一種重組工程介導(dǎo)的苜蓿中華根瘤菌Rm1021基因敲除方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組工程介導(dǎo)的苜蓿中華根瘤菌Rm1021基因敲除方法。具體實施步驟為首先通過重疊－延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得兩側(cè)為針對待敲除基因的約500bp同源片段、中間為卡那霉素抗性基因的融合DNA片段。其次將此DNA片段電轉(zhuǎn)化至異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組酶表達(dá)的Rm1021細(xì)胞中，在卡那霉素抗性篩選之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因而獲得基因敲除變株。最后將菌株在含0.4％蔗糖的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以消除含重組酶基因的質(zhì)粒。所使用的重組酶基因來源于λ噬菌體并克隆在質(zhì)粒pLS2406之上，pLS2406同時含有負(fù)篩選標(biāo)記sacB基因。
【專利說明】-種重組工程介導(dǎo)的苜蓿中華根瘤菌Rm1021基因敲除方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一種重組工程介導(dǎo)的苜蓿中華根瘤菌 Rml021基因敲除方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展，能源問題成為日益突出的世界性問題，各國對能源的需求 越來越迫切。如何最大效率地獲取自然界現(xiàn)存的能源是能源研究和開發(fā)領(lǐng)域的關(guān)鍵之一。 氮源是重要的資源，農(nóng)用飼料和肥料中重要成分為氮的銨鹽占據(jù)很大的比例。78%的空氣 為氮氣，而氮氣為惰性氣體，N-N健高度不活潑，常規(guī)的化學(xué)反應(yīng)難以將氮氣轉(zhuǎn)化為有效的 銨鹽。因此，如能有效地利用空氣中的氮資源是獲得能源的關(guān)鍵。
[0003] 固氮微生物是指能夠?qū)⒌獨庖曰衔锏男问焦潭ㄔ谂c其共生的植物根部并形成 根瘤的一類微生物。根瘤菌是最常見的一種生物固氮菌。根瘤菌和紫花苜蓿共生，通過結(jié) 瘤基因的時序表達(dá)，誘導(dǎo)宿主紫花苜蓿形成根瘤，從而將大氣中惰性的分子氮轉(zhuǎn)化成可被 植物吸收利用的化合物形式的氮。苜蓿中華根瘤菌Rml021是最為重要的一種根瘤菌，屬革 蘭氏陰性細(xì)菌。由于其強大的生物固氮能力，Rml021的生物學(xué)研究較為透徹。
[0004] Rml021的基因組已于2003年測序和解析，但海量的基因組信息遠(yuǎn)未得到充分利 用，仍有許多的基因功能未能闡明。研究基因功能的一個關(guān)鍵方法是構(gòu)建此基因敲除的變 株，通過變株與原株在許多條件下的比較可以得出相應(yīng)基因的生物學(xué)功能。
[0005] 目前Rml021基因敲除最為常規(guī)的方法是三親結(jié)合轉(zhuǎn)移法。其實驗步驟是首先PCR 獲得并克隆待敲除基因兩側(cè)的約1. Okb的同源片段，克隆至含負(fù)篩選標(biāo)記sacB的質(zhì)粒上 后，將含此敲除的重組質(zhì)粒的大腸桿菌、含tra基因（行使基因的轉(zhuǎn)移的功能）的但不同抗 性的大腸桿菌菌株和Rml021這三個菌株混合，在含重組質(zhì)粒抗性的平板上，篩選在菌株的 重組功能作用下利用一側(cè)同源片段整合至基因組上的整合型菌株。sacB基因編碼的蔗糖 6_果糖基轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖生成對菌株有毒性的聚蔗糖，利用含sacB基因的質(zhì)粒不能在含 蔗糖的培養(yǎng)基上生長的特性，隨后將所獲得的菌株在含蔗糖的培養(yǎng)基上生長，促使菌株的 重組功能催化另外一側(cè)同源片段發(fā)生整合而去除質(zhì)粒骨架部分，最終篩選取抗菌株的基因 型而得到基因敲除變株。這種經(jīng)典的基因敲除方法耗時（涉及多個基因克隆和測序）、繁瑣 (多菌株和多個操作步驟）且效率較低（最終獲得的克隆中可能含有較大比例的原株）。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為簡便快捷地對Rml021的基因進(jìn)行敲除，以高通量地對Rml021進(jìn)行功能研究并 最終開發(fā)出具有更高效率的根瘤固氮微生物基因工程菌株，本發(fā)明提供了一種利用重組工 程手段對Rml021進(jìn)行基因敲除方法。
[0007] 本發(fā)明所涉及的一種重組工程介導(dǎo)的苜蓿中華根瘤菌Rml021基因敲除方法，包 括以下步驟：
[0008] (1)通過重疊一延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得兩側(cè)為針對待敲除基因 500bp同源 片段、中間為卡那霉素抗性基因的融合DNA片段；
[0009] (2)融合DNA片段電轉(zhuǎn)化至由異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)的、克隆在質(zhì)粒 PLS2406中的重組酶基因表達(dá)的Rml021細(xì)胞中，在卡那霉素抗性篩選之下，卡那霉素抗性 基因取代目的基因而獲得基因敲除變株；
[0010] (3)將基因敲除變株在含0. 4%蔗糖的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以消除含重組酶基因的 質(zhì)粒 PL2S406。
[0011] 本發(fā)明所使用的是重組工程方法來介導(dǎo)所轉(zhuǎn)化的線性片段和基因組上同源片段 之間的同源重組。重組工程是上世紀(jì)90年代末起源的、利用重組酶催化常常是較短的同源 片段之間的同源重組而進(jìn)行基因克隆和基因修飾的一種生物技術(shù)手段。短同源片段可通過 堿基合成，因此可通過PCR引物的形式加以合成，這就避免了繁瑣的基因克隆操作步驟。最 常用的重組酶基因是來源自λ噬菌體的、位于一個操縱元上的 exo、bet和gam三個基因。 各基因的功能為：exo基因編碼DNA5'至3'外切酶，其外切雙鏈DNA分子而得到DNA單鏈； bet基因編碼單鏈結(jié)合蛋白，其結(jié)合在DNA單鏈上并行使同源片段之間的同源重組功能； gam基因編碼抑制內(nèi)源性核酸酶的Gam蛋白，可避免細(xì)胞本身對外源基因的降解。
[0012] 本發(fā)明所使用的表達(dá)重組酶基因的質(zhì)粒PLS2406是由如下方法獲得：以λ噬菌體 DNA為模板，SEQ ID NO. 1和SEQ ID Ν0. 2的序列為引物PCR擴(kuò)增得到1. 9kb的DNA片段，以 SacI和Xbal酶切后，克隆至以同樣酶切的pBluescript II KS (-)，經(jīng)測序驗證，得到重組克 隆pNdRed ;pNdRed以Ndel和Xbal酶切，分離1. 9kb的DNA片段，與同樣酶切的pSRKGm連 接，固體培養(yǎng)基中加入25 μ g/ml慶大霉素，IPTG和X-gal (5-溴-4氯-3-吲哚-β -D-半 乳糖苷）進(jìn)行篩選；挑取白色的克隆提質(zhì)粒酶切鑒定，得到重組克隆PLS2405 ;pKsaCB以 Xbal和BamHI酶切，分離1. 8kb的sacB基因片段，與以同樣酶切并經(jīng)堿性磷酸酯酶處理的 PLS2405相連，通過酶切鑒定獲得重組克隆pLS2406。
[0013] 將重組酶基因自λ噬菌體擴(kuò)增后克隆在plac啟動子之下，plac啟動子由調(diào)節(jié)基 因 lacl嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控。在沒有誘導(dǎo)劑存在時lacl基因編碼的LacI為抑制蛋白，抑制plac啟 動子的表達(dá)；當(dāng)環(huán)境中含有誘導(dǎo)劑（如本發(fā)明中所使用的IPTG)時，誘導(dǎo)劑和LacI結(jié)合以 解除抑制，plac啟動子得以表達(dá)，即驅(qū)動下游重組酶基因的表達(dá)而行使催化作用。plac啟 動子的嚴(yán)謹(jǐn)性保證了重組酶的瞬時表達(dá)（即只在有IPTG存在時才能表達(dá)），這就最大程度 地避免了重組酶所催化的、質(zhì)粒上的DNA片段和基因組上DNA片段以及基因組DNA片段之 間的異常重組。
[0014] 在獲得單一的或多個基因敲除變株后，表達(dá)重組酶基因的質(zhì)粒常常不再需要。
[0015] 為達(dá)到這一目的，pLS2406還克隆有sacB基因，這樣將含有pLS2406的菌株在含 有〇. 4%蔗糖的培養(yǎng)基上生長，sacB基因行使負(fù)篩選作用，子代細(xì)胞中含有sacB基因不能 生存，因而通過培養(yǎng)即可獲得質(zhì)粒消除的菌株。
[0016] Rml021基因組上的bacA基因和exoR基因敲除的成功敲除證明本本專利方法的可 行性。bacA基因在Rml021基因組上的基因編號為SM_b20999, bacA基因編碼一種內(nèi)膜蛋 白，研究表明BacA蛋白失活直接影響菌體分化，無法形成具有共生固氮能力的成熟類菌體 而喪失與宿主植物建立有效共生固氮的能力。因此bacA基因敲除變株將在研究生物固氮 的機理及如何提商固氣能力方面有著重要的應(yīng)用。exoR基因在Rml021基因組上的基因編 號為SMc02078，exoR基因是Rml021胞外多糖生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。Rml021的胞外多 糖是Rml021與植物紫花苜蓿形成根瘤的生物學(xué)過程中的必需化學(xué)成分。
[0017] 本發(fā)明的重組工程介導(dǎo)的基因敲除方法省略了基因克隆等耗時繁瑣的步驟，因此 簡潔省時，且可高通量地（即多個基因的同時）進(jìn)行敲除。鑒于Rml021在生物固氮方面的 重要性，本發(fā)明將在生物能源方面有著重要的應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是重組工程法介導(dǎo)的苜蓿中華根瘤菌Rml021基因敲除示意圖。
[0019] neo表示卡那霉素抗性基因，其左右兩側(cè)分別為針對目的基因上上游和下游同源 片段。PLS2406在IPTG誘導(dǎo)之下表達(dá)重組酶，重組酶催化線性底物DNA片段和基因組上同 源片段之間的同源重組。在卡那霉素的抗性篩選之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因，即 敲除目的基因。通過整合位點兩側(cè)的引物（Pu和Pd)進(jìn)行PCR擴(kuò)增以分析所獲得基因敲除 變株的基因型。
[0020] 圖2是bacA基因敲除變株基因型分析的凝膠電泳結(jié)果
[0021] [1] λ /Hindlll DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（自上而下）：23· 1，9. 4, 6. 6, 4. 4, 2. 3, 2. Okb
[0022] [2]以 Rml021 原株基因組 DNA 為模板，R1327-R1328PCR 擴(kuò)增得到 2428bp ;
[0023] [3]以bacA基因敲除變株基因組DNA為模板，R1327-R1328PC擴(kuò)增得到2210bp ;
[0024] [4]bacA基因敲除變株擴(kuò)增所得2210bp以Bglll酶切得到745bp和1465bp ;
[0025] [5]bacA基因敲除變株擴(kuò)增所得2210bp以Ncol酶切得到962bp和1248bp ;
[0026] [6]DL2000DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（自上而下）：2. 0, 1. 0, 0· 75, 0· 5, 0· 25, 0· lkb。
[0027] 圖3是exoR基因敲除變株基因型分析的凝膠電泳結(jié)果
[0028] [1]DL2000DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（自上而下）：2· 0, 1. 0, 0· 75, 0· 5, 0· 25, 0· lkb ;
[0029] [2]以 Rml021 原株基因組 DNA 為模板，R1347-R1348PCR 擴(kuò)增得到 2277bp ;
[0030] [3]以exoR基因敲除變株基因組DNA為模板，R1347-R1348PC擴(kuò)增得到2039bp。

【具體實施方式】
[0031] 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。
[0032] 下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施 例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0033] 在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相 同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
[0034] 實施例中所用到的菌株和質(zhì)粒，均為已公開的菌株和質(zhì)粒：
[0035] 1. Escherichia coli DH10B。 基因型 F-mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) <J)8〇AlacZAM15AlacX74deoR recAlaraD139A (ara，leu) 7697galU galK rpsL endAlnupG。文獻(xiàn)：Life Technologies, Inc. Focus, 1990, 12:19。購自美國 Invitrogen 公 司。
[0036] 2. Escherichia coli BW25141 和 pKD4。文獻(xiàn)：Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA. 2000, 97(12) : 6640-5。來自美國 Purdue 大學(xué) Barry Wanner 教授。
[0037] 3.苜猜中華根瘤菌 Rml021 (Sinorhizobium meliloti Rml021)。文獻(xiàn)：Galibert F, Finan TM, Long SR, Puhler A, Abola P, Ampe F, et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 2001，293 (5530) : 668-72.來自美國 Stanford 大學(xué)Sharon Long教授。
[0038] 4. pBluescript II KS (-)。文獻(xiàn)：Alting-Mees MA，Short JM. pBluescript II: gene mapping vectors. Nucleic Acids Res. 1989, 17 (22) : 9494.購自美國 Novagen 公司。
[0039] δ. pSRKGm。文獻(xiàn)：Khan SR, Gaines J，Roop RM，2nd，F(xiàn)arrand SK. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 2008, 4 (16) : 5053-62.來自美國 University of Illinois 大 學(xué) Urbana-Champaign 分校 Stephen Farrand 教授。
[0040] 6. pKsacB。文獻(xiàn)：楊運文，蔣伏歡，宋杰，尚廣東，重組工程法敲除惡臭假單胞菌 KT2440的染色體基因，南京師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，34 (4): 96-101。
[0041] 實施例1.重組酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0042] 設(shè)計引物 RN1 :5' ~GAAGAGCTCCATATGGATATTAATACTGAAACTG~3, , (SEQ ID NO. 1), 設(shè)計的 SacI 和 Ndel 位點以下劃線表示；RN2 :5' -GAATCTAGAGTCATCGCCATTGCTCCCCAAATA C-3'，（SEQIDN0. 2)，設(shè)計的Xbal位點以下劃線表示。以λ噬菌體DNA(購自上海生工生 物公司）為模板，RN1和RN2PCR擴(kuò)增得到1. 9kb的DNA片段，以SacI和Xbal酶切后，克 隆至以同樣酶切的pBluescript II KS(-)，經(jīng)測序驗證，得到重組克隆pNdRed。pNdRed以 Ndel和Xbal酶切，分離1. 9kb的DNA片段，與同樣酶切的pSRKGm連接，固體培養(yǎng)基中加入 25 μ g/ml慶大霉素，IPTG和X-gal (5-溴-4氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷）進(jìn)行篩選。挑 取白色的克隆提質(zhì)粒酶切鑒定，得到重組克隆PLS2405。pKsacB以Xbal和BamHI酶切，分 離1. 8kb的sacB基因片段，與以同樣酶切并經(jīng)堿性磷酸酯酶處理的pLS2405相連，通過酶 切鑒定獲得重組克隆PLS2406。pLS2406即為最終的用于Rml021基因敲除的表達(dá)重組酶質(zhì) 粒?；蚩寺〉乃拗骶鶠镋scherichia coli DH10B。
[0043] 實施例2.苜蓿中華根瘤菌Rml021基因組上bacA基因的敲除
[0044] 1. Rml021電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備和pLS2406的轉(zhuǎn)化
[0045] 自-80°C凍存管劃線至Rml021至LBMC固體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)約60h。單菌落轉(zhuǎn)接 至3ml LBMC，于30°C，220rpm振蕩培養(yǎng)約36h后，2ml轉(zhuǎn)接100ml LBMC，調(diào)節(jié)0D600約為? 0. 1，繼續(xù)培養(yǎng)至0D600約為0. 6時，離心，棄上清。菌體沉淀以冰冷的10%甘油洗滌三次， 最終懸浮于20(^1的冰冷10%甘油中，5(^1分裝。將1001^的？1^2406加至感受態(tài)細(xì)胞 中，輕彈混勻，轉(zhuǎn)移至冰上冷卻的1mm電轉(zhuǎn)杯，以2. lkV電擊轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化儀為美國Bio-Rad 公司的GenePulser11。電轉(zhuǎn)化后，加入lml的S0C懸浮，于30°C，220rpm孵育4h。隨后鋪 布于含25 μ g/ml慶大霉素的LBMC固體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)約60h，獲得轉(zhuǎn)化克隆。
[0046] LBMC培養(yǎng)基的配制:蛋白胨l.Og;酵母提取物0.5g;氯化鈉0.5g，2.5mM MgS04,2. 5mMCaCl2。前三組分混合溶解后，調(diào)節(jié)至pH7. 0。115°C滅菌20min。分別單獨滅 菌1麗8504和說0&(：1 2，使用前加入。固體培養(yǎng)基加入1.5-2.0%的瓊脂。用于質(zhì)粒消除時 的LBMC培養(yǎng)基不加 NaCl。
[0047] S0C培養(yǎng)基的配制（％ ):蛋白胨2.0g;酵母提取物0. 5g;氯化鈉0.05g，氯化鉀 0.019g，pH7.0。115°C滅菌20min。使用前加入單獨無菌的lMMgCl2溶液lml、單獨無菌的 lMMgS04溶液lml和過濾除菌的20%葡萄糖溶液2ml。
[0048] 2.誘導(dǎo)重組酶表達(dá)的Rml021/pLS2406的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備和DNA轉(zhuǎn)化
[0049] Rml021/pLS2406的固體平板和液體培養(yǎng)均加入25 μ g/ml的慶大霉素。同上擴(kuò)大 培養(yǎng)至0D600約為0. 2時，加入ImM的IPTG，進(jìn)行培養(yǎng)至0D600約為0. 6時，離心，棄上清， 后續(xù)的菌體洗滌至電轉(zhuǎn)化處理同上。
[0050] 3.bacA基因敲除
[0051] 重組工程法介導(dǎo)的苜蓿中華根瘤菌Rml021基因敲除示意圖如圖1所示。依此示 意圖所示，首先進(jìn)行bacA基因敲除。
[0052] 為簡化質(zhì)粒pKD4上卡那霉素抗性基因的結(jié)構(gòu)，設(shè)計引物KD1 :5' -GGAATCGATTATGG ACAGCAAGCGAACCGG-3'，（SEQ ID N0. 3)，設(shè)計的 Clal 位點以下劃線表示；KD2 :5' -GGGTCTAGA CTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3'，（SEQ ID N0. 4)，設(shè)計的 Xbal 位點以下劃線表示。以 pKD4 為 模板，KD1和KD2為引物PCR擴(kuò)增1. Okb卡那霉素抗性基因，1. Okb以Clal-Xbal酶切后與 pKD4以Clal-Xbal酶切所得的1. 5kb載體部分連接，轉(zhuǎn)化E. coli BW25141，以50 μ g/ml氨 芐青霉素和30 μ g/ml卡那霉素進(jìn)行篩選，經(jīng)提質(zhì)粒酶切鑒定得到重組質(zhì)粒pLS1918。
[0053] 以重疊延伸PCR(OE-PCR)來獲得兩側(cè)含同源區(qū)域的、用于基因敲除的線性底物 DNA片段。第一輪的PCR為根據(jù)已報道的Rml021基因組序列（GenBank收錄號為NC_003047) 擴(kuò)增目的基因上游和小游各約〇. 5kb的片段以及擴(kuò)增卡那霉素抗性基因片段。菌落PCR 擴(kuò)增Rml021基因組DNA片段的方法如下：Rml021小菌體塊懸浮于50 μ 1裂解緩沖液（5mM Tris. Cl ρΗ8· 0,2mMEDTApH8. 0,0· 5% triton X-100)，100°C熱處理 3 分鐘，13200rpm，高速 離心3分鐘，取5 μ 1上清用于50 μ 1 PCR反應(yīng)。
[0054] 設(shè)計三對引物 R1321 :5' -AAGAACGGCATCAAGGGCTTTC-3'，（SEQ ID NO. 5)，R1322 : 5'-ATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTAACGGCGGGCATCAGAAGGC-3, , (SEQ ID NO. 6) ；R1323 ： 5'-GCCTTCTGATGCCCGCCGTTAAACAAATAGGGGTTCCGCGC ACAT-3'，（SEQ ID NO. 7)，R1324 : 5，-GAACTTCGGAATAGGAACTAAGGACAAGGGACGGCACTCTCGTTTC-3,，（SEQ ID NO. 8) ;R1325 : 5'-GAAACGAGAGTGCCGTCCCTTG TCCTTAGTTCCTATTCCGAAGTTC-3'，（SEQ ID NO. 9)，R1326 : 5' -TCTATGCGATCGGCCTGCTGG-3'，（SEQ ID NO. 10)。其中 R1322 和 R1323 以及 R1324 和 R1325 為反向互補序列，為第二步的0E-PCR模板之間的重疊序列部分。以Rml021基因組DNA為 模板，R1321和R1322PCR擴(kuò)增得到bacA基因上游0. 5kb，R1325和R1326PCR擴(kuò)增得到bacA 基因下游〇. 5kb ;以pLS1918為模板，R1323和R1324PCR擴(kuò)增得到1. Okb的卡那霉素抗性基 因片段。三個PCR產(chǎn)物乙醇沉淀回收后，各50ng合并為模板，R1321和R1326PCR擴(kuò)增得到 2. lkb的線性底物DNA片段。乙醇沉淀回收后溶于ddH20,調(diào)節(jié)濃度為0. 2μ g/μ 1。
[0055] 制備IPTG誘導(dǎo)重組酶表達(dá)的Rml021電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化1 μ g的2. lkb DNA 片段，lml S0C懸浮液涂布含25mg/ml慶大霉素的LBMC平板，約得到40個抗性克隆。首先 將所得到克隆以相同抗性平板劃線擴(kuò)大培養(yǎng)，再以菌落PCR的方法驗證其基因型。
[0056] 設(shè)計弓丨物 R1327 :5'-GAAGCCTGGAAGAAAGCCGG-3'，（SEQ ID N0. 11)和 R1328 : 5' -TCCTTGCCTGGCTGATCACC-3'，（SEQ ID N0. 12)。以抗性克隆基因組 DNA 為模板，R1327 和 R1328進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以Rml021原株為對照。隨機的10個克隆PCR分析表明8個菌株 為變株，另外兩個為原株，典型的bacA基因敲除變株的基因型分析的結(jié)果見圖2。Rml021 原株和抗性變株擴(kuò)增的大小有較為明顯的差別，為進(jìn)一步驗證變株擴(kuò)增序列的正確性，將 擴(kuò)增變株所得2210bp分別以位于卡那霉素抗性基因中兩個酶切位點Bglll和Ncol進(jìn)行酶 切，所得大小與預(yù)期相符，而原株的擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有這兩個酶切位點。最終通過測序驗證變 株擴(kuò)增序列的正確。最后將bacA基因敲除變株命名為LS2423。
[0057] 4.基因敲除變株中pLS2406的消除
[0058] 將含有？1^2406的1^2423小塊菌體懸浮至111111^，鋪布含0.4%蔗糖但不含氯化 鈉的LBMC固體平板上，30°C培養(yǎng)60h。隨機挑取25個單菌落影印至無抗LBMC平板和含慶 大霉素的抗性LBMC平板，培養(yǎng)60h后，發(fā)現(xiàn)20個單菌落只能在無抗LBMC平板上生長，而不 能在含慶大霉素的平板上生長，這些慶大霉素敏感性菌株即為PLS2406質(zhì)粒得以消除的變 株。
[0059] 實施例3.苜蓿中華根瘤菌Rml021基因組上exoR基因敲除
[0060] exoR基因敲除的策略同bacA。 設(shè)計三對引物R1341 : 5'-TATCCTGACCAGCGGCAGTTC-3'，（SEQ ID N0. 13)，R1342 :5'-GTGCGCGGAACCCCTATTTGTTCATA ACAATCAGTTTCTTTCGTTC-3'，（SEQ ID NO. 14) ;R1343 :5' -GAACGAAAGAMCTGATTGTTATGAACAAA TAGGGGTTCCGCGCAC-3'，（SEQ ID Ν0· 15)，R1344 :5'-GTCAGGCCGCACGGGACCTCATCCTTAGTTCCTA TTCCGAAGTTC-3'，（SEQ ID NO. 16) ;R134 :5' -GMCTTCGGAATAGGAACTAAGGATGAGGTCCCGTGCGGC CTGAC-3'，（SEQ ID NO. 17)，R1346 :5' -GGAAAAATACCCCTACAAGCTC-3'，（SEQ ID NO. 18)。其中 R1342和R1343以及R1344和R1345為反向互補序列，為第二步0E-PCR的模板之間的重疊 序列部分。
[0061] 以Rml021基因組DNA為模板，分別以R1341和R1342PCR以及R1325和R1326擴(kuò) 增得到exoR基因上游和下游各0. 5kb ;以pLS1918為模板，R1343和R1344PCR擴(kuò)增1. Okb 的卡那霉素抗性基因片段。三個PCR產(chǎn)物乙醇沉淀回收后，各50ng合并為模板，R1341和 R1346PCR擴(kuò)增得到2. lkb的線性底物DNA片段。乙醇沉淀回收后溶于ddH20,調(diào)節(jié)濃度為 0· 2 μ g/ μ 1。
[0062] 1 μ g的2. lkb DNA片段電轉(zhuǎn)化IPTG誘導(dǎo)重組酶表達(dá)的Rml021電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞， lmlSOC懸浮液涂布含25mg/ml慶大霉素的LBMC平板，約得到65個抗性克隆。以相同抗性 平板劃線擴(kuò)大培養(yǎng)后，隨機挑取10個抗性菌落PCR。
[0063] 設(shè)計引物 R1347 :5' -TCGTGGAACAAGCCAGGGATAC-3'，（SEQ ID N0. 19)和 R1348 : 5' -TCMTCGCGGATTGCCGGGAG-3'，（SEQ ID N0. 20)。以 Rml021 原株為對照，對所獲得的抗性克 隆菌落PCR分析其基因型。PCR分析表明9個菌株為變株，1個為原株，典型的exoR基因敲 除變株的基因型分析的結(jié)果見圖3。最終通過測序驗證變株擴(kuò)增序列的正確，最后將exoR 基因敲除變株命名為LS2424。同上進(jìn)行質(zhì)粒消除，在30個克隆中有21個失去慶大霉素抗 性，表明PLS2406得以消除。
[0001] SKOUHNCK LISTING <110>南京師范大學(xué) <120> -種重組工程介導(dǎo)的苜蓿中華根瘤菌Rml02i基因敲除方法 <130> <160> 20 < 170> Patentln version 3,3 <210> 1 <211> 34 <2I2> DNA <213>人工序列 <40Q> 1 gaagagctcc atatggatat taatactgaa actg 34 <210> 2 <211> .^4 <ZI2.> DNA <213> 人工序列 <400> 2 gaatctagag tcatcgccat tgctccccaa atac 34 <210> 3 <211> 30 <212> [3ΝΛ <213> 人工序列 <400> 3 ggaatcgatt atggacagca agcgaaccgg 30 <210> 4 <211> 31 <2I2> DNA <213> 人工序列 <400 4 gggtctagac tcagaagaac tcgtcaagaa g 31 <210> 5 <21l> 22 <2I2> DNA <213>人丁序列
[0002]
[εοοο] π <〇葉> Μ由工Y <nr> VNd <clC> o乙 <iir> π <oic> \1 S §p§po§g〇 ihSdSjepi 0! <00t^> 肢奮工γ <ε?3> VNQ <clc> 12 <I1Z> 01 <01Z> 9(7 011-- §0〇3；EpOJ 1§B^00]§1 ；000!§00§； §B§B§0GBBg 6 <00t7> Γ丨練工Y <nz> VNQ <Z\Z> 9P <\\Z> 6 <〇]Z> 9^7 〇mS〇 1〇1〇Τ3〇--〇13 --?Β130^--?3 ^SHojiobbS 8 <0iW> Μ--?γ <U3> VNQ <clc> 9P <i\Z> 8 <UIC> ?^> goloo^gg ^gooSoDog ib§i〇w〇oH L <00V> (? 尜丁 Y <eiz> v.N.a <z\z> ^ <\\z> L <0lc> ^EpOODeE 9 <m> 幽工? <?\Ζ> vNa <τ?Γ> ?ρ <llc> 9 0lc> s <m> 11 〇i |>000] Μ由工Y <€R> V.MQ <ZIZ> ZZ <IIc> 81 <0R> L\ <00^> M·邊ilY <￡U> VNa <zt乙〉 ^ <llc> L\ <01c> ?ρ 〇μ§Β Β§ΟΟ^ΕΡ〇 ia§B^OOJB 3pDB§§S〇B 3§00§§B〇i5 91 <()()，> Μ--丄? <ti^> VMG <ZIZ> ^ <uz> 91 <01c> 9t? o^oSog i%^Sa〇Bi3 bHt313b§obbH SI <00t^> 胳邊(工Y <eic> VNa <ζ?ζ> 917 <UZ> SI <01c> 9t? 〇ui〇i n〇in^〇i sbobbjbou gwiBioooo β⧧〇^〇§〇§ i7| <()()f> M由丄Y <ne> VMG <ZIZ> 9t <\\Z> H <01c> \1 o ^bdS§o§b Π <()0廿〉 f!4告工丫 <ε--> vm <ζ?^> R <IIc> ει <〇1乙> QZ 30Β〇1?§1〇§ §1〇9§μ〇〇1 乙I <()(巾> 肢由丄Y <W> VMd <ZIZ> QZ <UZ> zj <mz> \Z § ι^--?οο?^ --ο?οι^οχ οζ <m> 肢由工Υ <πζ> VNCl <clc> Oi <llc> ()Z <()\Z> ZZ OB 1E§§§B00§B B0BB§§1§01 61 <00t7> M由工Y <Π3> vno <z\z> ZZ <llc> 61 <0lc> ZZ 35- D§BBDBp〇D 81 <0iW>
【權(quán)利要求】
1. 一種重組工程介導(dǎo)的苜蓿中華根瘤菌Rml021基因敲除方法，其特征在于包括以下 步驟： (1) 通過重疊一延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得兩側(cè)為針對待敲除基因500bp同源片 段、中間為卡那霉素抗性基因的融合DNA片段； (2) 融合DNA片段電轉(zhuǎn)化至由異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)的、克隆在質(zhì)粒 PLS2406中的重組酶基因表達(dá)的Rml021細(xì)胞中，在卡那霉素抗性篩選之下，卡那霉素抗性 基因取代目的基因而獲得基因敲除變株； (3) 將基因敲除變株在含0. 4%蔗糖的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以消除含重組酶基因的質(zhì)粒 PL2S406。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組 酶表達(dá)的Rml021細(xì)胞中，重組酶基因來源于λ噬菌體，通過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 誘導(dǎo)而表達(dá)；重組酶基因克隆在質(zhì)粒PLS406上，pLS2406同時含有負(fù)篩選標(biāo)記sacB基因。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述質(zhì)粒PLS406通過以下步驟構(gòu)建得到： 以λ噬菌體DNA為模板，SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的序列為引物PCR擴(kuò)增得到1. 9kb的 DNA片段，以SacI和Xbal酶切后，克隆至以同樣酶切的pBluescript II KS(-)，經(jīng)測序驗 證，得到重組克隆pNdRed ;PNdRed以Ndel和Xbal酶切，分離1. 9kb的DNA片段，與同樣酶 切的pSRKGm連接，固體培養(yǎng)基中加入25 μ g/ml慶大霉素，IPTG和X-gal (5-溴-4氯-3-吲 哚-β-D-半乳糖苷）進(jìn)行篩選；挑取白色的克隆提質(zhì)粒酶切鑒定，得到重組克隆pLS2405 ; pKsacB以Xbal和BamHI酶切，分離1. 8kb的sacB基因片段，與以同樣酶切并經(jīng)堿性磷酸酯 酶處理的PLS2405相連，通過酶切鑒定獲得重組克隆pLS2406。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：將基因敲除變株在含0. 4%蔗糖的固體培養(yǎng) 基中培養(yǎng)以消除含重組酶基因的質(zhì)粒PLS406。
【文檔編號】C12N15/74GK104046647SQ201410295367
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】尚廣東, 陳中秋, 莊浩, 李玲 申請人:南京師范大學(xué)