用于kir基因快速分型的引物、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種用于KIR基因快速分型的引物、含有該引物的試劑盒以及采用該引物和試劑盒進(jìn)行KIR基因快速分型的方法。本發(fā)明使用了KIR基因的特異性引物，增強了特異性的結(jié)合，完全可用于檢測目前已知的16個KIR等位基因。此外，本發(fā)明將特異性引物，dNTPs，PCR緩沖液和染料預(yù)先混合，大大節(jié)省了操作時間和工作量，具有快速、簡便、準(zhǔn)確、直觀的特點，在3小時內(nèi)即可完成整個基因的分型實驗，解決了KIR基因分型的問題。
【專利說明】用于KIR基因快速分型的引物、試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及用于KIR基因快速分型的引物、試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)基因編碼一族激活性和抑制性KIR受體，表達(dá)在NK細(xì)胞和部分T細(xì)胞表面，通過特異性識別靶細(xì)胞表面的MHC-1類分子，轉(zhuǎn)導(dǎo)激活或抑制信號，從而調(diào)節(jié)NK細(xì)胞和T細(xì)胞的活性，在抗感染、腫瘤監(jiān)測、移植免疫和自身免疫性疾病等方面發(fā)揮重要作用。KIR基因?qū)儆诔Ｈ旧w共顯性遺傳，位于人類染色體19ql3.42，長約100~200kb，具有高度多態(tài)性。目前已明確的KIR基因共16個，包括14個功能基因(KIR2DL1-5、KIR3DL1-3、KIR2DS1-5、KIR3DS1)和 2 個假基因(KIR2DPU KIR3DP1)，形成以KIR3DL2和KIR3DL3基因分列染色體端粒端和著絲粒端，KIR2DL和KIR3DP1基因居中的框架格局，各KIR基因的規(guī)律組合又可形成KIR基因A和B兩種單倍型。KIR基因的表達(dá)產(chǎn)物——KIR受體對NK細(xì)胞和部分T細(xì)胞活性調(diào)節(jié)起著重要作用，故檢測KIR基因?qū)Ω腥?、腫瘤和自身免疫病發(fā)病機制的探討、發(fā)病預(yù)測、治療及造血干細(xì)胞移植都具有臨床指導(dǎo)意義。
[0003]1997年Uhrberg等首次建立了采用PCR-SSP方法檢測KIR基因。隨后又出現(xiàn)了序列特異性寡核苷酸探針聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSOP)、RT-PCR等檢測方法。但這些方法都存在一定的局限性，主要表現(xiàn)在PCR-SSOP與RT-PCR方法需要特定的儀器，且試劑、耗材較貴。雖然，總的來說PCR-SSP是一種相對簡單方便、特異性高的方法，且目前已有基于PCR-SSP方法進(jìn)行單特異引物檢測KIR的試劑盒，但因其采用的均是既往的引物，因而不能檢測出近年來新發(fā)現(xiàn)的KIR基因的等位基因和座位，且其擴增產(chǎn)物多為長片段，對樣本基因組DNA的要求也高，存在漏檢和誤檢的可能，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對KIR基因獲得中高分辨率的分型結(jié)果的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，基于最新的KIR基因數(shù)據(jù)庫，重新設(shè)計了 KIR基因的PCR-SSP分型方法并建立了一套結(jié)果判讀格局圖。本發(fā)明的分型方法準(zhǔn)確可行，與長片段擴增KIR基因的PCR-SSP分型法相比，其對KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3和KIR2DS1等基因均可獲得中高分辨的分型結(jié)果。
[0005]為此，本發(fā)明一方面提供了一種用于KIR基因快速分型的引物，其包含SEQ IDN0.1-46 所示的檢測引物 KP-Ol、KP-02、KP-03、......、ΚΡ_46，其中檢測引物 KP-Ol 和 ΚΡ-02
組成一組，依次按照順序兩兩組合，組成23組引物組。
[0006] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，該引物還進(jìn)一步包含SEQ ID N0.47和SEQ ID N0.48所示的內(nèi)對照引物NCXF和NCXR。
[0007]本發(fā)明另一方面提供了一種用于KIR基因快速分型的試劑盒，其包含PCR反應(yīng)混合液和Taq酶，所述PCR反應(yīng)混合液分別包含如上所述的23組引物組，所述Taq酶的濃度優(yōu)選為5υ/μ L。
[0008]在本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案中，該試劑盒中用于KIR基因快速分型的引物KP-01、KP-02、KP-03、......、ΚΡ-46 的濃度均為 0.5 μ Μ。
[0009]在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，該試劑盒的PCR反應(yīng)混合液中進(jìn)一步包含如上所述的內(nèi)對照引物。
[0010]在本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案中，該試劑盒中內(nèi)對照引物NCXF和NCXR的濃度均為 0.2 μ Μ。
[0011]在本發(fā)明再一優(yōu)選的實施方案中，該試劑盒的PCR反應(yīng)混合液中進(jìn)一步包含dNTPs,染料和PCR緩沖液，染料進(jìn)一步優(yōu)選為甲酚紅。
[0012]在本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案中，該試劑盒中dNTPs濃度為0.2mM，染料濃度為0.01%,PCR緩沖液組成為=Tris-HCL濃度10mM，氯化鉀濃度50mM，氯化鎂濃度1.5mM,明膠濃度 0.001%。
[0013]本發(fā)明另一方面提供了一種對KIR基因進(jìn)行快速分型的方法，其包含以下步驟:
[0014]1、提取待檢測樣品的DNA溶液；
[0015]2、采用如上所述的引物或采用如上所述的試劑盒，以步驟I中提取的DNA溶液作為模板，進(jìn)行PCR擴增； [0016]3、PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后，進(jìn)行結(jié)果判讀，當(dāng)電泳結(jié)果均出現(xiàn)與目標(biāo)片段大小一致的條帶時，表明該基因為KIR基因陽性，否則表明該基因為KIR基因陰性。
[0017]本發(fā)明再一方面提供了如上所述的引物或如上所述的試劑盒在KIR基因快速分型中的應(yīng)用。
[0018]由上述描述可知，本發(fā)明基于PCR-SSP技術(shù)開發(fā)的KIR基因分型試劑盒，由于使用了特異性引物，因此相比現(xiàn)有其他檢測方法而言，具有快速、簡便、準(zhǔn)確、直觀的特點，實驗成本低，且僅需微量檢材即可完成實驗檢測所需。同時，本發(fā)明的檢測試劑盒可以很直觀的根據(jù)擴增后電泳的條帶的判讀，即可判斷KIR的等位基因型別，從而完成KIR基因的分型。
[0019]此外，本發(fā)明將引物，dNTPs, PCR緩沖液和染料預(yù)先混合，可大大節(jié)省實驗者的操作時間和工作量。將等位基因的多對引物混合同時擴增，滿足高通量的實驗需求，直接得出分型和篩查結(jié)果，具有靈敏、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、高效的特點。在擁有合格DNA樣品的情況下，本發(fā)明在3小時內(nèi)即可完成整個基因的分型實驗，解決了 KIR基因分型的問題。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1:KIR基因陽性樣品凝膠電泳圖，其中圖1上的號碼對應(yīng)于圖2判讀格局圖中相應(yīng)的孔號。
[0021]圖2 =KIR-SSP結(jié)果判讀格局圖。
【具體實施方式】
[0022]下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，旨在用于說明本發(fā)明而非限定本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0023]實施例1:制備快速檢測KIR基因的試劑盒[0024]1、引物的合成
[0025]引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列分別如SEQ ID N0.1-46所示。
[0026]同時，為了保證反應(yīng)體系的正常進(jìn)行，還設(shè)計了一對上下游引物NCXF(SEQ IDN0.47)和NCXR(SEQ ID N0.48)，作為內(nèi)對照引物，其擴增片段大小為790bp。
[0027]具體序列情況如表1所示
[0028]表1.快速檢測KIR基因的引物
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一種用于KIR基因快速分型的引物，其包含SEQ ID N0.1_46所示的檢測引物KP-01、ΚΡ-02、ΚΡ-03、……、ΚΡ-46，其中檢測引物KP-Ol和ΚΡ-02組成一組，依次按照順序兩兩組合，組成23組引物組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其進(jìn)一步包含SEQID N0.47和SEQ IDN0.48所示的內(nèi)對照引物NCXF和NCXR。
3.一種用于KIR基因快速分型的試劑盒，其包含PCR反應(yīng)混合液和Taq酶，所述PCR反應(yīng)混合液分別包含權(quán)利要求1所述的23組引物組，所述Taq酶的濃度優(yōu)選為5U/y L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中用于KIR基因快速分型的引物KP-01、ΚΡ-02、ΚΡ-03、......、ΚΡ-46 的濃度均為 0.5 μ M0
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其中PCR反應(yīng)混合液中進(jìn)一步包含權(quán)利要求2所述的內(nèi)對照引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中內(nèi)對照引物NCXF和NCXR的濃度均為0.2 μ Μ。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6任一項所述的試劑盒，其中PCR反應(yīng)混合液中進(jìn)一步包含dNTPs,染料和PCR緩沖液，染料優(yōu)選為甲酚紅。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中dNTPs濃度為0.2mM,染料濃度為0.01 %，PCR緩沖液組成為=Tris-HCL濃度10mM，氯化鉀濃度50mM，氯化鎂濃度1.5mM,明膠濃度0.001 %。
9.一種對KIR基因進(jìn)行快速分型的方法，其包含以下步驟: (1)提取待分型樣品的DNA溶液， (2)采用權(quán)利要求1或2所述的引物，或采用權(quán)利要求3至8中任一項所述的試劑盒，以步驟(1)中提取的DNA溶液作為模板，進(jìn)行PCR擴增； (3)PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后，進(jìn)行結(jié)果判讀，當(dāng)電泳結(jié)果均出現(xiàn)與目標(biāo)片段大小一致的條帶時，表明該基因為KIR基因陽性，否則表明該基因為KIR基因陰性。
10.權(quán)利要求1或2所述的引物，或者權(quán)利要求3至8中任一項所述的試劑盒在KIR基因快速分型中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104032025SQ201410293463
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】潘捷, 鄭仲征, 田石磊 申請人:上海荻碩貝肯生物科技有限公司