一種去除糜蛋白酶中的內(nèi)毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種去除糜蛋白酶中的內(nèi)毒素的方法。該方法包括下述步驟：將糜蛋白酶濾餅溶解于水中，超濾濃縮得到濃縮液，依次加入磷酸鹽水溶液和鈣鹽水溶液，調(diào)節(jié)pH值為8～9，離心，即可。本發(fā)明的在糜蛋白酶生產(chǎn)過程中去除內(nèi)毒素的方法，在不影響糜蛋白酶活性、收率的前提下，有效地去除糜蛋白酶生產(chǎn)中含有的內(nèi)毒素污染物，目前已經(jīng)應(yīng)用于糜蛋白酶原料藥生產(chǎn)，內(nèi)毒素含量符合2010版中國藥典要求。
【專利說明】一種去除糜蛋白酶中的內(nèi)毒素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種去除糜蛋白酶中的內(nèi)毒素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糜蛋白酶作為一類肽鏈內(nèi)切酶，其在創(chuàng)傷手術(shù)后愈合、抗炎、眼科手術(shù)等方面被廣泛應(yīng)用；同時作為一種肌內(nèi)注射藥品，為保障其臨床應(yīng)用安全性，2010版藥典規(guī)定每I單位糜蛋白酶中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.075EU。內(nèi)毒素產(chǎn)生于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞外壁，其主要成份是脂多糖(LPS)及類脂A，是熱原的活性部分。它們的相對分子質(zhì)量一般為I萬~
2.5萬，在水溶液中形成締合體，相對分子質(zhì)量可達(dá)50萬~100萬。其具有耐熱性和化學(xué)穩(wěn)定性，不易被除滅。注入人體的注射劑中含有熱原量達(dá)I μ g/kg就可引起不良反應(yīng)，發(fā)熱反應(yīng)通常在注入1小時后出現(xiàn)，可使人體產(chǎn)生發(fā)冷、寒顫、發(fā)熱、出汗、惡心、嘔吐等癥狀，有時體溫可升至40°C以上，嚴(yán)重者甚至昏迷、虛脫，如不及時搶救，可危及生命。因此，在生物制品生產(chǎn)過程中，需要有嚴(yán)格的工藝控制策略對內(nèi)毒素進(jìn)行去除或限量控制。
[0003]目前，水溶液中常用的內(nèi)毒素去除方法主要有如下幾種:
[0004]1、超濾 [0005]內(nèi)毒素具有較大的相對分子質(zhì)量，因此，可選用超濾膜去除水中的內(nèi)毒素。在使用超濾方法去除內(nèi)毒素時需要根據(jù)被處理藥物的相對分子質(zhì)量、特性選擇超濾膜的孔徑及材質(zhì)，因此該方法不具備通用性。另外，內(nèi)毒素并不以單一分子存在，而是以相對分子質(zhì)量不等的集聚體存在，因此大小不一，這也給超濾法去除內(nèi)毒素帶來了挑戰(zhàn)。
[0006]2、活性炭吸附法
[0007]活性炭吸附是一種較早用于內(nèi)毒素去除的方法，但是，由于活性炭選擇性差，在吸附內(nèi)毒素的同時吸附有效活性成分，影響產(chǎn)品收率。
[0008]3、化學(xué)降解法
[0009]化學(xué)降解法是指用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或氧化劑等使內(nèi)毒素降解以達(dá)到去除內(nèi)毒素的目的，這種方法有可能造成有效成分的降解或失活，因此，該方法的使用需結(jié)合產(chǎn)品的理化性質(zhì)。
[0010]4、離子交換色譜法
[0011]離子交換色譜法是根據(jù)內(nèi)毒素帶有部分負(fù)電荷的性質(zhì)，用陰離子交換色譜來去除內(nèi)毒素，但這種方法不適合于溶液中存在其它帶負(fù)電荷物質(zhì)的情況。
[0012]蛋白質(zhì)種類較多，其分離純化步驟各不相同，不同終產(chǎn)品對內(nèi)毒素含量要求也有差異，因此，去除內(nèi)毒素的方法和效果無法完全通用。糜蛋白酶作為一種活性蛋白酶類藥物，其具有易失活、不穩(wěn)定的特點(diǎn)，在內(nèi)毒素去除過程中保證其本身性質(zhì)及有效活性成分不受影響至關(guān)重要，這也是本領(lǐng)域長期以來存在的、難以克服的技術(shù)難題。在糜蛋白酶內(nèi)毒素去除方法選擇過程中，超濾法因糜蛋白酶分子量較大而無法應(yīng)用，活性炭吸附法專一性不強(qiáng)，化學(xué)降解法極易造成糜蛋白酶失活，色譜法耗時較長，不利于糜蛋白酶穩(wěn)定。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于為了克服現(xiàn)有技術(shù)中糜蛋白酶中的內(nèi)毒素?zé)o法去除徹底、易造成糜蛋白酶失活、耗時較長的缺陷，而提供了一種去除糜蛋白酶中的內(nèi)毒素的方法。本發(fā)明的方法將超濾與磷酸鈣沉淀聯(lián)合使用，可以有效除去內(nèi)毒素，且不會影響糜蛋白酶的活性，適用于大規(guī)模條件下除去蛋白質(zhì)中的內(nèi)毒素。
[0014]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的:
[0015]本發(fā)明提供了一種去除糜蛋白酶中的內(nèi)毒素的方法，其包括下述步驟:將糜蛋白酶濾餅溶解于水中，超濾濃縮得到濃縮液，依次加入磷酸鹽水溶液和鈣鹽水溶液，調(diào)節(jié)PH值為8~9,離心，即可。
[0016]其中，所述的糜蛋白酶濾餅可為本領(lǐng)域常規(guī)的糜蛋白酶處理方法得到的糜蛋白酶濾餅，一般經(jīng)過多步鹽析、結(jié)晶、過濾、活化、鹽析得到，較佳地通過下述步驟得到:將糜蛋白酶原料用水溶解，加入硫酸調(diào)節(jié)pH值為2~3，加入飽和硫酸銨溶液鹽析，加入磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為7.5~7.7，再加入胰蛋白酶進(jìn)行活化，用硫酸調(diào)節(jié)pH值為3.5~4.5，加入固體硫酸銨進(jìn)行鹽析，即得到糜蛋白酶濾餅。
[0017]所述的糜蛋白酶濾餅更佳地通過下述步驟制得:在糜蛋白酶原料中加入7倍量(v/w)純化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液調(diào)節(jié)pH值為2.8~3.2，攪拌，放置過夜，加
2.5mol/L H2SO4溶液調(diào)pH值為2.5~2.7，再加2倍量(v/w)飽和硫酸銨溶液攪拌均勻，再用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為4.9~5.1，置25°C恒溫箱，保溫48小時，布氏漏斗過濾，收集濾餅，濾液棄去，過濾所得濾餅，用3倍量(v/w)純化水溶解后，以I倍量(v/w)飽和硫酸銨鹽析，25°C保溫24小時，反復(fù)3次，后二次濾出母液，收集待用，濾餅待活化；將以上結(jié)晶后過濾的濾餅加入3倍量(v/w)純化水，并加2.5mol/L H2SO4溶液90ml助溶，待完全溶解后，布氏漏斗過濾，收集濾液，用2.5mol/L H2SO4溶液調(diào)濾液pH值至2.8~3.1 ;加5mol/LNaOH溶液調(diào)pH為7.4~7.7，再加入I倍量(v/w濾餅重)0.5mol/L、pH7.6的磷酸緩沖液，攪拌均勻得結(jié)晶物溶液，再按胰蛋白酶:結(jié)晶物溶液=5mg: 100mL的比例加入胰蛋白酶，置4°C冰箱中活化72小時，pH控制在7.6 ;將以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液調(diào)pH值為
3.9~4.1，測活化液體積，按500g/L加入固體硫酸銨進(jìn)行鹽析，放置過夜，次日布氏漏斗過濾，棄濾液，即得糜蛋白酶濾餅。
[0018]其中，所述的水與所述的糜蛋白酶濾餅的體積質(zhì)量比較佳地為8~12ml/g。
[0019]其中，所述的超濾濃縮采用的超濾膜較佳地為德國賽多利斯公司的Hydrosart超濾膜，截留相對分子質(zhì)量是5kDa或lOkDa。
[0020]其中，所述的超濾濃縮得到的濃縮液的體積較佳地為超濾濃縮前體積的0.1~
0.3 倍。
[0021]其中，所述的磷酸鹽可為本領(lǐng)域常規(guī)的可溶于水的各種磷酸鹽，較佳地為磷酸鈉和/或磷酸鉀。
[0022]其中，所述的鈣鹽可為本領(lǐng)域常規(guī)的可溶于水的各種鈣鹽，較佳地為醋酸鈣和/或氯化鈣。
[0023]其中，所述的磷酸鹽水溶液與所述的濃縮液的體積比較佳地為(0.1~0.2):1。
[0024]其中，所述的鈣鹽水溶液與所述的磷酸鹽水溶液的體積比較佳地為(0.5~0.7):
1[0025]其中，所述的磷酸鹽水溶液的濃度較佳地為0.2~0.5mol/L。
[0026]其中，所述的鈣鹽水溶液的濃度較佳地為0.8~1.5mol/L。
[0027]其中，所述的磷酸鹽與所述的鈣鹽的摩爾比較佳地為1:(0.5~2)，更佳地為1:
1.5。
[0028]其中，所述的離心的轉(zhuǎn)速較佳地為3000~4000rpm。
[0029]其中，所述的離心較佳地為冷凍離心10~30min，冷凍離心的溫度較佳地為4~10。。。
[0030]其中，所述的離心結(jié)束后還可進(jìn)行后處理；所述的后處理包括下述步驟:透析，加入硅藻土，過濾，凍干，即得成品。所述的透析的溫度較佳地為3~5°C。
[0031]在符合本領(lǐng)域常識 的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0032]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0033]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:
[0034](I)本發(fā)明先通過超濾方法大大減少了糜蛋白酶操作體積，同時，使糜蛋白酶溶液中內(nèi)毒素得到富集，有利于后續(xù)磷酸鈣沉淀內(nèi)毒素及透析、凍干，提高生產(chǎn)效率。
[0035](2)在磷酸鈣沉淀糜蛋白酶中的內(nèi)毒素技術(shù)方案中，磷酸鹽與鈣鹽的摩爾比為1:1.5時恰好完全反應(yīng)生成磷酸鈣沉淀，用以吸附內(nèi)毒素，后續(xù)經(jīng)離心操作除去沉淀復(fù)合物。過量的磷酸鹽或鈣鹽溶液不利于糜蛋白酶穩(wěn)定性，并且會影響后續(xù)終產(chǎn)品質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)(如熾灼殘?jiān)?。整個磷酸鈣沉淀內(nèi)毒素操作工序耗時30-60分鐘，極大降低了對糜蛋白酶活性的影響。
[0036](3)本發(fā)明的在糜蛋白酶生產(chǎn)過程中去除內(nèi)毒素的方法，在不影響糜蛋白酶活性、收率的前提下，有效地去除糜蛋白酶生產(chǎn)中含有的內(nèi)毒素污染物，目前已經(jīng)應(yīng)用于糜蛋白酶原料藥生產(chǎn)，內(nèi)毒素含量符合2010版中國藥典要求。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0038]實(shí)施例1
[0039]糜蛋白酶原料批號091269，產(chǎn)自內(nèi)蒙古集寧牛羊臟器加工部，糜蛋白酶糜原是新鮮牛胰臟經(jīng)硫酸浸泡、絞碎、鹽析結(jié)晶所得，其純度(質(zhì)量百分比)不應(yīng)低于30%。糜蛋白酶原料投料llOOg，加7倍量(v/w)純化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液290ml調(diào)節(jié)pH為
3.0，攪拌8小時后，放置過夜。次日攪拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液調(diào)pH為2.6，再加2倍量(v/w)飽和硫酸銨溶液攪拌均勻，再用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH為5.0，置25°C恒溫箱，保溫48小時，布氏漏斗過濾，收集濾餅，濾液棄去。過濾所得濾餅，用3倍量(v/w)純化水溶解后，以I倍量(v/w)飽和硫酸銨鹽析，25°C恒溫保溫24小時，反復(fù)3次，后二次濾出母液，收集待用，濾餅待活化。將以上結(jié)晶后過濾的濾餅置于不銹鋼桶內(nèi)，加入3倍量(v/w)純化水，并加2.5mol/LH2S04溶液90ml助溶。待完全溶解后，布氏漏斗過濾，收集濾液，用2.5mol/LH2SO4溶液調(diào)濾液pH至3.0，攪拌3小時。[0040]加5mol/L NaOH溶液調(diào)pH為7.6，再加入I倍量(v/w濾餅重)0.5mol/L、pH為7.6的磷酸緩沖液，攪拌均勻得結(jié)晶物溶液，測PH為7.6，再按比例(胰蛋白酶:結(jié)晶物溶液=5mg: 100ml)加入胰蛋白酶，置4°C冰箱中活化72小時，活化第二天應(yīng)注意其pH值，pH控制在7.6。
[0041]將以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液調(diào)pH為3.9，測活化液體積，按500g/L加入固體硫酸銨進(jìn)行鹽析，放置過夜，次日布氏漏斗過濾，棄濾液，收集濾餅1648g,加純化水16500ml溶解,過濾,收集濾液。用IOkD的超濾膜(型號:Hydrosart德國賽多利斯公司)進(jìn)行超濾濃縮，超濾后溶液體積為2400ml。緩慢加入240ml0.4mol/L的4°C磷酸三鈉溶液，攪拌，再緩慢加入144mllmol/L的4°C醋酸鈣溶液，攪拌，用2.5M NaOH調(diào)節(jié)pH至8.51，攪拌10分鐘后用3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速4°C離心20分鐘，后續(xù)溶液扎包，約100mL/包，4°C左右透析3天，每12小時換水一次(水溫控制在4°C左右)。
[0042]收集、合并透析液，加100g硅藻土，過濾，量取濾液體積，用折疊式過濾器(0.22 μ m孔徑濾膜、德國賽多利斯公司)過濾，調(diào)節(jié)pH為6.0，濾液裝盤(1000ml/盤)，送凍干機(jī)(上海東富龍科技股份有限公司)凍干得糜蛋白酶成品110201。
[0043]實(shí)施例2 [0044]糜蛋白酶原料批號091270，產(chǎn)自內(nèi)蒙古集寧牛羊臟器加工部，糜蛋白酶糜原是新鮮牛胰臟經(jīng)硫酸浸泡、絞碎、鹽析結(jié)晶所得，其質(zhì)量百分比純度不應(yīng)低于30%。糜蛋白酶原料投料llOOg，加7倍量(v/w)純化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液290ml調(diào)節(jié)pH為3.1，攪拌8小時后，放置過夜。次日攪拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液調(diào)pH為2.5，再加2倍量(v/w)飽和硫酸銨溶液攪拌均勻，再用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH為4.9，置25°C恒溫箱，保溫48小時，布氏漏斗過濾，收集濾餅，濾液棄去。過濾所得濾餅，用3倍量(v/w)純化水溶解后，以I倍量(v/w)飽和硫酸銨鹽析，25°C恒溫保溫24小時，反復(fù)3次，后二次濾出母液，收集待用，濾餅待活化。將以上結(jié)晶后過濾的濾餅置于不銹鋼桶內(nèi)，加入3倍量(v/w)純化水，并加2.5mol/L H2SO4溶液IlOml助溶。待完全溶解后，布氏漏斗過濾，收集濾液，用2.5mol/L H2SO4溶液調(diào)濾液pH至2.9，攪拌3小時。
[0045]加5mol/L NaOH溶液調(diào)pH為7.6，再加入I倍量(v/w濾餅重)0.5mol/L、pH為7.6的磷酸緩沖液，攪拌均勻得結(jié)晶物溶液，測PH為7.6，再按比例(胰蛋白酶:結(jié)晶物溶液=5mg: 100ml)加入胰蛋白酶，置4°C冰箱中活化72小時，活化第二天應(yīng)注意其pH值，pH控制在7.6。
[0046]將以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液調(diào)pH為4.1，測活化液體積，按500g/L加入固體硫酸銨進(jìn)行鹽析，放置過夜，次日布氏漏斗過濾，棄濾液，收集濾餅1895g,加純化水18950ml溶解，過濾，收集濾液。用5kD的超濾膜(型號:HydroSart德國賽多利斯公司)進(jìn)行超濾濃縮，超濾后溶液體積為2800ml。緩慢加入300ml0.4mol/L的4°C磷酸三鈉溶液，攪拌，再緩慢加入180mllmol/L的4°C醋酸鈣溶液，攪拌，用2.5M NaOH調(diào)節(jié)pH至8.00，攪拌10分鐘后用3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速冷凍離心20分鐘，后續(xù)溶液扎包，約100mL/包，4°C左右透析3天，每12小時換水一次(水溫控制在4°C左右)。
[0047]收集、合并透析液，加100g硅藻土，過濾，量取濾液體積，用折疊式過濾器(0.22 μ m孔徑濾膜、德國賽多利斯公司)過濾，調(diào)節(jié)pH為6.0，濾液裝盤(1000ml/盤)，送凍干機(jī)(上海東富龍科技股份有限公司)凍干得糜蛋白酶成品110202。[0048]實(shí)施例3
[0049]糜蛋白酶原料批號091271，產(chǎn)自內(nèi)蒙古集寧牛羊臟器加工部，糜蛋白酶糜原是新鮮牛胰臟經(jīng)硫酸浸泡、絞碎、鹽析結(jié)晶所得，其質(zhì)量百分比純度不應(yīng)低于30%。糜蛋白酶原料投料llOOg，加7倍量(v/w)純化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液290ml調(diào)節(jié)pH為2.9，攪拌8小時后，放置過夜。次日攪拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液調(diào)pH為2.5，再加2倍量(v/w)飽和硫酸銨溶液攪拌均勻，再用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH為5.0，置25°C恒溫箱，保溫48小時，布氏漏斗過濾，收集濾餅，濾液棄去。過濾所得濾餅，用3倍量(v/w)純化水溶解后，以I倍量(v/w)飽和硫酸銨鹽析，25°C恒溫保溫24小時，反復(fù)3次，后二次濾出母液，收集待用，濾餅待活化。將以上結(jié)晶后過濾的濾餅置于不銹鋼桶內(nèi)，加入3倍量(v/w)純化水，并加2.5mol/L H2SO4溶液100mL助溶。待完全溶解后，布氏漏斗過濾，收集濾液，用2.5mol/L H2SO4溶液調(diào)濾液pH至2.9，攪拌3小時。
[0050]加5mol/L NaOH溶液調(diào)pH為7.6，再加入I倍量(v/w濾餅重)0.5mol/L、pH為7.6的磷酸緩沖液，攪拌均勻得結(jié)晶物溶液，測PH為7.6，再按比例(胰蛋白酶:結(jié)晶物溶液=5mg: 100ml)加入胰蛋白酶，置4°C冰箱中活化72小時，活化第二天應(yīng)注意其pH值，pH控制在7.6。
[0051]將以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液調(diào)pH為4.1，測活化液體積，按500g/L加入固體硫酸銨進(jìn)行鹽析，放置過夜，次日布氏漏斗過濾，棄濾液，收集濾餅1850g,加純化水18000ml溶解，過濾，收集濾液。用IOkD的超濾膜(型號=Hydrosart賽多利斯、德國賽多利斯公司)進(jìn)行超濾濃縮，超濾后溶液體積為2500ml。緩慢加入480ml0.4mol/L的4°C磷酸三鈉溶液，攪拌，再緩慢加入288ml lmol/L的4°C醋酸鈣溶液，攪拌，用2.5M NaOH調(diào)節(jié)pH至
9.00，攪拌10分鐘后 用3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速冷凍離心20分鐘，后續(xù)溶液扎包，約100mL/包，4°C左右透析3天，每12小時換水一次(水溫控制在4°C左右)。
[0052]收集、合并透析液，加100g硅藻土，過濾，量取濾液體積，用折疊式過濾器(0.22 μ m孔徑濾膜、德國賽多利斯公司)過濾，調(diào)節(jié)pH為6.0，濾液裝盤(1000ml/盤)，送凍干機(jī)(上海東富龍科技股份有限公司)凍干得糜蛋白酶成品110203。
[0053]實(shí)施例4
[0054]實(shí)施例1~3中的三批次糜蛋白酶內(nèi)毒素檢測均按照2010版中國藥典二部XIE “細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”。即采用鱟試劑法來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量是否符合規(guī)定，檢測結(jié)果如下表1所示，其中陰性對照品為注射用水，陽性對照品為內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(購于中國食品藥品檢定研究院)。
[0055]表1三批糜蛋白酶成品內(nèi)毒素檢測結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種去除糜蛋白酶中的內(nèi)毒素的方法，其包括下述步驟:將糜蛋白酶濾餅溶解于水中，超濾濃縮得到濃縮液，依次加入磷酸鹽水溶液和鈣鹽水溶液，調(diào)節(jié)PH值為8~9，離心，即可。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的糜蛋白酶濾餅通過下述步驟得到:將糜蛋白酶原料用水溶解，加入硫酸調(diào)節(jié)PH值為2~3，加入飽和硫酸銨溶液鹽析，加入磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為7.5~7.7，再加入胰蛋白酶進(jìn)行活化，用硫酸調(diào)節(jié)pH值為3.5~4.5，加入固體硫酸銨進(jìn)行鹽析，即得到糜蛋白酶濾餅。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水與所述的糜蛋白酶濾餅的體積質(zhì)量比為8~12ml/g ； 和/或，所述的超濾濃縮采用的超濾膜為德國賽多利斯公司的Hydrosart超濾膜，截留相對分子質(zhì)量是5kDa或IOkDa ； 和/或，所述的超濾濃縮得到的濃縮液的體積為超濾濃縮前體積的0.1~0.3倍。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽為磷酸鈉和/或磷酸鉀； 和/或，所述的鈣鹽為醋酸鈣和/或氯化鈣。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽水溶液與所述的濃縮液的體積比為(0.1~0.2):1 ； 和/或，所述的鈣鹽水溶液與所述的磷酸鹽水溶液的體積比為(0.5~0.7):1。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽水溶液的濃度為0.2~0.5mol/L； 和/或，所述的鈣鹽水溶液的濃度為0.8~1.5mol/L。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽與所述的鈣鹽的摩爾比為1:(0.5 ~2)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽與所述的鈣鹽的摩爾比為1:1.5。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的離心的轉(zhuǎn)速為3000~4000rpm。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的離心為冷凍離心10~30min;所述的冷凍離心的溫度較佳地為4~10°C。
【文檔編號】C12N9/76GK104017793SQ201410294578
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】黃臻輝, 周建華, 周偉潔, 琚姝, 王克平 申請人:上海第一生化藥業(yè)有限公司