特發(fā)性基底節(jié)鈣化新的致病基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明鑒定了與特發(fā)性基底節(jié)鈣化相關(guān)的隱性致病基因-ISG15基因。具體地，發(fā)明人以特發(fā)性基底節(jié)鈣化患病家系為研究對(duì)象，對(duì)該家系中的患病個(gè)體和非患病個(gè)體進(jìn)行了外顯子組測序和比較，意外地在ISG15基因中發(fā)現(xiàn)一個(gè)無義突變(c.163C＞T)，該突變造成ISG15蛋白質(zhì)翻譯中斷。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了突變的ISG15基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用，包含突變的ISG15基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。利用該突變的ISG15基因，可以對(duì)特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病進(jìn)行分子診斷和患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。該突變基因及其編碼蛋白質(zhì)還可作為治療該類基底節(jié)鈣化的藥物靶點(diǎn)。
【專利說明】特發(fā)性基底節(jié)鈣化新的致病基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人體變異的基因，尤其涉及一種特發(fā)性基底節(jié)鈣化新的隱性致病 基因-ISG15基因。本發(fā)明還涉及突變的ISG15基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用，包含突變的 ISG15基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 特發(fā)性基底節(jié)|丐化（idiopathic basal ganglia calcification，IBGC)，是一種先 天性神經(jīng)系統(tǒng)錐體外系疾病，由Delacour在1850年首先報(bào)道，因 Fahr于1930年首先描 述了雙側(cè)對(duì)稱性基底節(jié)鈣化的典型臨床和組織學(xué)特點(diǎn)，故早期多以Fahr病命名所有雙側(cè) 基底節(jié)及其他部位腦組織鈣化的疾病。特發(fā)性基底節(jié)鈣化主要病理學(xué)改變?yōu)槟X部非動(dòng)脈 性小血管鈣化，微血管壁、小血管壁及血管間隙內(nèi)有鈣鹽的沉積，還有磷、鎂、酸性粘多糖沉 積。特發(fā)性基底節(jié)鈣化的發(fā)生部位主要為蒼白球、尾狀核、殼核、丘腦、額頂葉、齒狀核、小腦 皮質(zhì)、腦干中央部和側(cè)腦室周圍等。常與甲狀旁腺機(jī)能低下、結(jié)節(jié)性硬化和生理性鈣化相混 淆。隨著CT的廣泛應(yīng)用，基底節(jié)鈣化疾病的臨床報(bào)道越來越多，基底節(jié)鈣化常伴隨偏頭疼、 癲癇發(fā)作、精神障礙、帕金森、腦梗和癡呆等錐體外系臨床癥狀，使患者苦不堪言。
[0003] 目前基底節(jié)鈣化的病因不明，遺傳因素是該病發(fā)生的一個(gè)重要因素，大多數(shù)IBGC 家系表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳方式，也有常染色體隱性遺傳和性染色體連鎖遺傳的報(bào) 道。IBGC基底節(jié)鈣化病癥也存在免疫因素。某些基底節(jié)鈣化患者常伴發(fā)一些自身性免 疫疾病，比如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（參考 Lupus, upus. Apr ;5 (2) :123-8. Brain calcification in patients with cerebral lupus·)。不同的研究顯示，在基底神經(jīng)節(jié)I丐化的病人樣 本中，檢測到了高表達(dá)的干擾素-α，Y，揭示了干擾素的表達(dá)與基底神經(jīng)節(jié)鈣化密切相 關(guān)（參考 The Aicardi-Goutiouti syndrome(familial, early onset encephalopathy with calcifications of the basal ganglia and chronic cerebrospinal fluid lymphocytosis ；Interferon-ismilial, early onset nigrostriatal degeneration and basal ganglia calcification) 〇
[0004] 除了以上兩大影響因素以外，基底節(jié)鈣化其他可能的致病因素多與小血管內(nèi)外局 部理化因素異常和代謝紊亂有關(guān)，如血管通透性鈣磷代謝異常，堿性磷酸酶活性紊亂，毒性 物質(zhì)作用，電解質(zhì)紊亂等。其鈣化多發(fā)生于小動(dòng)脈和毛細(xì)血管周圍，且易發(fā)生在終動(dòng)脈或邊 緣帶的腦血流灌注區(qū)，導(dǎo)致局部鈣化區(qū)域血流量減少，小血管阻塞，使局部神經(jīng)組織缺血， 梗死。
[0005] 外顯子測序技術(shù)是一種無偏見的檢測方法，已成功地應(yīng)用于稀有致病突變的檢測 上，如Freeman-Sheldon綜合征的MYH3基因，Schinzel-Giedion綜合征的SETBP1基因以 及嚴(yán)重大腦畸形的WDR62基因等。因此，本研究利用外顯子組測序技術(shù)去尋找特發(fā)性基底 節(jié)鈣化的新的致病突變，以期豐富該疾病的臨床基因檢測范圍。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的主要目的在于鑒別IBGC致病基因，定位出該疾病的基因突變位點(diǎn)。在此 基礎(chǔ)上，提供IBGC致病基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用，包含IBGC致病基因的載體、宿主細(xì)胞 以及試劑盒，以對(duì)特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病進(jìn)行分子診斷和患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步治療該 病提供設(shè)計(jì)藥物的靶點(diǎn)，同時(shí)為闡明該病的致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
[0007] 因此，一方面，本發(fā)明提供了突變的ISG15基因，所述突變的ISG15基因序列與SEQ ID NO: 1相比具有至少1個(gè)非沉默突變，且所述突變的ISG15基因?qū)е绿匕l(fā)性基底節(jié)鈣化的 發(fā)生；所述非沉默突變選自插入、缺失和置換中的一種或多種。
[0008] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變?yōu)镾EQ ID NO: 1的第163位的C突變 為T，其序列如SEQ ID N0:2所示。該突變使得ISG15基因編碼的氨基酸序列第55位的谷 氨酰胺突變?yōu)榻K止密碼子，使蛋白質(zhì)翻譯中斷。
[0009] 第二方面，本發(fā)明還提供了 SEQ ID N0:2序列編碼的蛋白質(zhì)，由于該序列在163位 出現(xiàn)終止密碼子，所述蛋白質(zhì)只有54個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0010] 在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述突變ISG15基因的載體。
[0011] 在本發(fā)明的第四方面，提供了被上述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述突變 的ISG15基因直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
[0012] 在本發(fā)明的第五方面，提供了上述的突變的ISG15基因在用作治療特發(fā)性基底節(jié) 鈣化疾病的藥物靶點(diǎn)或制備特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0013] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種用于診斷特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病的試劑盒，所 述試劑盒包含能夠特異性擴(kuò)增ISG15基因的引物，或能夠特異性檢測ISG15基因突變的探 針。
[0014] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引物或探針序列為SEQ ID NO: 1或2所示的序列 中第163位前后15?30bp長的序列。
[0015] 在本發(fā)明的第七方面，提供了一種抗體，所述抗體與上述SEQ ID N0:2序列編碼的 蛋特異性結(jié)合，且不作用于正常的ISG15基因所編碼的蛋白質(zhì)。
[0016] 在本發(fā)明的第八方面，提供了特發(fā)性基底節(jié)鈣化治療劑，所述治療劑包含上述抗 體。
[0017] 本發(fā)明通過外顯子組測序技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)了 ISG15基因突變可以導(dǎo)致IBGC的發(fā) 病。一方面，通過檢測受試者是否攜帶有ISG15基因致病突變，可以早期篩查基底節(jié)鈣化 致病突變基因攜帶者，提供優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)；也可為基底節(jié)鈣化患者提供分子診斷依據(jù)。特 別地，本發(fā)明所提供的診斷試劑盒可用于快速、有效地預(yù)測或診斷IBGC。另一方面，本發(fā)明 為IBGC的發(fā)病機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)，為IBGC患者的治療提供全新的理論依據(jù)。特別 地，由于一些IBGC患者伴有高表達(dá)的干擾素 -α，γ，本發(fā)明所確定的致病基因可以經(jīng)干擾 素誘導(dǎo)后高水平表達(dá)，這對(duì)于病理生理過程較為復(fù)雜的IBGC的研究提供新的思路。第三方 面，本發(fā)明可以為治療特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病提供可能的藥物靶點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是某四代常染色體隱性遺傳基底節(jié)鈣化家系圖，其中正方形表示男性，圓 圈表示女性；帶斜線為死亡，實(shí)心為患病個(gè)體，空心為正常個(gè)體；WT/Gln55*表示野生型， Gln55*/Gln55*表示純合突變型。
[0019] 圖2是PI、P2病人頭部CT掃描圖，雙側(cè)基底節(jié)對(duì)稱性鈣化，丘腦及大腦灰白質(zhì)交 界處多處鈣化，顱內(nèi)的白色部分為鈣化區(qū)域。
[0020] 圖3為突變序列SEQ ID N0:2與正常序列SEQ ID NO: 1在突變位點(diǎn)的對(duì)比示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的描述，但是以下描述僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn) 行解釋性說明，并不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍進(jìn)行任何的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求 書限定的范圍為準(zhǔn)。
[0022] 在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù) 人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)和分子生物學(xué)相關(guān)術(shù)語 和實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的術(shù)語和常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本 發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。
[0023] 在本發(fā)明中，" ISG15基因"為干擾素刺激基因15 (interferon-stimulated genel5)，它所編碼的氨基酸序列包含165個(gè)氨基酸殘基，稱為ISG15蛋白質(zhì)，屬于類泛 素蛋白質(zhì)（ubiquitin like protein, Ubls)。類泛素蛋白質(zhì)是一類小分子蛋白質(zhì)，它們 不僅在結(jié)構(gòu)上與泛素相似，而且也可以共價(jià)連接到其他的蛋白質(zhì)上對(duì)其進(jìn)行共價(jià)修飾。 ISG15可以與泛素的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，因此也被稱為泛素交叉反應(yīng)蛋白質(zhì)（ubiquitin cross-reaction protein, UCRP)，通過蛋白質(zhì)序列分析，發(fā)現(xiàn)ISG15含有2個(gè)功能域，即N 端功能域與C端功能域。
[0024] 在本發(fā)明中，術(shù)語"外顯子"是指在成熟mRNA中被保留下的部分，即成熟mRNA對(duì) 應(yīng)于基因中的部分。內(nèi)含子是在mRNA加工過程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在。 外顯子和內(nèi)含子都是對(duì)于基因而言的，編碼的部分為外顯子，不編碼的為內(nèi)含子，內(nèi)含子 沒有遺傳效應(yīng)。
[0025] 在本發(fā)明中，術(shù)語"外顯子捕獲"與"芯片雜交"可互換使用，指的是探針對(duì)文庫中 外顯子區(qū)域的DNA片段進(jìn)行特異性選擇和結(jié)合的過程。DNA分子正常情況下是雙鏈，因此捕 獲之前，DNA分子必須變?yōu)閱捂?，一般是通過加熱使其變性而達(dá)到解鏈目的，解鏈的DNA分 子被迅速冷卻，即保持單鏈狀態(tài)。文庫變性后在雜交平臺(tái)與芯片進(jìn)行捕獲雜交。含有外顯 子區(qū)域的DNA片段與固定在芯片上的探針之間在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行分子雜交。較佳地，芯 片上探針分子的濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于靶分子濃度。待雜交完畢后，通過變性等方法收集捕獲的 序列并純化，得到來自捕獲后的序列混合物。
[0026] 在本發(fā)明中，"高通量測序"是指采用三種第二代測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序： 454FLX(Roche 公司）、Solexa Genome Analyzer(Illumina 公司）和 Applied Biosystems 公司的SOLID等。這些平臺(tái)共同的特點(diǎn)是極高的測序通量，相對(duì)于傳統(tǒng)測序的96道毛細(xì)管 測序，高通量測序一次實(shí)驗(yàn)可以讀取40萬到400萬條序列，根據(jù)平臺(tái)的不同，讀取長度從 25bp到450bp不等，因此不同的測序平臺(tái)在一次實(shí)驗(yàn)中，可以讀取1G到14G不等的堿基數(shù)。
[0027] 在本發(fā)明中，術(shù)語"DNA文庫"是指對(duì)基因組的目的片段進(jìn)行打斷，獲得一組具有一 定大小的DNA片段混合物。DNA文庫的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在一個(gè)優(yōu)選例 中，還可以對(duì)打斷產(chǎn)物、末端修復(fù)產(chǎn)物、接頭產(chǎn)物和富集產(chǎn)物進(jìn)行純化。對(duì)反應(yīng)的條件進(jìn)行 一定的變化或優(yōu)化也在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)。
[0028] 在本發(fā)明中，術(shù)語"突變"是指野生型的ISG15多核苷酸序列發(fā)生改變，成為變異 體，變異體可以是天然發(fā)生的或非天然發(fā)生的。變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入 變異體。在本發(fā)明中，某一種變異體可以通過多種方式實(shí)現(xiàn)，例如，要得到野生型基因編碼 不完全的變異體，可以通過在野生型基因序列中插入終止密碼子，使某個(gè)密碼子變?yōu)榻K止 密碼子，或者直接缺失部分序列的方式實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明中，術(shù)語"非沉默突變"是指除了沉 默突變以外的基因突變，包括但不限于錯(cuò)義突變、無義突變和移碼突變等。
[0029] 本發(fā)明還涉及與所述的ISG15核苷酸雜交且兩個(gè)序列之間具有至少80%，較佳 地至少90%，更佳地至少95%，至少99%同源性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件 下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。
[0030] 本發(fā)明野生型或突變型ISG15核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、 重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列， 尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī) 方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重 組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法 從增殖后的宿主細(xì)胞中分尚得到有關(guān)序列。
[0031] 本發(fā)明中，"載體"包括但不限于克隆載體和表達(dá)載體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述載體是例如質(zhì)粒，粘粒，噬菌體，柯斯質(zhì)粒等等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體是 商購可得的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體包含與上述突變的ISG15基因可操作地 連接的表達(dá)控制序列，例如但不限于啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和終止子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述載體任選地還包含選擇標(biāo)記。
[0032] 包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。此類宿主細(xì)胞包括但不限于，原核細(xì)胞例如大腸桿 菌細(xì)胞，以及真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 例如小鼠細(xì)胞、人細(xì)胞等）。本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可以是細(xì)胞系。
[0033] 本發(fā)明還涉及到ISG15突變蛋白質(zhì)，由于在SEQ ID N0:1所示核苷酸序列中第163 位核苷酸發(fā)生了 C>T置換（圖3)，導(dǎo)致谷氨酰胺密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，本發(fā)明的ISG15 突變蛋白質(zhì)具有SEQ ID N0:3所示的序列，與野生型ISG15氨基酸序列的不同之處為：只 有54個(gè)氨基酸，缺失了后部分111個(gè)氨基酸，因此不具有ISG15蛋白質(zhì)正常的類泛素化修 飾功能。本發(fā)明的ISG15突變蛋白質(zhì)可以是重組蛋白質(zhì)、天然蛋白質(zhì)、合成蛋白質(zhì)，優(yōu)選重 組蛋白質(zhì)，即使用重組技術(shù)從原核或真核宿主（例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng) 物細(xì)胞）中產(chǎn)生。
[0034] 在本發(fā)明中，ISG15突變蛋白質(zhì)還涉及具有與ISG15突變蛋白質(zhì)相同功能的、SEQ ID N0. 3序列的變異形式。變異形式包括：同源序列、保守性變異體、誘導(dǎo)突變體等。發(fā)明 還涉及ISG15突變蛋白質(zhì)類似物。這些類似物膚與ISG15突變蛋白質(zhì)的差別可以是氨基酸 序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。
[0035] 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，致病基因具有多方面的用途。因此，本發(fā)明提供的突變 ISG15基因的用途包括但不限于：用作治療特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病的藥物靶點(diǎn)；制備特發(fā) 性基底節(jié)鈣化疾病診斷試劑盒中；用于產(chǎn)生疾病動(dòng)物模型；為治療IBGC提供新的藥物作用 途徑。
[0036] 本發(fā)明所述的"試劑盒"是指本領(lǐng)域技術(shù)人員以ISG15野生型或突變型核苷酸為 基因探針，根據(jù)基因雜交的原理，可以檢測生物樣本中是否存在與該探針序列互補(bǔ)的核苷 酸序列，因此使用這種試劑盒可以檢測出樣本中是否存在著本發(fā)明的基因突變位點(diǎn)。試劑 盒一般包括：引物、探針、核酸芯片、說明書等，還可能包括與活性成分相容的緩沖液、載體 或媒介等。
[0037] 在本發(fā)明中，"引物"指用于在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增靶標(biāo)核酸的多核苷酸片段，其通常為 寡核苷酸，例如含有至少 5 個(gè)堿基，例如 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、30、35、40、45、50個(gè)或者更多個(gè)堿基的多核苷酸片段。引物不必與待擴(kuò)增 的目的基因或其互補(bǔ)鏈完全互補(bǔ)，只要其能夠特異性擴(kuò)增目的基因。如本文中所使用的，術(shù) 語"特異性擴(kuò)增"是指引物能夠通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因，而不擴(kuò)增其他基因。例如，特 異性擴(kuò)增ISG15基因是指，在PCR反應(yīng)中引物只擴(kuò)增ISG15基因，而不擴(kuò)增其他基因，此類 引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0038] 在本發(fā)明中，術(shù)語"特異性檢測ISG15基因突變的探針"是指探針能夠區(qū)分出含有 突變的ISG15基因基因與不含有突變的ISG15基因。一般而言，可以通過控制雜交條件的 嚴(yán)緊性，使得探針能夠區(qū)分出含有突變的基因與不含有突變的基因。例如，在高度嚴(yán)緊條件 下，與ISG15基因精確互補(bǔ)的探針可以與不含有突變的ISG15基因基因雜交，而不與甚至只 包含一個(gè)點(diǎn)突變的突變的ISG15基因雜交，從而將二者區(qū)分開。同樣，還可以設(shè)計(jì)與突變的 ISG15基因基因精確互補(bǔ)的探針，從而其在高度嚴(yán)緊條件下與突變的ISG15基因雜交，而 不與不含有突變的ISG15基因雜交。在分子生物學(xué)領(lǐng)域中，探針的設(shè)計(jì)和雜交技術(shù)是熟知 的。
[0039] 本發(fā)明涉及對(duì)突變的ISG15蛋白質(zhì)具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其 是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結(jié)合于突變的ISG15蛋白質(zhì)。較佳地，指那些能 與突變的ISG15蛋白質(zhì)產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于野生型的ISG15蛋白質(zhì)相關(guān)抗原 分子的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗 體片段，如Fab，或（Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子或嵌合 抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。
[0040] 本發(fā)明的突變的ISG15蛋白質(zhì)抗體可以用來鑒定突變的ISG15蛋白質(zhì)。例如，可 以用一種可檢測的分子例如熒光素異硫氰酸（FITC)來標(biāo)記突變的ISG15蛋白質(zhì)特異抗體， 然后讓突變的ISG15蛋白質(zhì)特異抗體與樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測出與 突變的ISG15蛋白質(zhì)特異抗體結(jié)合的樣品，從而為預(yù)測或診斷患者是否存在特發(fā)性基底節(jié) 鈣化癥提供依據(jù)和指導(dǎo)。
[0041] 本發(fā)明的突變的ISG15蛋白質(zhì)抗體還可以用來中和突變的ISG15蛋白質(zhì)。如果有 足夠的數(shù)據(jù)表明某個(gè)體的IBGC與本發(fā)明突變ISG15蛋白質(zhì)的存在相關(guān)，可以考慮用突變的 ISG15蛋白質(zhì)特異性抗體中和這些致病突變ISG15蛋白質(zhì)分子，從而緩解患者的病癥。
[0042] 實(shí)施例1 :樣本獲取
[0043] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并鑒定了一個(gè)常染色體隱性遺傳的基底節(jié)鈣化家系（圖1)?；颊叩?父母為姑表近親結(jié)婚，父母表型正常，患病的三個(gè)姐妹（圖1中PI、P2、P3)均表現(xiàn)為基底 神經(jīng)節(jié)鈣化，經(jīng)初步臨床癥斷為特發(fā)性基底神經(jīng)節(jié)鈣化?；颊逷35歲死于癲癇發(fā)作。其他 兩位患者（P1和P2)，年齡分別為13歲和10歲，伴有間歇性癲癇。經(jīng)頭部CT掃描發(fā)現(xiàn)，P1 和P2雙側(cè)基底節(jié)區(qū)均呈對(duì)稱性鈣化灶，伴有丘腦、小腦齒狀核或大腦灰白質(zhì)交界區(qū)多發(fā)鈣 化（圖2)，家系患者智力正常，體形勻稱，掌骨無畸形，且血清鈣磷、甲狀腺素、甲狀旁腺素 正常，既往無感染、中毒及代謝性疾病史。
[0044] 發(fā)明人在家系中選取2位患者（P1和P2)作為研究樣本，母親作為正常樣本對(duì) 照，采集每位研究對(duì)象的外周血5ml作為研究樣品。根據(jù)世界醫(yī)學(xué)會(huì)《赫爾辛基宣言》的要 求，所有被采血的家系成員均簽署了患者知情同意書。
[0045] 實(shí)施例2 :樣本DNA制備
[0046] 采集兩例基底節(jié)鈣化患者及其母親外周血，采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血 DNA提取試劑盒從外周血樣品中提取DNA,提取步驟如下：
[0047] (1)取 2ml 全血樣本，加入 150ul OB Protease，2. lml Buffer BL 和 20ul RNase A,最大速度漩渦1分鐘，徹底混勻。
[0048] ⑵65攝氏度水浴15-20分鐘，并在水浴過程中漩渦5次。
[0049] (3)加入2. 2ml無水乙醇，最大速度漩渦30秒，徹底混勻。
[0050] (4)將3. 5ml裂解液移入帶過濾柱的15ml離心管，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出過濾 柱，倒掉過濾液體,放回過濾柱。
[0051] (5)將第3步剩余裂解液加入帶過濾柱的15ml離心管，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出 過濾柱，倒掉過濾液體，放回過濾柱。
[0052] (6)加入3ml HB Buffer,洗漆過濾柱，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出過濾柱，倒掉過濾 液體，放回過濾柱。
[0053] (7)加入3ml DNA Wash Buffer, 4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出過濾柱，倒掉過濾液體， 放回過濾柱。
[0054] (8)再次加入3ml DNA Wash Buffer, 4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出過濾柱，倒掉過濾液 體,放回過濾柱。
[0055] (9) 4000轉(zhuǎn)離心15分鐘，甩干過濾柱。
[0056] (10)將過濾柱移至新的15ml離心管，加入500ul70攝氏度的Elution Buffer,室 溫靜置5分鐘，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集含有DNA的過濾液。
[0057] (11)再次將過濾柱移至新的15ml離心管，加入500ul70攝氏度的Elution Buffer，室溫靜置5分鐘，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集含有DNA的過濾液。
[0058] (12)利用分光光度計(jì)測量DNA的濃度及純度，所得的每個(gè)標(biāo)本基因組DNA的 0D260/0D280均位于1. 7?2. 0之間，濃度不少于200ng/ul，總量不少于30 μ g。
[0059] 實(shí)施例3 :外顯子捕獲與測序
[0060] 發(fā)明人用Agilent SureSelect人全外顯子捕獲試劑盒（Agilent SureSelect Human All Exon Kit)結(jié)合Solexa高通量測序技術(shù)對(duì)選取的實(shí)施例1的三個(gè)樣本的外顯子 組序列進(jìn)行了測序，具體如下：
[0061] 1)將基因組DNA隨機(jī)打斷成150-200bp左右的片段，隨后在片段兩端分別連接上 接頭制備雜交文庫（參見http://www. illumina. com/提供的Illumina/Solexa標(biāo)準(zhǔn)建庫 說明書）。
[0062] 2)文庫經(jīng)純化后經(jīng)過連接介導(dǎo)PCR(ligation_mediated PCR(LM-PCR))的線性擴(kuò) 增與 SureSelect Biotiny lated RNA Library(BAITS)進(jìn)行雜交富集，再經(jīng)過 LM-PCR 的線 性擴(kuò)增后進(jìn)行上機(jī)測序。測序平臺(tái)為Illumina Hiseq2000,讀取長度為90bp,每個(gè)樣本的 平均測序深度最少為50 X。
[0063] 3)測序后獲得的原始數(shù)據(jù)由Illumina basecalling Softwarel. 7進(jìn)行處理， 經(jīng)過過濾去污染、使用S0APaligner2.20#比對(duì)參考基因組Hgl9(snpl32)(參考Li R，Li Y, KristiansenK, et al, SOAP:short oligonucleotide alignment program. Bioinformati cs2008, 24(5):713-714 ；Li R,Yu C, Li Y, et al, S0AP2:an improved ultrafast tool for short read alignment. Bioinformatics2009, 25 (15) :1966-1967,通過參考的方式將其全 文并入本文），以便獲得比對(duì)到基因組上的唯一比對(duì)序列。然后利用SOAP snp (可參見：Li R, Li Y, Fang X,Yang H,et al, SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing· Genome Res2009, 19 (6) : 1124-1132,通過參考的方式將其全文并入本文） 確定祀?yún)^(qū)域的基因型。Indel (insertion-deletion,插入/缺失標(biāo)記）采用BWA(通過 Burrows-Wheeler 變換比對(duì)）（versionO. 5. 9_rl6)比對(duì)到參考基因組 Hgl9 (snpl32)，然 后利用 GATK(Genome Analysis Toolkit) (version vl. 0.4705)確定 indel 的類型。（可 參見 Li H, Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.Bioinformatics2010 ；26 (5):589-595 ；McKenna, A, Hanna M, Banks E, et al. The genome analysis toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research2010 ；20 (9):1297-1303)〇
[0064] 結(jié)果顯示，在患者PI中發(fā)現(xiàn)有97165個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs)和7342處的插入 /缺失（Indel)，患者P2中發(fā)現(xiàn)有94399個(gè)SNPs和7193處的Indels，正常樣本中發(fā)現(xiàn)有 97952 個(gè)SNPs和 7438 個(gè) Indels。隨后通過dbSNP數(shù)據(jù)庫，（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ projects/SNP/snp_summary. cgi),千人基因組數(shù)據(jù)庫（www. lOOOgenomes. org/)、HapMap 數(shù)據(jù)庫（http://hapmap.ncbi.nlm. nih. gov/)等公共數(shù)據(jù)庫的過濾，去掉所有已知的且在 數(shù)據(jù)庫中等位基因頻率大于〇. 〇〇5的變異。通過比對(duì)正常樣本，去掉所有已知變異，同義突 變以及非編碼區(qū)的變異，并利用SIFT軟件進(jìn)行SNP功能預(yù)測，最終得到6個(gè)可能具有致病 意義的基因突變（3個(gè)SNPs和3個(gè)Indels)。
[0065] 實(shí)施例4 : Sanger法測序驗(yàn)證
[0066] 由于外顯子組測序存在一定程度的假陽性，因此我們進(jìn)一步利用Sanger測序法， 對(duì)上述6個(gè)可能具有致病意義的基因突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。具體方法步驟如下：
[0067] 1.DNA 提取
[0068] 分別采取兩名患者、兩名正常家屬以及600例無血緣關(guān)系的正常對(duì)照的外周血按 照實(shí)施例2的方法提取基因組DNA。
[0069] 2.引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)
[0070] 引物設(shè)計(jì)參考人類基因組序列數(shù)據(jù)庫hgl9/build36. 3,具體見下。
[0071] 引物序列：
[0072] 上游引物 5'CGGGCAACGAATTCCAGGTGT3'
[0073] 下游引物 5'CCGGCCCTTGATCCTGCTCG3'
[0074] 反應(yīng)體系：
[0075]
[0076]

【權(quán)利要求】
1. 一種突變的ISG15基因，其特征在于：所述突變的ISG15基因序列與SEQ ID N0:1相 比具有至少1個(gè)非沉默突變，且所述突變的ISG15基因?qū)е绿匕l(fā)性基底節(jié)鈣化的發(fā)生；所述 非沉默突變選自插入、缺失和置換中的一種或多種。
2. 如權(quán)利要求1所述的突變的ISG15基因，其特征在于：所述非沉默突變?yōu)镾EQ ID NO: 1的第163位的C突變?yōu)門，其序列如SEQ ID NO: 2所示。
3. -種如權(quán)利要求2所述的突變的ISG15基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于：所述蛋白 質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
4. 一種載體，其特征在于：所述載體含有如權(quán)利要求1或2所述的突變的ISG15基因。
5. -種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于：所述宿主細(xì)胞為權(quán)利要求4所述的載體 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的突變的ISG15基因在作為治療特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病的藥 物靶點(diǎn)或制備特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病診斷試劑盒中的應(yīng)用。
7. -種用于診斷特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包含能夠 特異性擴(kuò)增ISG15基因的引物，或能夠特異性檢測ISG15基因突變的探針。
8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于：所述引物或探針序列為SEQ ID NO: 1或2 所示的序列中第163位前后15?30bp長的序列。
9. 一種抗體，其特征在于：所述抗體與權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，且不作用 于正常的ISG15基因所編碼的蛋白質(zhì)。
10. -種特發(fā)性基底節(jié)鈣化治療劑，所述治療劑包含權(quán)利要求9所述的抗體。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104232650SQ201410306444
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】張建國, 張賢欽, 方明艷, 蔣慧, 陳欣, 王俊 申請人:深圳華大基因科技有限公司