用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因snp的引物、熒光探針及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因SNP的引物、熒光探針及應(yīng)用。所提供的引物為四組,每組引物有對(duì)應(yīng)的熒光探針組,分別針對(duì)rs1801133、rs11018628和rs1047891進(jìn)行快速基因分型,應(yīng)用本發(fā)明獲得的檢測(cè)結(jié)果精確可靠,且成本較低,具有較好的實(shí)用性。
【專利說(shuō)明】【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】,具體地指一種用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引 物、熒光探針及應(yīng)用。 用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物、熒光探針及應(yīng)用 【背景技術(shù)】
[0002] 葉酸(Folic acid)是維生素 B復(fù)合體之一,相當(dāng)于蝶酰谷氨酸(pteroylglutamic acid,PGA),是米切爾(Η. K. Mitchell,1941)從菠菜葉中提取純化的,故而命名為葉酸。葉 酸是機(jī)體所需的重要營(yíng)養(yǎng)素,在綠葉蔬菜、水果及動(dòng)物肝臟中含量豐富。葉酸在人體內(nèi)以四 氫葉酸的形式起作用,四氫葉酸是一碳單位的運(yùn)載體,可運(yùn)載甲基、甲烯基、甲醛基等一碳 單位,參與體內(nèi)氨基酸、嘌呤、嘧啶的合成。因而葉酸對(duì)細(xì)胞分裂增殖、組織修復(fù)和機(jī)體發(fā)育 等都是不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素。
[0003] 葉酸對(duì)人體的重要營(yíng)養(yǎng)作用早在1948年即已得到證實(shí),人類(或其他動(dòng)物)如缺 乏葉酸可引起巨紅細(xì)胞性貧血以及白細(xì)胞減少癥。此外,研究還發(fā)現(xiàn),葉酸對(duì)孕婦尤其重 要,葉酸缺乏會(huì)導(dǎo)致兩種結(jié)果:第一,使同型半胱氨酸向甲硫氨酸轉(zhuǎn)化出現(xiàn)障礙,進(jìn)而導(dǎo)致 高同型半胱氨酸血癥,后者可引起血管內(nèi)皮損傷、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增生,引起凝血和纖 溶系統(tǒng)功能失調(diào),使血液處于高凝狀態(tài),也是引起妊娠高血壓綜合征的重要因素;第二,弓丨 起S-腺苷甲硫氨酸/S-腺苷同型半胱氨酸比值降低,抑制DNA甲基轉(zhuǎn)穆酶活性和DNA甲基 化,造成染色體不分離現(xiàn)象,引起多種胎兒畸形。經(jīng)研究,在出生缺陷前五名中,有四項(xiàng)與葉 酸缺乏有關(guān),即先天性心臟病、唇腭裂、脊柱裂和無(wú)腦兒。
[0004] 妊娠頭4周是胎兒神經(jīng)管分化和形成的重要時(shí)期,此期葉酸缺乏可增加胎兒神經(jīng) 管畸形及早產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn);更有研究顯示,婦女在服用葉酸4周后,體內(nèi)葉酸缺乏的狀態(tài)才能得 到明顯的改善。因此,育齡婦女至少應(yīng)在孕前3個(gè)月開始,適當(dāng)多吃富含葉酸的食物和補(bǔ)充 葉酸,以確保胚胎早期有一個(gè)較好的葉酸營(yíng)養(yǎng)狀態(tài),預(yù)防胎兒神經(jīng)管及其他器官畸形的發(fā) 生。
[0005] 育齡婦女服用葉酸增補(bǔ)劑時(shí)由于個(gè)人的遺傳體質(zhì)不同,存在葉酸代謝能力的差 異,不同人群所需葉酸劑量不能一概而論。如服用劑量不足實(shí)際需求,達(dá)不到補(bǔ)充葉酸的效 果;而盲目過(guò)量服用高濃度葉酸,會(huì)干擾孕婦的營(yíng)養(yǎng)元素代謝,同樣會(huì)影響胎兒發(fā)育,超量 服用葉酸也會(huì)引起藥品不良反應(yīng),反而會(huì)對(duì)孕婦和胎兒造成嚴(yán)重不良后果。所以不同身體 狀況與素質(zhì)的育齡婦女必須根據(jù)自身情況,有的放矢地準(zhǔn)備與補(bǔ)充所需要的葉酸。
[0006] 因此,選取與育齡婦女孕前/孕期以及胎兒發(fā)育所需的葉酸代謝密切相關(guān)且研究 明確的一些重要基因位點(diǎn),綜合利用現(xiàn)代科學(xué)研究成果,開發(fā)一項(xiàng)基于分子遺傳基礎(chǔ)的葉 酸增補(bǔ)劑服用定量指導(dǎo)產(chǎn)品,將能夠針對(duì)不同遺傳體質(zhì)人群提出適合其自身需求的葉酸補(bǔ) 充劑量指導(dǎo),具有很強(qiáng)的社會(huì)意義和廣闊的市場(chǎng)前景。
[0007] 目前檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因遺傳多態(tài)性的最簡(jiǎn)單的方法是PCR-RFLP,其主要原理 是通過(guò)應(yīng)用特異性限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,并根據(jù)消化位點(diǎn)是否消失來(lái)判斷其變 異存在與否。但該方法操作復(fù)雜,樣本量多時(shí)易造成PCR產(chǎn)物的交叉污染且容易出現(xiàn)酶切 不充分或酶切過(guò)度而出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果,可靠性低。多重PCR方法盡管特異性有所 提高,但是這種方法的原理仍然是基于普通PCR的原理,引物特異性以及低保真Taq酶等這 些因素均可造成對(duì)結(jié)果的影響。DNA測(cè)序法雖然是目前進(jìn)行基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但步驟繁 瑣,過(guò)程復(fù)雜,試劑價(jià)格昂貴,容易出現(xiàn)樣本間的交叉污染而導(dǎo)致測(cè)序失?。涣硗鉁y(cè)序儀的 裝備也超出了一般臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的承受范圍。高分辨率熔解曲線法是一種快速,簡(jiǎn)便,經(jīng) 濟(jì),實(shí)用的分型方法,但基因分型依賴于儀器溫度控制的精密性,假陽(yáng)性高。Taqman探針的 方法采用特異性的熒光標(biāo)記的探針,特異性強(qiáng),靈敏度高且操作方便,快速。該方法同樣被 認(rèn)為是SNP分型的金標(biāo)準(zhǔn),在臨床應(yīng)用的前景值得期待。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物、熒光探針及 應(yīng)用。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供的第一組用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物 (以下簡(jiǎn)稱MTHFR引物),所述引物為如下引物對(duì):
[0010] (1)正向引物MTHFR-F,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;
[0011] 反向引物MTHFR-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示;
[0012] (2)由正向引物MTHFR-F或反向引物MTHFR-R的核苷酸序列經(jīng)增加、缺失或替換單 個(gè)核苷酸得到的引物;
[0013] 上述引物所對(duì)應(yīng)的目的基因均為亞甲基四氫葉酸還原酶基因,以該基因?yàn)槟0鍞U(kuò) 增所得DNA片段包含rsl801133SNP位點(diǎn)。
[0014] 本發(fā)明還提供了一組與MTHFR引物配合使用的熒光探針(以下簡(jiǎn)稱MTHFR探針), 所述熒光探針包括如下兩條:
[0015] MTHFR-T探針,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示;
[0016] MTHFR-C探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示;
[0017] 所述MTHFR-T探針及MTHFR-C探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),3'端標(biāo)記有熒光淬滅 基團(tuán),且MTHFR-T探針的5'端報(bào)告基團(tuán)與MTHFR-C探針的5'端報(bào)告基團(tuán)不同。
[0018] 其中,5' 端標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)可選自:FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP,且不限于上述基團(tuán);3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)可選自:TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB,且不限于上述基團(tuán)。
[0019] 優(yōu)選地,5'端標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)為FAM或VIC,3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為MGB。
[0020] 本發(fā)明還提供上述MTHFR引物和/或MTHFR探針在制備檢測(cè)亞甲基四氫葉酸還原 酶基因 rsl801133SNP位點(diǎn)多態(tài)性的試劑盒中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明提供的第二組用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物(以下簡(jiǎn)稱Ν0Χ引 物),所述引物為如下引物對(duì):
[0022] (1)正向引物N0X-F,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示;
[0023] 反向引物N0X-R,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 6所示;
[0024] (2)由正向引物N0X-F或反向引物N0X-R的核苷酸序列經(jīng)增力口、缺失或替換單個(gè)核 苷酸得到的引物;
[0025] 上述引物所對(duì)應(yīng)的目的基因均為NADPH氧化酶基因,以該基因?yàn)槟0鍞U(kuò)增所得 DNA片段包含rsll018628SNP位點(diǎn)。
[0026] 本發(fā)明還提供了 一組與Ν0Χ引物配合使用的熒光探針(以下簡(jiǎn)稱Ν0Χ探針),所述 熒光探針包括如下兩條:
[0027] Ν0Χ-Τ探針,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 7所示;
[0028] N0X-C探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示;
[0029] 所述Ν0Χ-Τ探針及N0X-C探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),3'端標(biāo)記有熒光淬滅基 團(tuán),且Ν0Χ-Τ探針的5'端報(bào)告基團(tuán)與N0X-C探針的5'端報(bào)告基團(tuán)不同。
[0030] 其中,5' 端標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)可選自:FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP,且不限于上述基團(tuán);3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)可選自:TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB,且不限于上述基團(tuán)。
[0031] 優(yōu)選地,5'端標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)為FAM或VIC,3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為MGB。
[0032] 本發(fā)明還提供上述Ν0Χ引物和/或Ν0Χ探針在制備檢測(cè)NADPH氧化酶基因 rsll018628SNP位點(diǎn)多態(tài)性的試劑盒中的應(yīng)用。
[0033] 本發(fā)明提供的第三組用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物(以下簡(jiǎn)稱CPS引 物),所述引物為如下引物對(duì):
[0034] (1)正向引物CPS-F,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 9所示;
[0035] 反向引物CPS-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示;
[0036] (2)由正向引物CPS-F或反向引物CPS-R的核苷酸序列經(jīng)增加、缺失或替換單個(gè)核 苷酸得到的引物;
[0037] 上述引物所對(duì)應(yīng)的目的基因均為氨甲酰磷酸合酶基因,以該基因?yàn)槟0鍞U(kuò)增所得 DNA片段包含rsl047891SNP位點(diǎn)。
[0038] 本發(fā)明還提供了 一組與CPS引物配合使用的熒光探針(以下簡(jiǎn)稱CPS探針),所述 熒光探針包括如下兩條:
[0039] CPS-G探針,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 11所示;
[0040] CPS-T探針,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 12所示;
[0041] 所述CPS-G探針及CPS-T探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),3'端標(biāo)記有熒光淬滅基 團(tuán),且CPS-T探針的5'端報(bào)告基團(tuán)與CPS-C探針的5'端報(bào)告基團(tuán)不同。
[0042] 其中,5' 端標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)可選自:FAM、HEX、TET、JOE、VIC、R0X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP,且不限于上述基團(tuán);3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)可選自:TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB,且不限于上述基團(tuán)。
[0043] 優(yōu)選地,5'端標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)為FAM或VIC,3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為MGB。
[0044] 本發(fā)明還提供上述CPS引物和/或CPS探針在制備氨甲酰磷酸合酶基因的 rs 1047891SNP位點(diǎn)多態(tài)性的檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
[0045] 本發(fā)明提供的第四組用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物組(以下簡(jiǎn)稱第四組 引物),所述引物組包括上述MTHFR引物、Ν0Χ引物及CPS引物:
[0046] 1)正向引物MTHFR-F,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;
[0047] 反向引物MTHFR-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示;
[0048] 2)正向引物N0X-F,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示;
[0049] 反向引物N0X-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示;
[0050] 3)正向引物CPS-F,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示;
[0051] 反向引物CPS-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0052] 本發(fā)明還提供了一組與上述第四組引物配合使用的熒光探針組(以下簡(jiǎn)稱第四 組熒光探針),所述熒光探針組包括如下探針:
[0053] MTHFR-T探針,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示;
[0054] MTHFR-C探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示;
[0055] Ν0Χ-Τ探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示;
[0056] N0X-C探針,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 8所示;
[0057] CPS-G探針,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 11所示;
[0058] CPS-T探針,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 12所示;
[0059] 所述MTHFR-T探針及MTHFR-C探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),3'端標(biāo)記有熒光淬滅 基團(tuán),且MTHFR-T探針的5'端報(bào)告基團(tuán)與MTHFR-C探針的5'端報(bào)告基團(tuán)不同;
[0060] 所述Ν0Χ-Τ探針及N0X-C探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),3'端標(biāo)記有熒光淬滅基 團(tuán),且Ν0Χ-Τ探針的5'端報(bào)告基團(tuán)與N0X-C探針的5'端報(bào)告基團(tuán)不同;
[0061] 所述CPS-G探針及CPS-T探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),3'端標(biāo)記有熒光淬滅基 團(tuán),且CPS-T探針的5'端報(bào)告基團(tuán)與CPS-C探針的5'端報(bào)告基團(tuán)不同。
[0062] 其中,5' 端標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)可選自:FAM、HEX、TET、JOE、VIC、R0X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP,且不限于上述基團(tuán);3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)可選自:TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB,且不限于上述基團(tuán)。
[0063] 優(yōu)選地,5'端標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)為FAM或VIC,3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為MGB。
[0064] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的熒光定量PCR試劑盒,包 括Taq酶、dNTPs、Mgc 12、10 X PCR buf f er、R0X參比熒光、超純水及第四組引物、第四組熒光 探針。需要說(shuō)明的是,關(guān)于上述各個(gè)試劑、引物、熒光探針的用量,以及PCR的時(shí)間、溫度參 數(shù)設(shè)置均為常用技術(shù)手段,是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際情況來(lái)調(diào)整的,不用以限制本 發(fā)明。PCR buffer為市售產(chǎn)品。
[0065] 此外,本發(fā)明雖然只提供了包括MTHFR引物、Ν0Χ引物、CPS引物的第四組引物,及 第四組熒光探針的組合,但是MTHFR引物、Ν0Χ引物、CPS引物中任意兩種的組合及應(yīng)用,或 與對(duì)應(yīng)熒光探針的聯(lián)用也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[〇〇66] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP多態(tài)性的方法,該方法是利用第 四組引物、第四組熒光探針,針對(duì)人基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),根據(jù)反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生 的熒光信號(hào)區(qū)分相應(yīng)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性。
[〇〇67] 上述引物、熒光探針可以應(yīng)用于華法林個(gè)體化用藥的相關(guān)檢測(cè)中。
[0068] 本發(fā)明的原理:
[〇〇69] 經(jīng)本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn),與葉酸代謝相關(guān)的基因包括如下三種:
[0070] 1)MTHFR :編碼亞甲基四氫葉酸還原酶,能夠催化形成5-甲基四氫葉酸,后者參與 同型半胱氨酸代謝,MTHFR基因突變會(huì)導(dǎo)致葉酸利用率低,同型半胱氨酸在體內(nèi)積累,引起 高同型半胱氨酸血癥,會(huì)影響胚胎早期心血管發(fā)育。
[0071] 2)N0X4 :編碼NADPH氧化酶,在腎臟中含量較多。在一項(xiàng)14萬(wàn)婦女參加的基因組 健康研究中發(fā)現(xiàn)N0X4基因與血液中同型半胱氨酸濃度相關(guān),N0X4基因突變會(huì)降低同型半 胱氨酸濃度。
[0072] 3)CPS1 :編碼氨甲酰磷酸合酶,催化形成氨甲酰磷酸,參與合成尿素、嘧啶等。CPS 基因突變會(huì)影響女性血液中同型半胱氨酸濃度,適量的葉酸補(bǔ)充能夠代謝同型半胱氨酸, 預(yù)防高同型半胱氨酸血癥。
[0073] 所以本發(fā)明使用了目前國(guó)際上普遍認(rèn)同的TaqMan探針技術(shù)對(duì)MTHFR基因的 rsl801133位點(diǎn)、N0X4基因的rsl 1018628位點(diǎn)和CPS1基因的rsl047891位點(diǎn)進(jìn)行基因分 型,其原理主要是,在TaqMan探針?lè)ǖ腜CR反應(yīng)體系中,包括一對(duì)PCR引物和一對(duì)探針。探 針只與模板特異性地結(jié)合,其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基因,3'端 標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán),當(dāng)探針完整的時(shí)候,報(bào)告基因所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收,儀 器檢測(cè)不到信號(hào),隨著PCR的進(jìn)行,Taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針,其3'_5' 外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷,報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán),其能量不能被吸收,即產(chǎn)生熒光 信號(hào)。用兩種不同熒光染料(如FAM,HEX、VIC)分別標(biāo)記這一對(duì)探針,針對(duì)雙等位SNP的不 同基因型,就可以在一次PCR反應(yīng)中完成對(duì)單個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型判定。在該方法中引物 長(zhǎng)度,探針長(zhǎng)度,引物特異性,探針特異性對(duì)檢測(cè)結(jié)果的特異性和敏感性非常重要,所以需 要合理的設(shè)計(jì)引物及多次科學(xué)驗(yàn)證才能得到較好的引物及探針。
[0074] 本發(fā)明的有益效果:提供了一種快捷的葉酸代謝相關(guān)SNP的分型試劑及應(yīng)用,應(yīng) 用本發(fā)明獲得的檢測(cè)結(jié)果精確可靠,且成本較低,具有較好的實(shí)用性。 【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0075] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中SNP分型結(jié)果rsl801133TT基因型的PCR熒光分析圖;
[0076] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中SNP分型結(jié)果rsl801133TC基因型的PCR熒光分析圖;
[0077] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例中SNP分型結(jié)果rsl801133CC基因型的PCR熒光分析圖;
[0078] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例中SNP分型結(jié)果rsll018628TT基因型的PCR熒光分析圖;
[0079] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例中SNP分型結(jié)果rsll018628TC基因型的PCR熒光分析圖;
[0080] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例中SNP分型結(jié)果rsll018628CC基因型的PCR熒光分析圖;
[0081] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例中SNP分型結(jié)果rsl047891GG基因型的PCR熒光分析圖;
[0082] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例中SNP分型結(jié)果rsl047891GT基因型的PCR熒光分析圖;
[0083] 圖9為本發(fā)明實(shí)施例中SNP分型結(jié)果rsl047891TT基因型的PCR熒光分析圖;
[0084] 圖10為本發(fā)明實(shí)施例中測(cè)序結(jié)果的類型圖。 【具體實(shí)施方式】
[0085] 以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0086] 實(shí)施例
[0087] 1、準(zhǔn)備如下引物和探針:
[0088] (1)針對(duì)亞甲基四氫葉酸還原酶基因 rsl801133SNP位點(diǎn)的引物及熒光探針:
[0089] 正向引物 MTHFR-F : 5,-TACCCCAAAGGCCACCCCG-3 '
[0090] 反向引物 MTHFR-R : 5,-CATGCCTTCACAAAGCGGA-3 '
[0091] MTHFR-T 探針:
[0092] FAM-GTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGC-MGB
[0093] MTHFR-C 探針:
[0094] VIC-GTGTCTGCGGGAGCCGATTTCATCATCACGC-MGB
[0095] (2)針對(duì)NOX氧化酶基因 rsll018628SNP位點(diǎn)的引物及熒光探針:
[0096] 正向引物 N0X-F : 5,-TGCAGAGAGCATGGTTGACTAG-3 '
[0097] 反向引物 N0X-R : 5 ' -TAAAGAGGAATGAGGCAACAT-3,
[0098] Ν0Χ-Τ 探針:
[0099] FAM-TGATTGTTTTTGATGTGGAGTAGATGAGAG-MGB
[0100] N0X-C 探針:
[0101] VIC-TGATTGTTTTTGATGCGGAGTAGATGAGAG-MGB
[0102] (3)針對(duì)氨甲酰磷酸合酶基因的rsl047891SNP位點(diǎn)的引物及熒光探針:
[0103] 正向引物 CPS-F : 5 ' -TAAATTATTTCAGAAAACAG-3,
[0104] 反向引物 CPS-R : 5 ' -AAAAATAAGAAATCACTGTGA-3 '
[0105] CPS-G 探針:
[0106] FAM-ATGCCACTGGGGTGGCAGGGACATTG-MGB
[0107] CPS-T 探針:
[0108] VIC-ATGCCACTGGGTTGGCAGGGACATTG-MGB
[0109] 將上述3組引物分別與對(duì)應(yīng)的探針制備成混合液,混合液中引物濃度為18 μ mol/ L,熒光探針濃度為5 μ mol/L。
[0110] 2、準(zhǔn)備PCR擴(kuò)增體系:
[0111] 預(yù)備96個(gè)受檢查人的DNA樣本,并對(duì)每個(gè)DNA分別加入3組引物和探針的混合液 做3個(gè)PCR反應(yīng),來(lái)分別對(duì)每個(gè)SNP進(jìn)行分型,所需試劑包括Taqman Genotyping Master Mix5 μ 1、ddH203. 5 μ 1、熒光探針和引物混合液0. 5 μ 1,其余為20ng/μ 1的受檢查人DNA樣 本1 μ 1,總體積10 μ 1。
[0112] 3、PCR擴(kuò)增程序:
[0113] PCR 反應(yīng)第一步:60°C、30s ;PCR 反應(yīng)第二步:95°C、10min ;PCR 反應(yīng)第三步:92°C、 15s ;PCR反應(yīng)第四步:60°C、90s ;PCR反應(yīng)第五步:循環(huán)第三步第四步50次,然后60°C、30s。 采用ABI Stepone突光定量PCR儀(Applied Biosystems,美國(guó)應(yīng)用生物技術(shù)有限公司)。
[0114] 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0115] PCR 反應(yīng)結(jié)束后,應(yīng)用 Stepone software V2. 1 (Applied Biosystems,美國(guó)應(yīng)用 生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行分析,將得到的96例結(jié)果進(jìn)行分類,其結(jié)果類型如圖1?9所 示,依據(jù)本發(fā)明的探針共分辨出9種基因型:SNP rsl801133三種基因型TT、TC和CC ;SNP rsll018628 三種基因型 TT、TC 和 CC ;SNP rsl047891 三種基因型 GG、GT 和 TT。
[0116] 5、試劑盒的準(zhǔn)確性分析
[0117] 為驗(yàn)證試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確性,對(duì)96例樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。SNP rsl801133T/T基因 型有10例,T/C基因型有41例,C/C基因型有45例;SNP rsll018628C/C基因型有7例,T/ C基因型有39例,T/T基因型有50例;SNP rsl047891T/T基因型有9例,G/T基因型有40 例,G/G基因型有47例。試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確性達(dá)到了 100%。測(cè)序結(jié)果的類型如圖10所 /_J、1 〇
[0001]
【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物,所述引物為如下引物對(duì): (1)正向引物MTHFR-F,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示; 反向引物MTHFR-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示; ⑵由正向引物MTHFR-F或反向引物MTHFR-R的核苷酸序列經(jīng)增加、缺失或替換單個(gè)核 苷酸得到的引物; 上述引物所對(duì)應(yīng)的目的基因均為亞甲基四氫葉酸還原酶基因,以該基因?yàn)槟0鍞U(kuò)增所 得DNA片段包含rsl801133SNP位點(diǎn)。
2. -種與權(quán)利要求1所述用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物配合使用的熒光探 針,所述熒光探針包括如下兩條: MTHFR-T探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示; MTHFR-C探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示; 所述MTHFR-T探針及MTHFR-C探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),3'端標(biāo)記有熒光淬滅基 團(tuán),且MTHFR-T探針的5'端報(bào)告基團(tuán)與MTHFR-C探針的5'端報(bào)告基團(tuán)不同。
3. 權(quán)利要求1所述引物和/或權(quán)利要求2所述熒光探針在制備亞甲基四氫葉酸還原酶 基因的rsl801133SNP位點(diǎn)多態(tài)性的檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
4. 一種用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物,所述引物為如下引物對(duì): (1) 正向引物N0X-F,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示; 反向引物N0X-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示; (2) 由正向引物N0X-F或反向引物N0X-R的核苷酸序列經(jīng)增加、缺失或替換單個(gè)核苷酸 得到的引物; 上述引物所對(duì)應(yīng)的目的基因均為NADPH氧化酶基因,以該基因?yàn)槟0鍞U(kuò)增所得DNA片 段包含rsll018628SNP位點(diǎn)。
5. -種與權(quán)利要求4所述用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物配合使用的熒光探 針,所述熒光探針包括如下兩條: N0X-T探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示; N0X-C探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示; 所述N0X-T探針及N0X-C探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán),且 N0X-T探針的5'端報(bào)告基團(tuán)與N0X-C探針的5'端報(bào)告基團(tuán)不同。
6. 權(quán)利要求4所述引物和/或權(quán)利要求5所述熒光探針在制備NADPH氧化酶基因的 rsll018628SNP位點(diǎn)多態(tài)性的檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
7. -種用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物,所述引物為如下引物對(duì): (1) 正向引物CPS-F,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示; 反向引物CPS-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示; (2) 由正向引物CPS-F或反向引物CPS-R的核苷酸序列經(jīng)增加、缺失或替換單個(gè)核苷酸 得到的引物; 上述引物所對(duì)應(yīng)的目的基因均為氨甲酰磷酸合酶基因,以該基因?yàn)槟0鍞U(kuò)增所得DNA 片段包含rsl047891SNP位點(diǎn)。
8. -種與權(quán)利要求1所述用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物配合使用的熒光探 針,所述熒光探針包括如下兩條: CPS-G探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示; CPS-T探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示; 所述CPS-G探針及CPS-T探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán),且 CPS-T探針的5'端報(bào)告基團(tuán)與CPS-C探針的5'端報(bào)告基團(tuán)不同。
9. 權(quán)利要求7所述引物和/或權(quán)利要求8所述熒光探針在制備氨甲酰磷酸合酶基因的 rs 1047891SNP位點(diǎn)多態(tài)性的檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
10. -種用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物組,所述引物組包括如下引物對(duì): 1) 正向引物MTHFR-F,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示; 反向引物MTHFR-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示; 2) 正向引物N0X-F,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示; 反向引物N0X-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示; 3) 正向引物CPS-F,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示; 反向引物CPS-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
11. 一種與權(quán)利要求10所述用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的引物配合使用的熒光探 針組,所述突光探針組包括如下探針: MTHFR-T探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示; MTHFR-C探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示; N0X-T探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示; N0X-C探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示; CPS-G探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示; CPS-T探針,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示; 所述MTHFR-T探針及MTHFR-C探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),3'端標(biāo)記有熒光淬滅基 團(tuán),且MTHFR-T探針的5'端報(bào)告基團(tuán)與MTHFR-C探針的5'端報(bào)告基團(tuán)不同; 所述N0X-T探針及N0X-C探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán),且 N0X-T探針的5'端報(bào)告基團(tuán)與N0X-C探針的5'端報(bào)告基團(tuán)不同; 所述CPS-G探針及CPS-T探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán),3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán),且 CPS-T探針的5'端報(bào)告基團(tuán)與CPS-C探針的5'端報(bào)告基團(tuán)不同。
12. -種用于檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP的熒光定量PCR試劑盒,其特征在于:包括 Taq酶、dNTPs、Mgcl2、10XPCR buffer、ROX參比熒光、超純水及權(quán)利要求10所述的引物組、 權(quán)利要求11所述的熒光探針組。
13. -種檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)基因 SNP多態(tài)性的方法,其特征在于:該方法包括利用權(quán)利 要求10所述的引物組、權(quán)利要求11所述的熒光探針組針對(duì)人基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng),根據(jù)反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的熒光信號(hào)區(qū)分相應(yīng)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104109714SQ201410305360
【公開日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】徐謀勝, 袁雅燕, 黃淑君, 余亞軍, 王珊 申請(qǐng)人:湖北維達(dá)健基因技術(shù)有限公司