.8~1.5g:1OmL的比例加入到步驟二得到的混合纖維素酶粗酶液中，在水解體系pH值4.0~5.5、溫度為50~60°C的條件下對預處理的木質纖維素進行酶水解48~60h，然后經(jīng)5000g離心15min，取上清液后濃縮，再加入?yún)捬跖囵B(yǎng)基中并通入氮氣除氧，再接入丙酮丁醇梭菌種子液進行厭氧發(fā)酵96h，即完成利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇； 其中，步驟二中所述的所述綠色木霉的孢子接種量為IO8~IO9個/L，所述的綠色木霉的液體產酶培養(yǎng)基含有濃度為2.0g/L的KH2PO4溶液、濃度為1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、濃度為0.3g/L的MgSO4.7Η 20溶液、濃度為0.3g/L的CaCl2溶液、濃度為0.3g/L的尿素溶液、濃度為20g/L的麩皮溶液、濃度為8g/L的玉米秸桿溶液、濃度為5g/L的豆餅粉溶液以及微量金屬元素貯液lmL/L ;所述的微量金屬元素貯液母液含有濃度為5.0g/L的FeSO4.7H20溶液、濃度為1.6g/L的MgSO4溶液、濃度為1.4g/L的ZnSO4.7H20溶液以及濃度為2.0g/L的CoCl2溶液； 步驟二中所述的黑曲霉的孢子接種量為IO12~IO16個/L ;所述的黑曲霉的液體產酶培養(yǎng)基含有濃度為1.0g/L的麩皮溶液、濃度為1.4g/L的(NH4)2SO4溶液、濃度為2.0g/L的KH2PO4溶液、濃度為0.3g/L的CaCl2溶液、濃度為0.3g/L的MgSO4溶液、濃度為1.6mg/L的FeSO4.7H20溶液、濃度為1.4mg/L的ZnSO4.7H20溶液和濃度為2.0mg/L的CoCl2溶液； 步驟三中所述的厭氧培養(yǎng)基中含有濃度為2.0g/L的酵母粉溶液、濃度為2.5g/L的KH2PO4溶液、濃度為3.0g/L的Na2HPO4溶液、濃度為1.0g/L的NH4Cl溶液、濃度為0.4g/L的MgSO4溶液、濃度為0.5g/L的半胱氨酸溶液、維生素儲液lmL/L、微量金屬元素儲液lmL/L以及濃度為0.05g/L的刃天青溶液；所述維生素貯液每IL是由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的煙酸、5.0mg的鹽酸硫胺素、50.0mg的對氨基苯甲酸、20.0mg的葉酸、50.0mg的泛酸鈣、1.0mg的維生素B12和100.0mg的鹽酸吡哆醇組成；所述微量金屬元素儲液每IL由 1.5g 的 FeCl2、70mg 的 ZnCl2、6mg 的硼酸 0.1g 的 MnCl2.4H20、2mg 的 CuCl2.2H20、0.19g的 CoCl2.6H20、24mg 的 NiCl2.6H20、36mg 的 Na2MO4.H20、15mg 的 Na2WO4.2H20 和 15mg 的Na2SeO4.5H20 組成； 步驟三中所述的丙酮丁醇梭菌，其種子液接種量是按體積百分含量為2%的生長至對數(shù)期、600nm條件下OD值為1.0的液體懸濁液。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法，其特征在于步驟二中所述的將綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液按體積比為3:1的比例混合。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法，其特征在于步驟三中所述的取上清液后濃縮是指采用減壓蒸餾的方法濃縮至上清液2~4倍濃度。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法，其特征在于步驟二中所述的在好氧發(fā)酵溫度為28~32°C、轉速為100~120r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4d。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發(fā)酵制備正丁醇的方法，其特征在于步驟三中所述的在水解體系pH值4.0~5.5、溫度為55~60°C的條件下對預處理的 木質纖維素進行酶水解48h。
【文檔編號】C12R1/145GK104004794SQ201410289117
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權日:2014年6月24日
【發(fā)明者】楊謙, 王震宇, 曹廣麗, 宋金柱, 趙磊, 馮麗平 申請人:哈爾濱工業(yè)大學