一種血細胞分離管和單個核細胞的分離方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種血細胞分離管以及分離單個核細胞的方法。所述的血細胞分離管由分離管管體、旋蓋以及置于管體內的細胞分離隔膜和加樣滑板(輔助加樣裝置)組成。本發(fā)明還公開了使用該血細胞分離管分離單個核細胞的方法，該方法基于細胞密度梯度離心分離細胞的原理，通過改變加樣和取樣方式使傳統(tǒng)的、復雜的加樣模式變成易于操作的方式。本發(fā)明提供的血細胞分離管及方法可以使臨床醫(yī)學檢驗和細胞生物學研究中的細胞分離過程更簡化、操作更容易。
【專利說明】—種血細胞分離管和單個核細胞的分離方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域的細胞分離技術。本發(fā)明提供的血細胞分離管以及分離單個核細胞的方法基于細胞密度梯度離心分離細胞的原理，通過改變加樣和取樣方式使傳統(tǒng)的、復雜的加樣模式變成易于操作的方式。
【背景技術】
[0002]在臨床醫(yī)學檢驗中，針對特定細胞功能和生物學特性的檢查常常涉及到細胞的分離技術，從外周血液和各種體液(胸水、腹水、心包積液等)中分離單個核細胞是體外進行淋巴細胞免疫學研究和細胞學實驗的重要前處理步驟，分離的目的細胞的質和量是保證后續(xù)實驗可靠性的重要環(huán)節(jié)。
[0003]外周血單個核細胞(peripheralblood mononuclear cells,PBMCs)是參與機體免疫應答反應的一類重要免疫細胞群。PBMCs主要包含淋巴細胞和單核細胞，PBMCs中大部分(80%~90% )為淋巴細胞，其余成分是單核細胞，淋巴細胞包括T淋巴細胞和B淋巴細胞兩大類，這兩種免疫細胞按其細胞表面標志和細胞功能又分為不同的細胞亞群，按照淋巴細胞表面標志T淋巴細胞有⑶3+、⑶4+、⑶8+、⑶28+、⑶38+、⑶45+細胞等等，按照功能分還有輔助T細胞(helper T cell, Th)、效應T細胞(Effector T cells, Te)、遲發(fā)性變態(tài)反應 T 細胞(Delayed type hypersensitivity T cells, Td)和細胞毒性 T 細胞(Cytotoxic Tcells, Tc)等等；B淋巴細胞有B1、B2兩種亞型，對不同淋巴細胞亞群的分離、鑒別以及功能的研究對疾病的診斷乃至治療都有十分重要的臨床意義。
[0004]任何疾病的發(fā)生、發(fā)展都有相應淋巴細胞的數量、形態(tài)或者功能的改變，從細菌、病毒等一些病源微生物對人類的感染到腫瘤的發(fā)生以及一些免疫缺陷病、自身免疫性疾病和遺傳性疾病等許多疾病都有淋巴細胞參與的應激性免疫反應，表現為某些細胞亞群數量的改變、淋巴細胞膜表面標志物的變化或者引起細胞功能的變化(細胞因子的分泌或抗體的產生)，例如結核分枝桿菌侵入人體后會迅速被體內的淋巴細胞所識別，從而引起相應的細胞免疫反應，導致初始淋巴細胞在結核抗原刺激下轉化成效應T淋巴細胞,這些效應T淋巴細胞再次受到結核桿菌特異性抗原刺激后會產生相應的細胞因子Y-干擾素，體外檢測這些分泌Y-干擾素的效應T淋巴細胞對于診斷結核分枝桿菌感染具有重要的臨床意義。
[0005]淋巴細胞的分離方法有多種，這些分離方法的原理是根據各種細胞間的密度差異、細胞的粘附特性或者細胞膜表面標志的不同等物理的和生物學性能而設計的，主要方法包括粘附分離法、密度梯度離心法、免疫磁珠法和流式細胞儀法等。
[0006]粘附分離法是根據細胞對玻璃、尼龍棉等不同材質接觸表面的粘附差異分離細胞的，被分離的混合細胞流經吸附物體表面時粘附性高的細胞附著在吸附物表面，粘附性低的隨液流被沖走。中國專利CN87102643A公布一種基于細胞粘附性質設計的細胞分離器，該專利對細胞吸附材料的制作進行優(yōu)化，目的是提高分離細胞的純度和比例。粘附分離法分離目的細胞的回收率除了與選擇的吸附材料有關外，還與分離時控制輸入細胞的流速有關，為此中國專利CN200520134012公布了一項微流體細胞分離裝置制造方法，該裝置在控制被分離的混合細胞流速方面做了一些嘗試。粘附分離法需要控制被分離混合細胞的輸入速度，操作比較麻煩，這種方法細胞分離純度不高、回收率也低。
[0007]免疫磁珠法是應用抗原抗體特異性結合的原理分離細胞的，在各類淋巴細胞亞群的細胞膜上有不同的分化抗原，利用標記不同單克隆抗體的免疫磁珠與具有相同抗原表位的淋巴細胞特異性結合，然后在磁力場或者離心力的作用下將不同的淋巴細胞分離，這種分離細胞的方法如同用魚餌釣魚，免疫磁珠相當于魚餌，由于具有特異性結合的特性，所以免疫磁珠法具有分離純度較高的特點，通常分離純度能達到90%~99%，細胞的收獲率也相對較高，但是，免疫磁珠分離的淋巴細胞的效果和活力受磁珠的種類和標記抗體的影響，而且成本高。
[0008]流式細胞分離法是20世紀70年代發(fā)展起來的細胞鑒定和分選技術，它將激光技術、計算機技術、電子物理技術、光電測量技術、熒光化學技術以及單克隆抗體技術融合，使流式細胞儀得以誕生。流式細胞儀將細胞的分離和鑒別合二為一，其分離細胞的原理是:細胞液流在高頻超聲振蕩波的作用下分成均勻的含單個細胞的微小液滴，液滴在交變電場的作用下極化成帶有不同電荷微粒，不同種類的細胞極化后帶的電荷密度不一樣，這些帶電微粒在電場力的作用下發(fā)生偏離，由此實現對帶有不同表面抗原的淋巴細胞分離。如果將液流中的某些細胞預先用熒光染色抗體或者DNA染料標記，標記的細胞會被流式細胞儀中的光電檢測系統(tǒng)識別，從而實現對細胞的自動分析。目前，流式細胞分離技術已經比較成熟，流式細胞術在分選細胞的同時還可以同時檢測細胞的DNA含量、細胞體積、細胞膜受體和表面抗原以及細胞所處周期等許多生物信息，但是，用流式細胞術分選細胞成本較高，分離過程可能對細胞有損傷，從而影響細胞的活性。另外，該方法不能進行無菌操作，這使得分選的細胞不宜再做培養(yǎng)方面的研究。
[0009]免疫磁珠法和流式細胞分離法分離的淋巴細胞對分離樣本有選擇，通常這兩種方法使用的樣本是經過密度梯度離心方法分離獲得的混合淋巴細胞，這也是上述兩種方法能獲得較高純度的重要原因。
[0010]在多種細胞分離方法當中，Ficoll-Hypaque密度梯度離心法是分離淋巴細胞最傳統(tǒng)和經典的方法，這種方法是利用密度接近單個核細胞的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)細胞分離液分離目的細胞的，原理是利用人類血液中各種血細胞之間存在密度差異，例如紅細胞密度為1.090~1.093，粒細胞密度為1.090~1.092，單個核細胞的密度為1.075~1.090，血小板為1.030~1.035。Ficoll-Hypaque是一種密度為
1.077±0.001g/L與血漿等滲的低粘度混合溶液，如果將全血疊加在Ficol1-Hypaque分離液上面在離心力場的作用下，各種血液成分將按密度梯度重新分布聚集，紅細胞與粒細胞由于密度較大，離心后沉降在分離液的底部，血漿和血小板密度較低，離心后懸浮在分離液的上面，單個核細胞密度接近于分離液，由于分離液對單個核細胞的浮力作用大于離心力的作用，所以使單個核細胞不會下沉，離心后依然位于分離液界面上，這樣就可以分離獲得單個核細胞。密度梯度離心分離單個核細胞的主要優(yōu)點是:
[0011](1)操作步驟比較簡單，適合大量樣本的分離；
[0012](2)能夠實現無菌操作，分離的單個核細胞適宜臨床應用；
[0013](3)對分離的單個核細胞的損傷較小。
[0014]正是由于密度梯度離心法具有的上述這些優(yōu)點，才使得它作為最經典的細胞分離方法占有重要的地位，雖然新的細胞分離方法不斷出現，但是，密度梯度離心法具備的這些優(yōu)勢是其他方法難以替代的。盡管如此，密度梯度分離法也受一些因素影響，其主要影響因素包括:
[0015](I)分離液的化學組成成分及性質；
[0016](2)將樣本疊加在分離液液面上的操作技巧；
[0017](3)離心力和離心時間；
[0018](4)樣本抗凝和被稀釋比例；
[0019](5)離心過程的溫度控制。
[0020]分離液的化學組成和性質是決定分離效果的重要的因素，為此一些研究人員通過改變分離液的組成成分借此提高單個核細胞的分離效果，目前除了由聚蔗糖-泛影葡胺制備的分離液，人們也開發(fā)了由不同化合物組成的密度梯度分離液，比如由Percoll硅膠顆粒制備的連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度分離液，這種分離液能選擇性地分離某種類型的免疫細胞，并且可以提高分離的目的細胞的純度。鄒常春等(實驗與檢驗醫(yī)學，2009，27(4) =337-344)報道了 一種改良的從全血中分離中性粒細胞的方法。2012年中國專利CN201110456878公布了一種復方淋巴細胞分離介質，配方中的全部原料均符合靜脈注射級原料藥的標準，原料的安全性高，分離的淋巴細胞純度及淋巴細胞回收率與常規(guī)分離液比無顯著差異。另外一項中國專利CN20121011408公布了由羥乙基淀粉替代右旋糖酐的細胞分離液的制備方法，這種組合方法進一步提高了分離液的生物安全性，使得分離的淋巴細胞狀態(tài)更好，活力更高。
[0021]密度梯度離心法是根據各種血細胞之間的密度差異分離單個核細胞的，由于分離液的密度最接近目的細胞，因此，離心后這些細胞被富集在分離液的上面，形成一層濃集的目的細胞層。一般情況下通過優(yōu)化離心力、離心時間等條件密度梯度離心法分離的目的細胞混有其他雜細胞的數量是可以控制的(郭繼強，劉愛兵，沈丹等.中國組織工程研究與康復.2011，15 (45):8447-8450 ;樊衛(wèi)平，宋玉靖，郝顏琴等，山西醫(yī)科大學學報，2010，41 (3):274-284)。但是，任何改變分離液密度的因素都會影響密度梯度離心法的分離效果，分離液密度的變化不僅會影響分離的目的細胞的數量，還可能導致富集的目的細胞層中混入其他的雜細胞。為了不影響分離液的密度，除了離心時應控制適當的溫度外，再有就是在加入樣本時操作必需非常小心，不能讓樣本沖散分離液液面，如果有部分樣本與分離液混合，勢必會改變分離液的密度，影響分離效果。
[0022]密度梯度離心法的操作過程有以下幾個步驟:⑴將樣本(如外周血液)用細胞培養(yǎng)液或生理鹽水1:1~1: 2稀釋,使各類細胞充分分散；(2)將1/2樣本量的分尚液加入離心管中；(3)用巴氏吸管將稀釋樣本沿離心管管壁緩慢加到分離液的上面，盡量保持加入樣本與分離液液面清晰；(4)以500~100g的離心速度離心20~30min ; (5)用巴氏吸管吸取目的細胞層。上述第(3)、第(5)步驟是密度梯度離心法操作最繁瑣的步驟，操作生疏者不容易掌握，對于操作熟練者也是一個繁瑣、費力的事。

【發(fā)明內容】

[0023]為解決密度梯度離心法加樣、取樣操作繁瑣問題，本發(fā)明的目的是:
[0024](I)提供一種血細胞分離管；[0025](2)提供一種密度梯度離心法分離目的細胞新的操作方法。
[0026]為了實現上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方法:
[0027]提供一種血細胞分離管,所述的血細胞分離管由管體、旋蓋、置于管體內的細胞分離隔膜和加樣滑板組成。
[0028]所述的血細胞分離管管體是一個底部為半圓形或圓錐形的離心管，管口處有用于固定旋蓋的外螺紋，其特征在于:分離管分離隔膜以上的一段長度3~5厘米管壁或分離隔膜至管口這部分管壁為相同內徑的圓柱形結構。
[0029]分離管內接近分離管管底處固定一個分離隔膜。其特征是分離隔膜上有I個或I個以上等間距的小孔，各個孔的直徑相同并且其孔徑大小通過嚴格計算確定，其中所選的孔徑為I~10mm。
[0030]小孔依軸心對稱分布，使流體通過分離隔膜后流速均勻分布同時增加其流通系數。分離隔膜以下預留的容積為3~5ml。
[0031]分離管內有一個加樣滑板，所述的加樣滑板是根據流體力學的縫隙流動特性設計的輔助加樣裝置，它由一個圓盤和與圓盤邊緣連接的η型推桿組成，推桿的另一端設有一個橢圓形的推桿柄。
[0032]圓盤邊緣與分離管內壁有一個狹窄的環(huán)形間隙，其特征是:環(huán)形間隙寬度經嚴格計算獲得，其中所選的寬度為0.01~5mm。所選定的間隙寬度應確保在圓盤以上加入一定量的血液樣本時，該液體在自身重力作用下不會通過環(huán)形間隙向下泄漏，并且，當改變圓盤的上下位置時，液體可以通過環(huán)形間隙自由流動。
[0033]為了滿足上述要求，除了應考慮樣本溶液(如血液)的表面張力性質外，制作加樣滑板和分離管的材料也應該有所選擇，本發(fā)明選擇非極性或弱極性的高分子聚合材料，這些材料包括聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、ABS以及SEBS其中的任意一種，這類材料的表面能低，潤濕性差，所形成的縫隙能夠利用液體的表面張力特性呈現自封閉性。
[0034]本發(fā)明還提供了一種使用上述血細胞分離管分離單個核細胞的方法，所述的方法包括:
[0035](I)預充淋巴細胞分離液
[0036]將3~5ml淋巴細胞分離液注入上述血細胞分離管中。以1500~2000pmr的速度離心2~5min，使分離隔膜以下充滿淋巴細胞分離液，注入的淋巴細胞分離液其液面應高于分離隔膜I~2cm，將加樣滑板通過反向折疊的推桿臂懸掛在分離管的側壁上，使圓盤底面恰好與注入的淋巴細胞分離液的液面在同一水平面高度。
[0037](2)稀釋樣本
[0038]將待分離血液預先用1640培養(yǎng)液或生理鹽水按照血液與稀釋液1:1或1: 2的比例稀釋。
[0039](3)加入樣本
[0040]將稀釋后的血液直接倒入分離管中。由于在分離液液面之上有加樣滑板的阻擋，因此倒入的血液樣本不會沖擊滑板以下的分離液。
[0041](3)樣本與分離液疊加
[0042]將加樣滑板緩慢移出分離管，樣本則被疊加在分離液上面。向上推動橢圓形的推桿丙，分離管內的加樣滑板在η型推桿帶動下向上移動，滑板上面的血液樣本受到壓力作用，滑板下形成連續(xù)的低壓空隙，使滑板上下產生附加壓力差，于是血液樣本通過滑板邊緣與分離管內壁形成的環(huán)形間隙流到滑板下面，加樣滑板持續(xù)向上移動，血液樣本則被緩慢疊加在分離液上面。
[0043](5)離心
[0044]以500~100g的離心速度離心20~30min。
[0045](6)取樣
[0046]將離心后的樣本直接倒入另外一支試管中。在離心力場的作用下，分離管內的液體分成清晰的4層，分離隔膜以上依次是少部分分離液、單個核細胞層和血漿層，紅細胞離心后沉積在分離隔膜以下分離管底。將分離隔膜以上的液體直接倒入另外一支清潔的試管中則完成取樣操作。當分離管被倒置時，由于分離隔膜內的液體施加在每個小孔上的靜壓力遠遠低于大氣壓，加上液體的表面張力作用，分離隔膜內的液體不會通過小孔流出。
[0047]轉移到新試管中的液體包含所有要分離的目的細胞、血漿及分布在血漿中的少量血小板，上述混合液通過洗滌、純化最終可獲得需要分離的單個核細胞。
[0048]本發(fā)明優(yōu)點和積極效果在于:所提供的血細胞分離管與應用普通離心管分離單個核細胞的方法相比，簡化了后者復雜的操作過程，其特征是使常規(guī)的必需應用巴氏吸管加樣、取樣操作簡化了。
[0049]本發(fā)明所提出的加樣滑板改變了傳統(tǒng)的加樣方式，使血液樣本與分離液的疊加界面更清晰，并減少了不必要的失誤。
[0050]在以下本發(fā)明實施方案中，為了提高目的細胞的收率，采用在分離隔膜上增加分離液的方式。因為有了加樣滑板，加樣時才可以直接倒入樣本，這樣不僅可以提高分離細胞的收獲率，又仍然保持簡化的加樣操作的特點。
[0051]本發(fā)明所提供的血細胞分離管適用所有密度梯度分離介質，如將上述預充的Ficoll-Hypaque分離液用Percoll分離液代替，在應用Percoll連續(xù)的密度梯度分離方式時，加入分離液的方法與加入Ficoll-Hypaque分離液相同。本發(fā)明所提供的血細胞分離管更適用于Percoll不連續(xù)密度梯度法分離細胞，在利用Percoll不連續(xù)密度梯度法分離目的細胞時，可將密度較高的Percoll分離液加在分離隔膜以下，然后直接將密度較低的Percoll分離液倒入分離管的適當的高度即可，由于有分離隔膜的阻擋，不必擔心高密度與低密度的Percoll分離液相互混合。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1是血細胞分離管的完整結構圖。
[0053]圖中I旋蓋，2分離管管體，3推桿，4推桿柄，5加樣滑板，6圓盤7分離隔膜
[0054]圖2是實例I的操作示意圖。
[0055]圖中:(I)血漿層(2)單個核細胞層(3)分離隔膜(4)紅細胞層
[0056]圖3是實例2的操作示意圖。
[0057]圖4是實例 3的操作示意圖。
【具體實施方式】[0058]實例I本發(fā)明的一個應用方式是，不用加樣滑板的情況下也可以按照簡化的操作方法分離目的細胞。圖2是本方案的示意圖，在這項實施方案中可以將預分離血液樣本直接倒入分離管中，在血液樣本倒入分離管過程中，分離隔膜將阻止樣本與分離液混合，選擇2000轉/分的離心速度離心20分鐘，離心后紅細胞通過分離隔膜沉積在分離管底，單個核細胞則被富集在分離隔膜以上的細胞分離液和血漿層之間，取樣時將分離隔膜以上的液體直接倒入新的試管中即可。
[0059]表1兩種方法分離的淋巴細胞濃度、純度和活力
[0060]
【權利要求】
1.一種血細胞分離管,該分離管由管體、旋蓋、置于管體內的細胞分離隔膜和加樣滑板組成。
2.根據權利要求1所述的血細胞分離管，其特征在于:分離管分離隔膜以上的一段長度3~5厘米管壁或分離隔膜至管口這部分管壁為相同內徑的圓柱形結構。
3.根據權利要求1所述的血細胞分離管，其特征是分離管內接近分離管管底處固定一個分離隔膜。
4.根據權利要求1和3所述的血細胞分離管，其特征是分離隔膜上有I個或I個以上等間距的小孔，各個孔的直徑相同并且其孔徑大小通過嚴格計算確定，其中所選的孔徑為I ~1mm0
5.根據權利要求1和3所述的血細胞分離管，其特征是小孔依軸心對稱分布。
6.根據權利要求1所述的血細胞分離管，其特征是分離管內有一個加樣滑板，所述的加樣滑板由一個圓盤和與圓盤邊緣連接的η型推桿組成，推桿的另一端設有一個橢圓形的推桿柄。
7.根據權利要求1和6所述的血細胞分離管，其特征是:圓盤邊緣與分離管內壁有一個狹窄的環(huán)形間隙，環(huán)形間隙寬度經嚴格計算獲得，其中所選的寬度為0.01~5_。
8.根據權利要求1-7所述的血細胞分離管，其特征在于制作加樣滑板和分離管的材料選擇非極性或弱極性的高分子聚合材料，這些材料包括聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC) 、ABS以及SEBS其中的任意一種。
9.根據權利要求1-7的一種單個核細胞的分離方法，所述的方法包括: (1)預充淋巴細胞分離液: 將3~5ml淋巴細胞分離液注入上述血細胞分離管中； (2)稀釋樣本: 將待分離血液預先用1640培養(yǎng)液或生理鹽水按照血液與稀釋液1:1或1: 2的比例稀釋； (3)加入樣本: 將稀釋后的血液直接倒入分離管中； (4)樣本與分離液疊加: 將加樣滑板緩慢移出分離管，樣本則被疊加在分離液上面； (5)離心: 以500~100g的離心速度離心20~30min ； (6)取樣: 將離心后的樣本直接倒入另外一支試管中。
10.根據權利要求1-8的方法和原理制作的其他產品。
【文檔編號】C12M1/12GK104031831SQ201410307551
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年7月1日 優(yōu)先權日:2014年7月1日
【發(fā)明者】宋雪, 程月紅 申請人:北京圣浦博大生物科技有限公司