一種蝴蝶蘭tub基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種蝴蝶蘭不同發(fā)育時(shí)期及不同組織穩(wěn)定表達(dá)的β-tubulin（TUB）基因及其作為內(nèi)參基因的應(yīng)用。該基因含有1055個(gè)堿基序列，可通過RT-PCR人工合成獲得。該基因在蝴蝶蘭有關(guān)基因的實(shí)時(shí)定量PCR中作為內(nèi)參基因使用。發(fā)明人進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)證明，蝴蝶蘭TUB基因在不同時(shí)期及不同組織中均能穩(wěn)定表達(dá)，說明TUB基因在蝴蝶蘭不同發(fā)育階段及不同組織中可以作為內(nèi)參基因使用。本發(fā)明為研究蝴蝶蘭其它基因在不同發(fā)育階段及不同組織中的實(shí)時(shí)定量PCR表達(dá)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專利說明】—種蝴蝶蘭TUB基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種蝴蝶蘭不同發(fā)育時(shí)期及不同組織穩(wěn)定表達(dá)的β-tubulin (7Z?)基因及其作為內(nèi)參基因的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蝴蝶蘭spp.)又名蝶蘭，花型優(yōu)美，花色鮮艷，花序排列整齊，花期長達(dá)3~5個(gè)月，因而被譽(yù)為“洋蘭皇后”，具有很高的觀賞價(jià)值，也是很多地區(qū)年宵花的第一主打產(chǎn)品，近幾年在花卉產(chǎn)業(yè)中占有越來越重要的地位。隨著生物技術(shù)在花卉育種中的廣泛應(yīng)用及蝴蝶蘭生理代謝分子調(diào)控的機(jī)理研究，關(guān)于蝴蝶蘭的各種功能基因的克隆及表達(dá)特性逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。而在基因表達(dá)分析中，定量表達(dá)是最為常用的方法，為了控制樣品之間和樣品內(nèi)部的差異，通常利用表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化(Suzuki et.al, Control selection for RNA quantitation, Biotechniques, 2000,29(2):332~337),以減少樣本之間的誤差(Tunbridge et.al, Changed relative to whatHousekeeping genes and normalization strategies in human brain gene expressionstudies, Biological Psychiatry, 2011,69 (2):173~179),因此選擇合適的內(nèi)參基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行校正是得到可信數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。由于實(shí)時(shí)定量PCR是基因定量研究的常用方法，是對基因表達(dá)的準(zhǔn)確定量分析，靈敏度較高，要求內(nèi)參基因不能因不同的生理狀態(tài)或不同組織而改變表達(dá)水平，以滿足試驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性，保證數(shù)據(jù)的可靠性。
[0003]理想的內(nèi)參基因應(yīng)在各種類型的組織、細(xì)胞和各種實(shí)驗(yàn)因素條件下均能恒定或相對穩(wěn)定的表達(dá)。然而。近年來大量的研究結(jié)果表明，任何一種內(nèi)參基因的所謂恒定表達(dá)都是相對的，在一定類型 的細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)因素作用下恒定表達(dá)的某個(gè)內(nèi)參基因，在其他類型的細(xì)胞中或?qū)嶒?yàn)因素作用下可能是變化的。因此，一個(gè)內(nèi)參基因在不同時(shí)期、不同組織或不同試驗(yàn)條件下能夠持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)是其可應(yīng)用的基本前提。而且，同時(shí)采用多個(gè)內(nèi)參基因?qū)蚨勘磉_(dá)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化成為科研的趨勢和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)精確性的基本要求，因此越來越多的內(nèi)參基因被挖掘，同時(shí)需要進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性的驗(yàn)證(Vandesompele et.al, Accuratenormalization of realtime quantitative RT-PCR data by geometric averaging ofmultiple internal control genes, Genome Biol.,2002,3:1-11 ； Wan et.al., Selectionof appropriate reference genes for gene expression studies by quantitativereal-time polymerase chain reaction in cucumber, Anal.Biochem, 2010, 399:257~261 ；Jain et.al, Validation of housekeeping genes as internal control for studying geneexpression in rice by quantitative real-time PCR, Biochem Biophy Res.Commun, 2006,345:646~651)。
[0004]微管蛋白(Tubulin)是廣泛分布的一類球狀蛋白質(zhì)，是細(xì)胞內(nèi)微管的基本結(jié)構(gòu)單位，參與細(xì)胞胞質(zhì)環(huán)流、細(xì)胞分裂、分化、物質(zhì)運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、極性建成等重要的生理功能。α -微管蛋白(TUA)和β -微管蛋白(TUB)是微管的兩種主要成分，二者以異源二聚體形式存在。近年來，不斷有真核生物微管蛋白基因被克隆的報(bào)道(聞碩等，小地老虎β_微管蛋白基因cDNA序列的克隆、序列分析和表達(dá)檢測，昆蟲學(xué)報(bào)，2011，54 (10):1181~1188 ；Snustad et al., The small genome of Arabidopsis contains at least 9 expressedbeta-tubulin genes, Plant Cell, 1992, 4: 549~556),在分子生物學(xué)研究中也被用作內(nèi)參基因(張積森等，斑茅兩個(gè)看家基因片段的克隆及其在基因芯片中的應(yīng)用，熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2007,15 (4):277~283)。然而，在實(shí)時(shí)定量PCR研究方法中，如果不考慮所用內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性，盲目地選用內(nèi)參基因，必定會因其在不同試驗(yàn)條件或不同組織中自身表達(dá)的變化，導(dǎo)致實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性降低，甚至得到相反或錯(cuò)誤的結(jié)論。例如，擬南芥中有9個(gè)7Z?基因，其中，7Z?7只在根中表達(dá)，只在葉中表達(dá)，只在花粉中表達(dá)(Snustad et al., The small genome of Arabidopsis contains at least 9 expressedbeta-tubulin genes, Plant Cell,1992, 4: 549~556 ； Cheng et al., Temporal andspatial expression patterns of TUB9, a beta-tubul in gene of Arabidopsis thaliana,Plant Mol Biol,2001,47:389~398);水稻的7Z/M只在花粉中表達(dá)，其它的TM基因在發(fā)育中具有不同的表達(dá)水平(Yoshikawa et al.， Expression analyses of beta-tubul inisotype genes in rice, Plant Cell Physiol, 2003,44:1202~1207),這些 TM?基因就不適合作為內(nèi)參基因用于擬南芥和水稻其它基因定量表達(dá)的研究。
[0005]蝴蝶蘭有關(guān)基因表達(dá)的研究中，常采用肌動蛋白基因作為內(nèi)參基因，關(guān)于而蝴蝶蘭TUB基因的克隆及表達(dá)的穩(wěn)定性檢測尚未見到有關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是提供一種適于蝴蝶蘭有關(guān)基因?qū)崟r(shí)定量PCR研究中使用的內(nèi)參基因 β -tubulin (TUB)0
[0007]本發(fā)明所采取 的技術(shù)方案如下:
一種蝴蝶蘭盧(TUB)基因，其堿基序列如序列表所示，共含有1055個(gè)堿基序列。
[0008]所述蝴蝶蘭β -tubulin {TUB)基因，通過RT-PCR人工合成獲得。
[0009]所述蝴蝶蘭β -tubulin (TUB)基因在蝴蝶蘭有關(guān)基因的實(shí)時(shí)定量PCR中作為內(nèi)參基因使用。
[0010]現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于蝴蝶蘭有關(guān)基因表達(dá)的研究中，常采用肌動蛋白基因UCTJ#)作為內(nèi)參基因，單一的內(nèi)參基因的使用存在無法滿足各種情況下基因表達(dá)研究需要的缺陷。本發(fā)明所請求保護(hù)的蝴蝶蘭基因β-tubulin (7Z?)，豐富了蝴蝶蘭有關(guān)基因表達(dá)研究中關(guān)于內(nèi)參基因使用的范圍。為證明蝴蝶蘭TM?基因適于作為內(nèi)參基因使用，發(fā)明人進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)技術(shù)在蝴蝶蘭在生長發(fā)育的幼苗期、成苗期、盛花期和花后期四個(gè)階段的根、葉片、花梗、萼片、花瓣、蕊柱、子房等16種組織中進(jìn)行檢測，顯示蝴蝶蘭TM?基因在其不同時(shí)期及不同組織中均能穩(wěn)定表達(dá)，說明TM?基因在蝴蝶蘭不同發(fā)育階段及不同組織中可以作為內(nèi)參基因使用。因而本發(fā)明為研究蝴蝶蘭其它基因在不同發(fā)育階段及不同組織中的實(shí)時(shí)定量PCR表達(dá)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1蝴蝶蘭TUB基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2蝴蝶蘭TUB基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的溶解曲線；
圖3蝴蝶蘭TUB在不同發(fā)育階段不同組織中實(shí)時(shí)熒光定量PCR的熒光閾值；
圖4蝴蝶蘭TUB在不同發(fā)育階段不同組織中的表達(dá)情況；
圖5蝴蝶蘭TUB作為內(nèi)參基因在蝴蝶蘭基因定量表達(dá)研究中的應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說明，以便于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解和實(shí)施本發(fā)明。
[0013]實(shí)施例1
蝴蝶蘭盧(TUB)基因，其堿基序列如序列表(SEQUENCE LISTING)所示，共含有1055個(gè)堿基序列，即:
ATGAGAGAGATCCTTCACATCCAGGGTGGGCAATGTGGCAACCAGATCGGGGCGAAGTTCTGGGAGGTGATC
TGTGACGAGCACGGGATCGATCACACCGGTAAGTACAGTGGAGACTCCGAACTTCAACTCGAGCGGATCAACGTCTA
CTACAATGAGGCGAGCGGGGGAAGGTATGTTCCTAGGGCCGTGCTTATGGATCTGGAACCCGGGACGATGGATTCGG
TTAGATCGGGTCCGTTTGGG CAGATCTTTCGTCCGGATAATTTTGTCTTTGGACAGTCGGGTGCGGGGAATAACTGG
GCGAAGGGACACTATACCGAGGGTGCTGAACTCATTGATTCTGTGCTGGATGTGGTGAGGAAGGAGGCGGAGAACTG
CGATTGCTTGCAAGGATTCCAAGTATGCCATTCTTTGGGTGGAGGAACAGGATCTGGCATGGGCACCCTGCTCATTT
CGAAGATCAGAGAGGAGTACCCCGACCGGATGATGCTGACATTCTCAGTTTTCCCATCGCCTAAGGTCTCGGATACT
GTTGTGGAGCCATACAATGCTACTCTGTCAGTTCACCAGCTTGTTGAGAATGCCGACGAGTGCATGGTTCTCGATAA
TGAGGCTCTTTACGATATTTGTTTCCGCACTCTCAAGCTCGCCACCCCTACATTTGGCGATCTGAATCACCTCATAT
CTGCCACCATGAGCGGCGTCACGTGCTGCCTGCGCTTCCCTGGACAGCTAAATTCCGACCTCCGGAAGCTCGCCGTC
AACCTCATTCCTTTCCCTCGCCTCCATTTCTTCATGGTCGGCTTTGCTCCCCTAACATCCCGTGGATCCCAACAATA
CCGTGCCCTCACCGTCCCGGAGTTGACTCAACAGATGTGGGATTCCAAAAACATGATGTGCGCTGCCGATCCCCGCC
ATGGCCGTTACCTCACCGCCTCGGCCATGTTCCGCGGAAAAATGAGCACTAAAGAGGTAGATGAGCAAATGATCAAC
GTTCAGAACAAGAATTCGTCCTATTTCGTGGAGTGGATACCCAACAACGTGAAGTCCAGo
[0014]所述蝴蝶蘭β -tubulin {TUB)基因，通過RT-PCR人工合成獲得，即:通過設(shè)計(jì)簡并引物，利用RT-PCR擴(kuò)增獲得目的片段，然后將目的片段連接到T載體上進(jìn)行測序獲得蝴蝶蘭的TUB基因序列。為便于本領(lǐng)域技術(shù)人員具體實(shí)施本發(fā)明，對于TUB的RT-PCR人工合成步驟簡要說明如下。
[0015]、簡并引物設(shè)計(jì)
利用DNAMAN軟件分別進(jìn)行同源序列的多序列比對，再利用primer5.0軟件在多序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)I對簡并引物用于蝴蝶蘭TM?基因片段序列的擴(kuò)增及測序，簡并引物序列如下所示:
TUB-F:5’ - ATGAGRGAGATCCTBCACATC -3’ ；
TUB-R:5’ - CTGGACTTSACRTTGTTSGG -3’。
[0016]、蝴蝶蘭TUB基因片段序列的擴(kuò)增及測序
以常見蝴蝶蘭栽培品種“聚寶紅玫瑰”為實(shí)驗(yàn)材料，具體步驟如下:
(I)制備CDNA模板
A.取大約I克盛花期的葉片，在液氮中充分研磨，將研磨粉末放入1.5mL離心管中，加Λ I mL Trizol試劑(Invitrogen公司),充分振蕩混勻，室溫放置5~8分鐘,在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心10~15分鐘，吸取上清液；
B.取步驟A上清液1.5 mL于離心管中，加入0.2~0.3mL氯仿，充分振蕩混勻30~60秒，室溫放置5~10分鐘，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，吸取上清液；
C.取步驟B上清液1.5 mL于離心管中，再次加入0.2~0.3 mL氯仿，充分振蕩30秒~60秒，室溫放置5~10分鐘，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心10~15分鐘，吸取上清液；
D.取步驟C上清液1.5 mL于離心管中，加入等體積異丙醇輕輕混勻，室溫放置10~15分鐘，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心15~20分鐘，棄上清液；
E.將步驟D所得沉淀加入0.8~I mL 75%的乙醇，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心10-15分鐘，棄上清液，如此重復(fù)3次；
F.將步驟E所得沉淀置于超凈工作臺10~15分鐘，根據(jù)管內(nèi)RNA沉淀多少加入20~50 μ L RNAaseFree水(TaKaRa公司)，然后50~60°C水浴5~10分鐘，使RNA充分溶解；
G.取步驟F中溶解后Iμ L總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳判斷總RNA的質(zhì)量，以28S: 18S約為2為合格；提取的葉片總RNA放于_80°C冰箱備用；
H.米用ReverseTranscriptase M-MLV試劑(TaKaRa公司)將葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，放于-20°C冰箱備用。
[0017](2) RT-PCR擴(kuò)增及測序
以步驟(1)制備的cDNA為模板，利用步驟I中的簡并引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。具體如下。
[0018]PCR 擴(kuò)增體系為 20 μ L，其中:10 Xbuffer 2 μ L，TaqDNA 聚合酶 IU (TaKaRa 公司)
0.2 μ L，4 種 dNTP (TaKaRa 公司)各 150 ymol/L 共 1.6 μ L，每條引物 0.5ymol/L I μ L，兩條引物共2 μ L，cDNA模板1000~2000ng I μ L，其余為ddH20。
[0019]PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C變性3~5分鐘；95°C 40秒，56~60°C 40秒，72°C 40~60秒，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。
[0020]對特異擴(kuò)增片段進(jìn)行切膠回收純化?；厥掌芜B接到PMD19-T載體上(TaKaRa公司)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ci菌株(TaKaRa公司)，篩選鑒定并由上海英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行陽性克隆測序。獲得I個(gè)內(nèi)參基因的序列，長度在1055 bp。將該序列編碼的氨基酸序列提交到蛋白數(shù)據(jù)庫中比對，該氨基酸序列屬于微管蛋白超家族，包含微管蛋白功能域，具有β_微管蛋白的特異位點(diǎn)，說明該序列為目的基因序列。
[0021]實(shí)施例2
為檢驗(yàn)本發(fā)明所請求保護(hù)的蝴蝶蘭基因盧(TUB)是否適于作為內(nèi)參基因使用，發(fā)明人以常見蝴蝶蘭栽培品種“聚寶紅玫瑰”為實(shí)驗(yàn)材料，對其在生長發(fā)育的幼苗期、成苗期、盛花期和花后期四個(gè)階段的根、葉片、花梗、萼片、花瓣、蕊柱、子房等16種組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，證明了蝴蝶蘭TM?基因在不同時(shí)期及不同組織中均能穩(wěn)定表達(dá)，適于作為內(nèi)參基因使用，具體檢測過程簡述如下。
[0022](I)設(shè)計(jì)引物
根據(jù)蝴蝶蘭TUB序列，利用DNAMAN和primer5.0軟件，設(shè)計(jì)TUB序列的特異qRT-PCR定量引物如下:
RT-TUB-F: 5’- GCCTAAGGTCTCGGATACTGTT-3’ ；RT-TUB-R: 5’ - GCTCATGGTGGCAGATATGA -3’。
[0023](2)提取制備不同生長時(shí)期不同組織的cDNA模板
選取實(shí)驗(yàn)材料幼苗期的根和葉片，成苗期的根、葉片和莖，盛花期的根、葉片、花梗、萼片、花瓣、唇瓣、子房、蕊柱，花后期的根、葉片和花梗等16種組織作為實(shí)驗(yàn)材料，以實(shí)施例1中的方法提取16種組織的總RNA, 16種組織的總RNA采用PrimeScriptRT reagent Kit withgDNAEraser試劑(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，將cDNA稀釋3~5倍放于_20°C冰箱備用。
[0024](3)熒光定量PCR檢測
采用SYBR Premix Ex TaqTM II kit (TaKaRa公司)，反應(yīng)體系為25 μ L,以稀釋的16種組織的cDNA為模板，采用步驟(1)中設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。
[0025]反應(yīng)條件為:95V 30s, 95 V 15 s、58°C 15s、72°C 15s (40 個(gè)循環(huán))。
[0026]qRT-PCR 反應(yīng)在 Eppendorf 實(shí)時(shí)突光定量 PCR 儀(德國，Mastercycler eprealplex)上進(jìn)行， 3次重復(fù)。
[0027]如圖1所示，試驗(yàn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=_3.328χ+19.45。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增效率為1.02，R~2為99.8%。如圖2所示，溶解曲線為單峰，溶解溫度為84°C，表明定量引物具有特異性。如圖3所示，其熒光閾值(Ct)平均在22.08~24.77之間，獲得的熒光閾值(Ct值)可靠有效，可以作為內(nèi)參基因應(yīng)用于蝴蝶蘭發(fā)育階段不同組織其它基因研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究。
[0028]為了進(jìn)一步檢測TM序列的可靠性，利用TUA實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異引物，以苗期葉片的cDNA為模板，2(^1^體系，進(jìn)行？0?。反應(yīng)條件為:95 V 30 S，95 V 15 s、60°C 15 s、72°C 15 8，30個(gè)循環(huán)，721: 5 min，凝膠回收擴(kuò)增片段，連接于pMD19_T克隆載體上(TaKaRa公司)，并熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司)中測序，測序由上海英駿生物技術(shù)公司完成，結(jié)果表明目的片段為TUB基因特異片段。
[0029]為了進(jìn)一步檢測TUB表達(dá)的穩(wěn)定性，以16種組織的cDNA為模板，20 μ L體系，進(jìn)行PCR0 反應(yīng)條件為:95 0C 30 S，95 °C 15 s、60°C 15 s、72°C 15 s，28 個(gè)循環(huán)，72°C 5min，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。結(jié)果如圖4所示，TMM乍為內(nèi)參基因在16種組織中亮度基本一致，表明在16種組織中穩(wěn)定表達(dá)，可用于蝴蝶蘭不同發(fā)育時(shí)期不同組織基因的定量表達(dá)分析。
[0030]實(shí)施例3
為了證明本發(fā)明所提供的TM?基因作為內(nèi)參基因的使用效果，發(fā)明人以實(shí)施例1所制備的蝴蝶蘭基因作為內(nèi)參基因?qū)m基因的實(shí)時(shí)定量PCR做了應(yīng)用示范，具體情況簡述如下。
[0031]為了研究蝴蝶蘭MADS-box基因的表達(dá)特性，以蝴蝶蘭盛花期的根、葉、花器官組織的萼片、花瓣、唇瓣、子房、蕊柱等為材料。
[0032]根據(jù)蝴蝶蘭的序列(NCBI登錄號JQ065097)設(shè)計(jì)熒光定量引物為:
F: 5’ - TGTCGCTCTCATCATTTTTTCG -3 ；
R: 5’- GCTTTCAACCTTTGCCTTCA-3’。
[0033]以7Ζ?為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。
[0034]目的基因相對表達(dá)量Rel.Exp = 2_Δ ，其中Λ Ct =Ct (目的基因)一 Ct (內(nèi)參基因)，
Δ Δ Ct =(各植物組織Λ Ct) —(盛花期根Λ Ct)。
[0035]如圖5所示，結(jié)果表明，基因在花梗中表達(dá)量最高，在葉中次之，在根及花器官中有少量表達(dá)。
[0036]需要說明的是，上述實(shí)施例中未能詳細(xì)說明的實(shí)驗(yàn)方法，按照現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)操作即可，具體可參考《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F.M奧斯伯，R.E金斯頓，J.G塞德曼主編，馬學(xué)軍，舒躍龍譯 ，北京:科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。
【權(quán)利要求】
1.一種蝴蝶蘭基因TM?基因，其特征在于，該基因喊基序列如序列表所不，共含有1055個(gè)堿基序列。
2.權(quán)利要求1所述蝴蝶蘭基因基因，其特在于，該基因通過RT-PCR人工合成獲得。
3.權(quán)利要求1所述蝴蝶蘭基因TUB基因在蝴蝶蘭有關(guān)基因的實(shí)時(shí)定量PCR中的應(yīng)用，其特征在于， 該基因作為內(nèi)參基因使用。
【文檔編號】C12N15/29GK104017811SQ201410303519
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】崔波, 田云芳, 鄧祖麗穎, 雷志華, 馬杰 申請人:鄭州師范學(xué)院