蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)了蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在制備促進(jìn)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明證明在乳腺癌組織中PRMT7異常高表達(dá)，并且PRMT7能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。而干涉PRMT7可以抑制EMT，降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，PRMT7可以作為靶點(diǎn)應(yīng)用于癌癥的治療中。
【專利說(shuō)明】蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是被廣泛關(guān)注和重視的大眾性健康疾病，其發(fā)病群體主要是女性，當(dāng)然現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)少部分男性也是發(fā)病群體，乳腺癌由于是女性第二大高發(fā)性癌癥，并具有較高的致死率而受到社會(huì)大眾的關(guān)注。乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。
[0003]蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7 (PRMT7)，具有兩個(gè)AdoMet結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域，對(duì)于不同的底物具有不同的酶活性，能催化纖維蛋白發(fā)生單甲基化。PRMT7能影響藥物誘導(dǎo)的敏感性，與CTCFL相作用介導(dǎo)雄性精子的基因印記。經(jīng)過(guò)對(duì)1200例乳腺癌樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)移相關(guān)染色體區(qū)位分析發(fā)現(xiàn)，16q22、17q21_23、17q25和20qll等染色體區(qū)域可能是潛在的轉(zhuǎn)移啟動(dòng)基因，而16q22就是 PRMT7所在的區(qū)域。目前對(duì)于PRMT7功能的研究還非常有限，PRMT7參與鼠胚胎干細(xì)胞以及精子細(xì)胞多潛能性的維持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，本發(fā)明證明在乳腺癌組織中蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7 (PRMT7)異常高表達(dá)，并且PRMT7能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而干涉PRMT7可以抑制EMT，降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
[0005]本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在制備促進(jìn)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0006]或，
[0007]蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在制備促進(jìn)細(xì)胞侵襲和/或遷移的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0008]蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7作為靶點(diǎn)在制備抑制細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0009]或，
[0010]蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7作為靶點(diǎn)在制備抑制細(xì)胞侵襲和/或遷移的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011 ] 上述任一所述的應(yīng)用中,所述細(xì)胞為癌細(xì)胞，具體為乳腺癌細(xì)胞。
[0012]蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在制備促進(jìn)癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013]蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7作為靶點(diǎn)在制備抑制癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014]上述任一所述的應(yīng)用中，所述癌細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞。
[0015]蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在制備預(yù)防和/或治療乳腺癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016]蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7的抑制劑在制備抑制細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、抑制細(xì)胞侵襲和/或遷移、抑制癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、治療癌癥的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017]上述應(yīng)用中，所述抑制劑為能干擾蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的siRNA,具體為SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9退火片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0018]上述任一所述的應(yīng)用中,所述細(xì)胞為癌細(xì)胞,具體為乳腺癌細(xì)胞；
[0019]所述癌為乳腺癌。
[0020]上述任一所述的應(yīng)用中，所述蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7的氨基酸序列如SEQ IDN0.4所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3中自5’末端起第17位至第2095位所示。
[0021]本發(fā)明證明PRMT7可以作為靶點(diǎn)應(yīng)用于癌癥的治療。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為PRMT7在惡性能力不同的細(xì)胞系中的表達(dá)情況。
[0023]圖2 為 MCFlOA 中過(guò)表達(dá) PRMT7。
[0024]圖3為PRMT7-MCF10A細(xì)胞中表皮和間質(zhì)marker的變化情況。 [0025]圖4為免疫熒光檢測(cè)PRMT7-MCF10A細(xì)胞中表皮和間質(zhì)marker的變化情況。
[0026]圖5為PRMT7-MCF10A的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的體外檢測(cè)。
[0027]圖6為siPRMT7-MDA-MB_231細(xì)胞中表皮和間質(zhì)marker的變化情況。
[0028]圖7為免疫熒光檢測(cè)siPRMT-MDA-MB-231細(xì)胞系表皮和間質(zhì)marker的變化。
[0029]圖8為劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siPRMT7-MDA-MB_231細(xì)胞的遷移能力。
[0030]圖9為siPRMT7抑制MDA_MB_231細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
[0031]圖10為PRMT7誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞發(fā)生EMT。
[0032]圖11為PRMT7促進(jìn)乳腺癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0034]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035]PRMT7-p3 X Flag-myc-CMV-23 在文獻(xiàn) “Graydon B.Gonsalvez, Liping Ti an, Jason
K.0spina, Franfois -Michel Boisvert, Angus 1.Lamond,and A.Gregory Matera, Twodistinct arginine methyltransferases are required for b1genesis of Sm—classribonucleoproteins.The Journal of Cell B1logy Vol.178N0.5August27，2007733 - 740，，中公開(kāi)過(guò)，公眾可從東北師范大學(xué)獲得。
[0036]MSCV2.2-1RES-GFP 在文獻(xiàn)“Kofoed, E.M.Vance, R.E.1nnate immune recognit1nof bacterial ligands by NAIPs determines inflammasome specificity.Nature2011 ；477:592-5.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從東北師范大學(xué)獲得。
[0037]PRMT7-MSCV2.2-1RES-GFP 質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程如下:
[0038]一、設(shè)計(jì)并合成如下引物:
[0039]上游引物:5’-ATAAGAATGCGGCCGCATGAAGATCTTCTGCAGTCGGG-3> (SEQ ID N0.1)[0040](下劃線所示序列為NotI酶切識(shí)別位點(diǎn))
[0041]下游引物:5’-ACGCGTCGACTCAGTCTGGGGTATCTGCATGCCT-3’ (SEQ ID N0.2)
[0042](下劃線所示序列為SalI酶切位點(diǎn))
[0043]二、以 PRMT7-p3 XFlag-myc-CMV-23 為模板，以上游引物(SEQ ID N0.1)和下游引物(SEQ ID N0.2)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如SEQ ID N0.3所示。SEQ ID N0.3中自5’末端起第17位至第2095位核苷酸所示的序列為PRMT7的編碼基因序列，PRMT7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0044]三、用NotI和SalI雙酶切SEQ ID N0.3所示的DNA分子，得到基因序列；NotI和SalI雙酶切MSCV2.2-1RES-GFP，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，并將其命名為 PRMT7-MSCV2.2-1RES-GFP,將 PRMT7-MSCV2.2-1RES-GFP 送測(cè)序，結(jié)果正確。
[0045]PWPXLD 購(gòu)自 addgene，產(chǎn)品目錄號(hào)為 12258。
[0046]PWPXLD-PRMT7的構(gòu)建過(guò)程如下:
[0047]一、設(shè)計(jì)并合成如下引物:
[0048]上游引物:5’-AGCTTTGTTTAAACATGAAGATCTTCTGCAGTCGGG-3> (SEQ ID N0.5)
[0049](下劃線所示序列為PmeI酶切識(shí)別位點(diǎn))
[0050]下游引物:5’-GACTAGTTCAGTCTGGGGTATCTGCATGCCT-3> (SEQ ID N0.6)
[0051](下劃線所示序列為SpeI酶切識(shí)別位點(diǎn))
[0052]二、以 PRMT7-p3 XFlag-myc-CMV-23 為模板，以上游引物(SEQ ID N0.5)和下游引物(SEQ ID N0.6)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如SEQ ID N0.7所示。
[0053]三、PmeI和SpeI雙酶切SEQ ID N0.7所示的DNA分子，得到基因序列；用PmeI和SpeI雙酶切PWPXLD，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段鏈接，得到重組質(zhì)粒，并將其命名為PWPXLD-PRMT7，將PWPXLD-PRMT7送測(cè)序，結(jié)果正確。
[0054]pEN_hHlc 購(gòu)自 ATCC,產(chǎn)品目錄號(hào)為 10326368。
[0055]pDSL-hpUGIP 購(gòu)自 ATCC,產(chǎn)品目錄號(hào)為 10326373。
[0056]LR Clonase? II enzyme mix 購(gòu)自 Invitrogen,產(chǎn)品目錄號(hào)為 11791-100。
[0057]干涉質(zhì)粒pDSL_shPRMT7的構(gòu)建過(guò)程如下:
[0058]一、設(shè)計(jì)并合成如下序列:
[0059]5’-GATCCCCGGAACAAGCTATTTCCCATCCTTCAAGAGAGGATGGGAAATAGCTTGTTCCTTTTTC-3’ (SEQ ID N0.8)
[0060](下劃線所示 序列為BamHI酶切識(shí)別位點(diǎn)的粘性末端)
[0061 ] 5’-TCGAGAAAAAGGAACAAGCTATTTCCCATCCTCTCTTGAAGGATGGGAAATAGCTTGTTCCGGG-3’ (SEQ ID N0.9)
[0062](下劃線所示序列為XhoI酶切識(shí)別位點(diǎn)的粘性末端)
[0063]二、用超純水或TE buffer稀釋互補(bǔ)的寡核苷酸鏈SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9使其終濃度均為50 μ mol/L,各取25 μ L混勻放入95°C水浴5min，隨即關(guān)閉水浴自然降溫至室溫使互補(bǔ)的寡核苷酸鏈退火，得到退火片段。
[0064]三、BamHI和XhoI雙酶切Entry載體pEN_hHlc，得到載體大片段；將退火片段與載體大片段連接，得到質(zhì)粒，將其命名為pEN-shPRMT7，將pEN-shPRMT7送測(cè)序，結(jié)果正確。[0065]四、利用重組酶將構(gòu)建好的pEN_shPRMT7與目的載體pDSL_hpUGIP重組，過(guò)程如表I所示，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pDSL-shPRMT7，將其送測(cè)序，結(jié)果正確。
[0066]表1重組過(guò)程
[0067]
【權(quán)利要求】
1.蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在制備促進(jìn)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或， 蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在制備促進(jìn)細(xì)胞侵襲和/或遷移的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7作為靶點(diǎn)在制備抑制細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或， 蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7作為靶點(diǎn)在制備抑制細(xì)胞侵襲和/或遷移的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述細(xì)胞為癌細(xì)胞，具體為乳腺癌細(xì)胞。
4.蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在制備促進(jìn)癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.蛋白質(zhì)精氧酸甲基轉(zhuǎn)移 酶7作為革巴點(diǎn)在制備抑制癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的廣品中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述癌細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞。
7.蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7在制備預(yù)防和/或治療乳腺癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
8.蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7的抑制劑在制備抑制細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、抑制細(xì)胞侵襲和/或遷移、抑制癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、治療癌癥的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述抑制劑為能干擾蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的siRNA，具體為SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9退火片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述細(xì)胞為癌細(xì)胞，具體為乳腺癌細(xì)胞； 所述癌為乳腺癌。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104031884SQ201410293805
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】陸軍, 張瑜, 姚若斯, 姜浩, 李曉雪, 黃百渠 申請(qǐng)人:東北師范大學(xué)