一種提取土生隱球酵母線粒體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取土生隱球酵母線粒體的方法，本方法對現(xiàn)有差速離心法的操作步驟、提取緩沖液的組分和配制方法進(jìn)行改良，延長菌體預(yù)處理時間，期間不斷震蕩；在酶解破壁步驟中，改良酶解緩沖液的組分，增加蝸牛酶的用量同時添加纖維素酶，延長酶解破壁的時間和孵育溫度，使菌體破壁徹底，增加原生質(zhì)體的得率；為了原生質(zhì)體裂解溫和不至于破壞線粒體，原生質(zhì)體裂解液和線粒體洗滌緩沖液均用PBS配制。用該方法可以提取到高質(zhì)量的線粒體，其結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)沒有被破壞，具有活性。該方法提取到的線粒體可以用于以線粒體為研究對象的生理生化研究。該方法具有簡單、經(jīng)濟(jì)、易于操作等優(yōu)點，適合在普通生物實驗室中操作和推廣。
【專利說明】一種提取土生隱球酵母線粒體的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種線粒體的提取方法，特別涉及一種用于提取土生隱球酵母線粒體的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]線粒體是細(xì)胞中一種重要的細(xì)胞器，存在于絕大多數(shù)活細(xì)胞中，線粒體在細(xì)胞代謝中扮演著重要的角色，它的主要功能是提供細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)代謝所需要的能量。因此，研究線粒體內(nèi)外膜，呼吸鏈酶及線粒體DNA等成分的結(jié)構(gòu)、功能及理化性質(zhì)已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要課題，而提取有活性的線粒體則是這些研究的基礎(chǔ)。
[0003]目前提取線粒體的方法很多，包括蔗糖密度梯度離心法、差速離心法和試劑盒提取方法。蔗糖密度梯度離心法屬于傳統(tǒng)方法，該法成本低，但是費時費力，而且需要超速低溫離心機(jī)，而提取線粒體的試劑盒價格比較昂貴。差速離心法只適用于釀酒酵母線粒體的提取，用于土生隱球酵母提取時，對細(xì)胞破壁比較困難，原生質(zhì)體得率低，進(jìn)一步導(dǎo)致無法得到線粒體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種操作簡便快捷的方法，從土生隱球酵母細(xì)胞材料中提取高質(zhì)量的、活性強(qiáng)的線粒體，適用于實驗應(yīng)用。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的操作步驟為:
(1)將GM(葡萄糖培養(yǎng)基)或者YPD (酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)生長期的土生隱球酵母離心收集菌體，用pH 7.5的0.05mol/L Tris緩沖液洗滌三遍，然后加入預(yù)處理緩沖液，在25-30°C下，100-200 rpm搖60-120 min ；
(2)將上述溶液離心棄去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗兩次，然后離心收集沉淀；
(3)向沉淀中加入酶解緩沖液，混勻后在溫度為28-36°C，轉(zhuǎn)速100-200 rpm條件下處理2-6 h，取樣在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形成情況，取樣的多少依據(jù)菌體量多少來定，使形成的原生質(zhì)體在顯微鏡下不重疊為準(zhǔn)；
(4)在顯微鏡下觀察到大部分菌體都破壁形成了原生質(zhì)體后，離心去掉酶解緩沖液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生質(zhì)體裂解液，混勻，然后加入5倍體積的玻璃珠渦旋振蕩10-30 min,取樣在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體破碎情況；
(5)于4°C, 1200-1800 g離心10 min去沉淀，用原生質(zhì)體裂解液重復(fù)洗滌2_3次，每次均棄去沉淀收集上清溶液，將所得上清液在4 °C, 12000-20000 g離心20 min收集沉淀；
(6)加入線粒體洗滌緩沖液，在4°C, 1200-1800 g離心10 min去沉淀；
(7)將上述上清液在4°C, 12000-20000 g離心20 min后收集沉淀，所得沉淀即為線粒體，
加入線粒體洗滌緩沖液懸浮線粒體；
(8)將線粒體懸浮液與詹納斯綠B應(yīng)用液按1:1比例混勻，室溫染色15 min后顯微鏡檢下觀察，線粒體為藍(lán)綠色，呈橢圓形或卵圓形顆粒狀。
[0006]本發(fā)明中所述預(yù)處理緩沖液為pH8.0，含2mmol/L -0.lmol/L EDTA、0.5-1% β-巰基乙醇的0.01mol/L PBS溶液。
[0007]本發(fā)明中所述酶解緩沖液為ρΗ7.4，含20-60 mg/mL蝸牛酶，2-5 mg/mL纖維素酶、0.35mol/L -0.9mol/L 山梨醇的 0.01mol/L PBS 溶液。
[0008]本發(fā)明中所述原生質(zhì)體裂解液為pH7.5,含10mmol/L Tris_HCl、2mmol/L-0.lmol/L EDTA、0.35mol/L -0.9mol/L 山梨醇的 0.01mol/L PBS 溶液。
[0009]本發(fā)明中所述線粒體洗滌緩沖液為pH7.5含10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L-0.lmol/L EDTA、0.35mol/L -0.9mol/L 山梨醇的 0.01mol/L PBS 溶液。
[0010]1%詹納斯綠B母液:取50mg詹納斯綠B粉末溶解于5mL R1ger溶液(NaCl0.85g，KCl 0.25g, CaCl2 0.03g，用去離子水定容至10mL)，稍加熱(30~40°C )溶解，過濾，即得。
[0011 ] 詹納斯綠B應(yīng)用液:取1%詹納斯綠B母液lmL，加入49mL R1ger溶液，混勻即得，現(xiàn)配現(xiàn)用；
上述配制緩沖液的PBS均為0.01mol/L的I XPBS溶液。
[0012]IXPBS (0.01mol/L):NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4.12H20 3.62g, KH2PO4 0.24g,ddH20 1L，pH 調(diào)到 7.4。
[0013]本發(fā)明方法的優(yōu)點是:簡單、方便快捷、經(jīng)濟(jì)、易于操作。與其他方法相比，該方法提取的土生隱球酵母線粒體得率高、質(zhì)量好并且具有高的活性；本方法對現(xiàn)有差速離心法的操作步驟、提取緩沖液的組分和配制方法進(jìn)行改良，延長菌體預(yù)處理時間，期間不斷震蕩；在酶解破壁步驟中，改良酶解緩沖液的組分，增加蝸牛酶的用量同時添加纖維素酶，延長酶解破壁的時間和孵育溫度，使菌體破壁徹底，增加原生質(zhì)體的得率；為了原生質(zhì)體裂解溫和不至于破壞線粒體，原生質(zhì)體裂解液和線粒體洗滌緩沖液均用PBS配制。用該方法可以提取到高質(zhì)量的線粒體，其結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)沒有被破壞，具有活性。該方法提取到的線粒體可以用于以線粒體為研究對象的生理生化研究。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明土生隱球酵母細(xì)胞破壁后原生質(zhì)體形成的顯微鏡觀察圖，其中A為未破壁的土生隱球酵母細(xì)胞；B為破壁后形成的原生質(zhì)體；
圖2為本發(fā)明裂解后的原生質(zhì)體的顯微鏡觀察圖；
圖3為本發(fā)明染色后的線粒體的顯微鏡觀察圖。

【具體實施方式】
[0015]下面通過附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，本實施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0016]實施例1:
本實施例利用從云南保山茶園酸性土壤中分離到的一株土生隱球酵母菌(Cryp tococcus humi)BSLL 1-1菌株,通過本發(fā)明方法,獲得了高質(zhì)量的有活性的線粒體，具體操作如下:
(1)將GM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)生長期的土生隱球酵母離心收集菌體，用pH7.5的0.05mol/L Tris緩沖液洗滌三遍，然后加入預(yù)處理緩沖液(ρΗ8.0含0.lmol/L EDTA、1%β-巰基乙醇的0.01mol/L PBS溶液)，搖勻，在28°C下，100 rpm搖90 min ；
(2)將上述溶液5000rpm離心5 min，棄去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗兩次，然后5000 rpm離心5min,收集沉淀；
(3)向沉淀中加入酶解緩沖液(pH7.4含40 mg/mL蝸牛酶，4 mg/mL纖維素酶、0.9mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液，蝸牛酶和纖維素酶均購于上海楷洋生物技術(shù)有限公司)，混勻后在溫度為32 V，轉(zhuǎn)速160rpm條件下處理4h，取樣在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形成情況；
該步驟為獲得高得率線粒體的關(guān)鍵步驟，如果細(xì)胞破壁不徹底，那么原生質(zhì)體得率不高，則最后就無法得到線粒體。結(jié)果通過顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌體細(xì)胞破壁比較徹底，破壁的原生質(zhì)體細(xì)胞呈圓形(圖1B)，而沒有經(jīng)過破壁的對照細(xì)胞則呈橢圓形(圖1A)，原生質(zhì)體得率達(dá)到98% ；
(4)在顯微鏡下觀察到大部分菌體都破壁形成了原生質(zhì)體后,5000rpm離心5 min,去掉酶解緩沖液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生質(zhì)體裂解液(pH7.5含1mmol/L Tris-HCl、5mmol/L EDTA、0.35mol/L 山梨醇的 0.01mol/L PBS 溶液)，混勻，然后加入 5 倍體積的玻璃珠渦旋振蕩15 min，取樣在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體破碎情況，結(jié)果如圖2所示，大部分原生質(zhì)體均已經(jīng)裂解破碎，原生質(zhì)體裂解充分也是獲得線粒體的前提；
(5)于4°C, 1500 g離心10 min去沉淀，用原生質(zhì)體裂解液洗滌2次，每次均棄去沉淀收集上清溶液，將所得上清液在4 °C,18000g離心20 min收集沉淀；
(6)加入線粒體洗滌緩沖液(ρΗ7.5含 10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA、0.5mol/L 山梨醇的0.01mol/L PBS溶液)，在4 °C，1500 g離心10 min去沉淀；
(7)將上述上清液在4°C, 18000 g離心20 min后收集沉淀，所得沉淀即為線粒體，加入線粒體洗滌緩沖液懸浮線粒體；
(8)將線粒體懸浮液與詹納斯綠B應(yīng)用液按1:1比例混勻，詹納斯綠B可專一性地對線粒體進(jìn)行活體染色，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))，呈藍(lán)綠色；室溫染色15 min后顯微鏡檢下觀察，結(jié)果如圖3所示，線粒體為藍(lán)綠色，呈橢圓形或卵圓形顆粒狀，說明提取的線粒體具有活性。
[0017]實施例2:利用從云南保山茶園酸性土壤中分離到的一株土生隱球酵母菌(Cryp tococcus humi)BSLL 1-1菌株,通過本發(fā)明方法,獲得了高質(zhì)量的有活性的線粒體，具體操作如下:
(1)將GM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)生長期的土生隱球酵母離心收集菌體，用pH7.5的0.05mol/L Tris緩沖液洗滌三遍，然后加入預(yù)處理緩沖液(pH8.0含1mmoI/L EDTA、0.5%β-巰基乙醇的0.01mol/L PBS溶液)，搖勻，在25°C下，150rpm搖120 min ；
(2)將上述溶液1000rpm離心4min，棄去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗兩次，然后1000rpm離心4min,收集沉淀；
(3)向沉淀中加入酶解緩沖液(pH7.4含60 mg/mL蝸牛酶，2 mg/mL纖維素酶、0.35mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液，蝸牛酶和纖維素酶均購于上?？笊锛夹g(shù)有限公司)，混勻后在溫度為28 V，轉(zhuǎn)速200rpm條件下處理2h，取樣在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形成情況；
該步驟為獲得高得率線粒體的關(guān)鍵步驟，如果細(xì)胞破壁不徹底，那么原生質(zhì)體得率不高，則最后就無法得到線粒體。結(jié)果通過顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌體細(xì)胞破壁比較徹底，破壁的原生質(zhì)體細(xì)胞呈圓形，而沒有經(jīng)過破壁的對照細(xì)胞則呈橢圓形，原生質(zhì)體得率達(dá)到60% ；
(4)在顯微鏡下觀察到大部分菌體都破壁形成了原生質(zhì)體后，1000rpm離心4min，去掉酶解緩沖液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生質(zhì)體裂解液(pH7.5含1mmol/L Tris-HCU0.lmol/L EDTA、0.5mol/L 山梨醇的 0.01mol/L PBS 溶液)，混勻，然后加入 5 倍體積的玻璃珠潤旋振蕩10 min,取樣在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體破碎情況,大部分原生質(zhì)體均已經(jīng)裂解破碎，原生質(zhì)體裂解充分也是獲得線粒體的前提；
(5)于4°C,1800 g離心10 min去沉淀，用原生質(zhì)體裂解液洗滌2次，每次均棄去沉淀收集上清溶液，將所得上清液在4 °C,15000g離心20 min收集沉淀；
(6)加入線粒體洗滌緩沖液(ρΗ7.5 含 10mmol/L Tris-HCl.0.lmol/L EDTA.0.35mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液)，在4 °C, 1200 g離心10 min去沉淀；
(7)將上述上清液在4°C, 15000 g離心20 min后收集沉淀，所得沉淀即為線粒體，加入線粒體洗滌緩沖液懸浮線粒體；
(8)將線粒體懸浮液與詹納斯綠B應(yīng)用液按1:1比例混勻，詹納斯綠B可專一性地對線粒體進(jìn)行活體染色，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))，呈藍(lán)綠色；室溫染色15 min后顯微鏡檢下觀察，線粒體為藍(lán)綠色，呈橢圓形或卵圓形顆粒狀， 說明提取的線粒體具有活性。
[0018]實施例3:利用從云南保山茶園酸性土壤中分離到的一株土生隱球酵母菌(Cryp tococcus humi)BSLL 1-1菌株,通過本發(fā)明方法,獲得了高質(zhì)量的有活性的線粒體，具體操作如下:
(1)將YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)生長期的土生隱球酵母離心收集菌體，用pH7.5的0.05mol/L Tris緩沖液洗滌三遍，然后加入預(yù)處理緩沖液(pH8.0含50mmol/L EDTA,
0.8% β-巰基乙醇的 0.01mol/L PBS 溶液)，搖勻，在 30°C下，200rpm 搖 60 min ；
(2)將上述溶液8000rpm離心3min，棄去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗兩次，然后8000rpm離心3min,收集沉淀；
(3)向沉淀中加入酶解緩沖液(pH7.4含20 mg/mL蝸牛酶，5 mg/mL纖維素酶、0.5mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液，蝸牛酶和纖維素酶均購于上海楷洋生物技術(shù)有限公司)，混勻后在溫度為36 °C ,轉(zhuǎn)速10rpm條件下處理6h,取樣在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形成情況；
該步驟為獲得高得率線粒體的關(guān)鍵步驟，如果細(xì)胞破壁不徹底，那么原生質(zhì)體得率不高，則最后就無法得到線粒體。結(jié)果通過顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌體細(xì)胞破壁比較徹底，破壁的原生質(zhì)體細(xì)胞呈圓形，而沒有經(jīng)過破壁的對照細(xì)胞則呈橢圓形，原生質(zhì)體得率達(dá)到65% ；
(4)在顯微鏡下觀察到大部分菌體都破壁形成了原生質(zhì)體后，8000rpm離心3min，去掉酶解緩沖液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生質(zhì)體裂解液(pH7.5含lOmmol/LTris-HCl,50mmol/L EDTA、0.9mol/L 山梨醇的 0.01mol/L PBS溶液)，混勻，然后加入 5 倍體積的玻璃珠潤旋振蕩30min,取樣在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體破碎情況,大部分原生質(zhì)體均已經(jīng)裂解破碎，原生質(zhì)體裂解充分也是獲得線粒體的前提；
(5)于4°C, 1200 g離心10 min去沉淀，用原生質(zhì)體裂解液洗滌3次，每次均棄去沉淀收集上清溶液，將所得上清液在4 V，20000g離心20 min收集沉淀；
(6)加入線粒體洗滌緩沖液(ρΗ7.5 含 10mmol/L Tris-HCl、0.05mol/L EDTA、0.9mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液)，在4 °C，1800 g離心10 min去沉淀；
(7)將上述上清液在4°C, 20000 g離心20 min后收集沉淀，所得沉淀即為線粒體，加入線粒體洗滌緩沖液懸浮線粒體；
(8)將線粒體懸浮液與詹納斯綠B應(yīng)用液按1:1比例混勻，詹納斯綠B可專一性地對線粒體進(jìn)行活體染色，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))，呈藍(lán)綠色；室溫染色15 min后顯微鏡檢下觀察，線粒體為藍(lán)綠色，呈橢圓形或卵圓形顆粒狀，說明提取的線粒體具有活性。
[0019]實施例4:利用從云南保山茶園酸性土壤中分離到的一株土生隱球酵母菌(Cryp tococcus humi)BSLL 1-1菌株,通過本發(fā)明方法,獲得了高質(zhì)量的有活性的線粒體，具體操作如下:
(1)將YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)生長期的土生隱球酵母離心收集菌體，用pH7.5的0.05mol/L Tris緩沖液洗滌三遍，然后加入預(yù)處理緩沖液(pH8.0含2mmol/L EDTA、0.6%β-巰基乙醇的0.01mol/L PBS溶液)，搖勻，在26°C下，180rpm搖80 min ；
(2)將上述溶液7000rpm離心4min，棄去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗兩次，然后7000rpm離心4min,收集沉淀；
(3)向沉淀中加入酶解緩沖液(pH7.4含30 mg/mL蝸牛酶，3 mg/mL纖維素酶、0.6mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液，蝸牛酶和纖維素酶均購于上?？笊锛夹g(shù)有限公司)，混勻后在溫度為30 °C ,轉(zhuǎn)速150rpm條件下處理5h,取樣在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形成情況；
該步驟為獲得高得率線粒體的關(guān)鍵步驟，如果細(xì)胞破壁不徹底，那么原生質(zhì)體得率不高，則最后就無法得到線粒體。結(jié)果通過顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌體細(xì)胞破壁比較徹底，破壁的原生質(zhì)體細(xì)胞呈圓形，而沒有經(jīng)過破壁的對照細(xì)胞則呈橢圓形，原生質(zhì)體得率達(dá)到80% ；
(4)在顯微鏡下觀察到大部分菌體都破壁形成了原生質(zhì)體后，12000rpm離心4min，去掉酶解緩沖液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生質(zhì)體裂解液(pH7.5含1mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA、0.7mol/L 山梨醇的 0.01mol/L PBS 溶液)，混勻，然后加入 5 倍體積的玻璃珠渦旋振蕩20 min，取樣在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體破碎情況，大部分原生質(zhì)體均已經(jīng)裂解破碎，原生質(zhì)體裂解充分也是獲得線粒體的前提；
(5)于4°C,1600 g離心10 min去沉淀，用原生質(zhì)體裂解液洗滌3次，每次均棄去沉淀收集上清溶液，將所得上清液在4 °C,16000g離心20 min收集沉淀；
(6)加入線粒體洗滌緩沖液(pH7.5 含 10mmol/L Tris-HClUO mmol/L EDTA、0.6mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液)，在4 °C, 1600 g離心10 min去沉淀；
(7)將上述上清液在4°C, 12000 g離心20 min后收集沉淀，所得沉淀即為線粒體，加入線粒體洗滌緩沖液懸浮線粒體；
(8)將線粒體懸浮液與詹納斯綠B應(yīng)用液按1:1比例混勻，詹納斯綠B可專一性地對線粒體進(jìn)行活體染色，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))，呈藍(lán)綠色；室溫染色15 min后顯微鏡檢下觀察，線粒體為藍(lán)綠色，呈橢圓形或卵圓形顆粒狀，說明提取的線粒體具有活性。
【權(quán)利要求】
1.一種提取土生隱球酵母線粒體的方法，其特征在于按以下操作進(jìn)行: (1)將GM或者YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)生長期的土生隱球酵母離心收集菌體，用pH 7.5的0.05mol/L Tris緩沖液洗滌三遍，然后加入預(yù)處理緩沖液，在25_30°C下，100-200 rpm 搖 60-120 min ； (2)將上述溶液離心棄去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗兩次，然后離心收集沉淀； (3)向沉淀中加入酶解緩沖液，混勻后在溫度為28-36°C，轉(zhuǎn)速100-200 rpm條件下處理2-6 h，取樣在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形成情況； (4)在顯微鏡下觀察到大部分菌體都破壁形成了原生質(zhì)體后，離心去掉酶解緩沖液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生質(zhì)體裂解液，混勻，然后加入5倍體積的玻璃珠渦旋振蕩10-30 min,取樣在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體破碎情況； (5)于4°C, 1200-1800 g離心10 min去沉淀，用原生質(zhì)體裂解液重復(fù)洗滌2_3次，每次均棄去沉淀收集上清液，將所得上清液在4 °C, 12000-20000 g離心20 min收集沉淀； (6)加入線粒體洗滌緩沖液，在4°C, 1200-1800 g離心10 min去沉淀； (7)將上述上清液在4°C, 12000-20000 g離心20 min后收集沉淀，所得沉淀即為線粒體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取土生隱球酵母線粒體的方法，其特征在于:預(yù)處理緩沖液為 ρΗ8.0 含 2mmol/L -0.lmol/L EDTA、0.5-1% β -巰基乙醇的 0.01mol/L PBS 溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取土生隱球酵母線粒體的方法，其特征在于:酶解緩沖液為 ρΗ7.4 含 20-60 mg/mL 蝸牛酶，2-5 mg/mL 纖維素酶、0.35mol/L _0.9mol/L 山梨醇的0.01mol/L PBS 溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取土生隱球酵母線粒體的方法，其特征在于:原生質(zhì)體裂解液為 ρΗ7.5 含 10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L -0.lmol/L EDTA、0.35mol/L -0.9mol/L 山梨醇的 0.01mol/L PBS 溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取土生隱球酵母線粒體的方法，其特征在于:線粒體洗滌緩沖液為 ρΗ7.5 含 1mmoI/L Tris-HCl、2mmol/L -0.lmol/L EDTA、0.35mol/L -0.9mol/L 山梨醇的0.01mol/L PBS溶液。
【文檔編號】C12R1/645GK104178431SQ201410307880
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】年洪娟, 李金金, 張晶晶, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學(xué)